应用PCR技术诊断乙型肝炎病毒宫内感染的研究
作者：李玉英 黄剑兰 张绍安
单位：广西扶绥县人民医院
关键词：乙肝病毒；HBV宫内感染；PCR；诊断
医学文选990607
【摘要】 目的 了解本地区乙型肝炎病毒(HBV)母婴传播的现状，评价PCR技术的应用价值。方法 用PCR技术对300例孕妇及其所生新生儿进行HBV DNA检测，并与传统的乙型肝炎标志物(HBVM)检测结果相对照。结果 孕妇HBsAg感染率为16.67%，孕妇HBV DNA阳性率19.33%，孕妇HBV DNA阳性者，其新生儿HBV感染率为60.34%。结论 本地区孕妇HBV感染率及新生儿HBV感染率均高于国内报道。PCR技术用于诊断HBV宫内感染具有简便、快捷、可靠的优点。
我国是乙肝病毒感染高发区，而我县是与乙肝感染关系密切的肝癌高发区。乙型肝炎病毒母婴传播早已得到证实，而HBV宫内感染是HBV母婴传播的重要途径。由于受检测方法等因素的限制，有关HBV宫内感染的发生率报道差异较大。为此我们采用敏感、特异的聚合酶反应技术(PCR)检测300例孕妇静脉血和新生儿脐血HBV DNA，并与乙肝病毒标志物(HBVM)检测结果对比，以探讨乙肝高发区HBV宫内感染的规律和感染率，为预防保健部门提供参考。
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1 材料和方法
1.1 研究对象 300对病例均为1999年元月至1999年10月在我院行产前检查并住院正常分娩的孕产妇及其新生儿。产妇平均年龄25.6岁。256例来自农村，44例来自城镇。
1.2 标本采集 所有孕妇于产前检查时常规做HBsAg检测，对其中HBsAg阳性的孕妇加做乙肝两对半检测。分娩前全部孕妇均采静脉血5ml，分离血清保存于-20℃冰箱内待检HBV DNA。所有新生儿均于分娩时采脐血5ml，分离血清后保存于-20℃冰箱内待检HBV DNA。为避免母血污染，采脐血时先用生理盐水纱布擦净脐带表面的血迹，再用2%碘酒及75%酒精消毒后用无菌注射器抽血。并同时采脐血做HBsAg检测。
1.3 检测方法
1.3.1 血清HBV DNA的检测 采用PCR法，药盒购自上海复星高科技集团有限公司，PCR扩增仪为美国产MJ型PCR扩增仪。检测方法：血清经裂解后获取DNA扩增模板，在特异性HBVS基因引物(由上海复星高科技集团有限公司合成)、4×dMTP、TaqDNA聚合酶(上海复星高科技集团有限公司产品)等作用下，依变性、退火、延伸顺序用DNA热循环仪反复循环35次，最后一个循环72℃延伸反应5分钟，反应产物经凝胶电泳，显示314bpDNA片段带为阳性，每次实验均设阳性和阴性对照，所有试管、吸头和离心管均为一次性使用，以避免出现假阳性。
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1.3.2 HBVM检测 采用ELISA法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，药盒购自上海科华实业公司，操作按说明。
1.4 统计学方法 χ2检验
2 结 果
2.1 孕妇血HBV DNA及HBVM的检测 300例孕妇均进行了HBsAg检测，检出HBsAg阳性49例，阳性率16.67%，对49例阳性者还进行了其他乙肝标志物的检测，其中HBeAg阳性13例，抗-HBc阳性18例，所有的孕妇亦全部检测血HBV DNA，检出58例HBV DNA阳性，其中49例HBsAg阳性者合并HBV DNA阳性有40例，阳性率81.63%，251例HBsAg阴性者检出18例HBV DNA阳性，阳性率7.17%。
2.2 HBV母婴宫内感染 外周血HBV DNA阴性孕妇242例，新生儿脐血HBV DNA全部为阴性。而58例HBV DNA阳性孕妇所生新生儿脐血HBV DNA有35例阳性，检出率60.34%，两者比较P<0.01，差异有非常显著性。58例HBV DNA(+)者脐血感染情况见表1。
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表1 母血与脐血HBV DNA阳性的关系 母 血
母例数
脐血HBV DNA(+)数
阳性率(%)
HBsAg(+)+HBeAg(+)+HBV DNA(+)
13
13
100
HBeAg(+)+HBV DNA(+)
3
2
66.67
, 百拇医药
HBeAg(+)+HBeAb(+)+HBV DNA(+)
2
2
100
HBsAg(+)+HBV DNA(+)
27
15
55.56
HBsAg(-)+HBV DNA(+)
13
3
23.28
, 百拇医药
合 计
58
35
60.34
2.3 HBsAg阳性的49例孕妇所分娩的新生儿脐血HBV DNA阳性有28例，阳性率57.14%；251例HBsAg阴性母亲所生新生儿脐血HBV DNA(+)有7例，阳性率2.79%。两者相比，P<0.01，差异有非常显著性。
2.4 49例HBsAg阳性孕妇血中，有13例HBeAg阳性，其婴儿脐血HBV DNA全部阳性，而36例HBeAg阴性者所生婴儿脐血中检出HBV DNA阳性15例，阳性率41.67%，两者对比有非常显著性差异(P<0.01)。
2.5 58例HBV DNA阳性母亲所生新生儿脐血检测结果，脐血HBV DNA阳性有35例，而脐血HBsAg阳性仅有13例，阳性主要分布于HBeAg阳性母亲所生新生儿中，阳性率分别为60.34%与22.41%，两者差异非常显著(P<0.01)。
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3 讨 论
3.1 孕妇HBV感染状况
3.1.1 我县是HBV感染高发区，人群中HBsAg阳性率达15%以上，高于国内5%～15%的报道[1]。本研究对象300例孕妇血HBsAg阳性有49例，阳性率16.67%，较接近于我区的报道[2]，这与我县的现状相符。
3.1.2 近年来，产前检查均要求检测HBsAg，并以HBsAg阳性来估计胎儿的宫内感染率，对HBsAg阳性母亲所生新生儿增加乙肝疫苗的剂量。近来有文献报道HBV宫内感染率与母血中的HBV DNA水平关系更为密切[3]。另有报道[4]母血中HBsAg(+)与HBV DNA(+)并不一致，HBsAg阳性同时合并HBeAg阳性，HBV DNA阳性率高，而单纯HBsAg(+)、HBV DNA阳性率较低，某些HBsAg阴性而HBeAg阳性或其他乙肝标志物阳性者其血中HBV DNA也可阳性。而HBV DNA(+)是病毒复制的特征，提示病人具有传染性。本研究49例HBsAg阳性孕妇HBV DNA阳性者40例，阳性率81.63%，而251例HBsAg阴性孕妇血中也有18例HBV DNA(+)，阳性率7.17%。由此提醒我们，对于HBsAg阴性的孕妇最好也要检测其乙肝标志物或HBV DNA，以指导新生儿的预防方案。
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3.2 HBV宫内感染率及相关因素
3.2.1 HBV宫内感染的诊断 七十年代有人开始在脐血中检出HBsAg，以后一直以脐血HBsAg阳性作为宫内感染的指标[5]。目前普遍认为，以循环血中HBV DNA水平判断宫内感染比血清学更可靠，其原因可能为：肝细胞未充分发育，HBsAg低水平表达；胎儿免疫系统尚未充分成熟，对HBV无或低反应等[6]。本研究58例HBV DNA阳性母亲所生婴儿脐血HBV DNA阳性率则明显高于脐血HBsAg阳性率，也证实了这一观点的正确。本研究中宫内感染的诊断以脐血HBV DNA阳性为准。
3.2.2 影响HBV宫内感染的相关因素 我国是HBV感染高发区，但对宫内感染率的研究目前尚无一致的结果。国内外文献报告活产新生儿宫内感染率为9.1%～36.7%[6]。一般认为母血HBsAg滴度、HBeAg阳性率和HBV DNA水平与宫内感染有关。本研究58例HBV DNA阳性者所生新生儿脐血有HBV DNA阳性35例，感染率60.34%，高于国内报道，可能与本县为HBV高发区有关。也说明了以母血HBV DNA判断宫内感染的重要性。
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许多研究表明，HBsAg和HBeAg同时阳性的孕妇体内均有HBV复制，传染性强，且极易发生母婴传播。母亲HBsAg(+)和HBV DNA阳性是母婴传播的两个主要指标。亦有作者认为：HBV DNA在血循环中的水平作母婴传播的标志更可靠。本文研究表明，58例HBV DNA阳性母亲所生婴儿中35例HBV DNA亦阳性，而13例HBsAg和HBeAg同时阳性者，婴儿HBV DNA全部阳性，说明HBeAg作为母婴传播指标的重要性。我们认为，在不具备检测HBV DNA的条件下，检测HBeAg不失为判断HBV宫内感染的重要手段。
3.3 PCR技术的评价 HBV DNA是反映HBV复制最直接而特异的指标，而PCR技术是目前检测HBV DNA最特异而简便的方法。很多研究证明，PCR检测HBV DNA其灵敏度较传统的印迹杂交高103～104倍，传统印迹杂交法能检测HBV DNA0.1Pg/ml，而PCR技术则能检测HBV的量为10fg/ml。本文结果显示，孕妇血中HBV DNA检出率明显高于资料所示其它乙肝标志物的检测结果。同时，脐血HBV DNA检出率远较其他方法的检出率高。因此我们认为，PCR技术是预测及诊断HBV母婴传播最直接、快速且可靠的方法。
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参考文献
1 姚珍薇，吴味辛.妊娠合并病毒性肝炎.实用妇产科杂志，1999，15(4)：185
2 黄华艺，周培慰，李 澄，等.1343例孕妇乙肝病毒感染情况分析.右江民族医学院学报，1996，(4)：543
3 刘忠华，德德忠，闫永平，等.孕妇血清中乙型肝炎病毒DNA含量与胎儿宫内感染的关系.中华妇产科杂志，1999，34(3)：133～134
4 李 红，杨伟文，孙希琰，等.乙型肝炎病毒产前传播的临床研究.实用妇产科杂志，1995，11(2)：86～87
5 钱小虎，闻良珍，马庭元，等.分子杂交技术监测孕期乙肝病毒的母婴传播.中华妇产科杂志，1995，30(7)：423
6 唐加敏，范冰梅，王宪华，等.乙型肝炎病毒宫内感染的研究进展.实用妇产科杂志，1998，14(1)：19～21
7 于广军，朱启熔.乙型肝炎病毒母婴传播及其免疫与预防的研究进展.国外医学流行病学传染病学分册，1999，23(4)：161, http://www.100md.com
单位：广西扶绥县人民医院
关键词：乙肝病毒；HBV宫内感染；PCR；诊断
医学文选990607
【摘要】 目的 了解本地区乙型肝炎病毒(HBV)母婴传播的现状，评价PCR技术的应用价值。方法 用PCR技术对300例孕妇及其所生新生儿进行HBV DNA检测，并与传统的乙型肝炎标志物(HBVM)检测结果相对照。结果 孕妇HBsAg感染率为16.67%，孕妇HBV DNA阳性率19.33%，孕妇HBV DNA阳性者，其新生儿HBV感染率为60.34%。结论 本地区孕妇HBV感染率及新生儿HBV感染率均高于国内报道。PCR技术用于诊断HBV宫内感染具有简便、快捷、可靠的优点。
我国是乙肝病毒感染高发区，而我县是与乙肝感染关系密切的肝癌高发区。乙型肝炎病毒母婴传播早已得到证实，而HBV宫内感染是HBV母婴传播的重要途径。由于受检测方法等因素的限制，有关HBV宫内感染的发生率报道差异较大。为此我们采用敏感、特异的聚合酶反应技术(PCR)检测300例孕妇静脉血和新生儿脐血HBV DNA，并与乙肝病毒标志物(HBVM)检测结果对比，以探讨乙肝高发区HBV宫内感染的规律和感染率，为预防保健部门提供参考。
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1 材料和方法
1.1 研究对象 300对病例均为1999年元月至1999年10月在我院行产前检查并住院正常分娩的孕产妇及其新生儿。产妇平均年龄25.6岁。256例来自农村，44例来自城镇。
1.2 标本采集 所有孕妇于产前检查时常规做HBsAg检测，对其中HBsAg阳性的孕妇加做乙肝两对半检测。分娩前全部孕妇均采静脉血5ml，分离血清保存于-20℃冰箱内待检HBV DNA。所有新生儿均于分娩时采脐血5ml，分离血清后保存于-20℃冰箱内待检HBV DNA。为避免母血污染，采脐血时先用生理盐水纱布擦净脐带表面的血迹，再用2%碘酒及75%酒精消毒后用无菌注射器抽血。并同时采脐血做HBsAg检测。
1.3 检测方法
1.3.1 血清HBV DNA的检测 采用PCR法，药盒购自上海复星高科技集团有限公司，PCR扩增仪为美国产MJ型PCR扩增仪。检测方法：血清经裂解后获取DNA扩增模板，在特异性HBVS基因引物(由上海复星高科技集团有限公司合成)、4×dMTP、TaqDNA聚合酶(上海复星高科技集团有限公司产品)等作用下，依变性、退火、延伸顺序用DNA热循环仪反复循环35次，最后一个循环72℃延伸反应5分钟，反应产物经凝胶电泳，显示314bpDNA片段带为阳性，每次实验均设阳性和阴性对照，所有试管、吸头和离心管均为一次性使用，以避免出现假阳性。
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1.3.2 HBVM检测 采用ELISA法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，药盒购自上海科华实业公司，操作按说明。
1.4 统计学方法 χ2检验
2 结 果
2.1 孕妇血HBV DNA及HBVM的检测 300例孕妇均进行了HBsAg检测，检出HBsAg阳性49例，阳性率16.67%，对49例阳性者还进行了其他乙肝标志物的检测，其中HBeAg阳性13例，抗-HBc阳性18例，所有的孕妇亦全部检测血HBV DNA，检出58例HBV DNA阳性，其中49例HBsAg阳性者合并HBV DNA阳性有40例，阳性率81.63%，251例HBsAg阴性者检出18例HBV DNA阳性，阳性率7.17%。
2.2 HBV母婴宫内感染 外周血HBV DNA阴性孕妇242例，新生儿脐血HBV DNA全部为阴性。而58例HBV DNA阳性孕妇所生新生儿脐血HBV DNA有35例阳性，检出率60.34%，两者比较P<0.01，差异有非常显著性。58例HBV DNA(+)者脐血感染情况见表1。
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表1 母血与脐血HBV DNA阳性的关系 母 血
母例数
脐血HBV DNA(+)数
阳性率(%)
HBsAg(+)+HBeAg(+)+HBV DNA(+)
13
13
100
HBeAg(+)+HBV DNA(+)
3
2
66.67
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HBeAg(+)+HBeAb(+)+HBV DNA(+)
2
2
100
HBsAg(+)+HBV DNA(+)
27
15
55.56
HBsAg(-)+HBV DNA(+)
13
3
23.28
, 百拇医药
合 计
58
35
60.34
2.3 HBsAg阳性的49例孕妇所分娩的新生儿脐血HBV DNA阳性有28例，阳性率57.14%；251例HBsAg阴性母亲所生新生儿脐血HBV DNA(+)有7例，阳性率2.79%。两者相比，P<0.01，差异有非常显著性。
2.4 49例HBsAg阳性孕妇血中，有13例HBeAg阳性，其婴儿脐血HBV DNA全部阳性，而36例HBeAg阴性者所生婴儿脐血中检出HBV DNA阳性15例，阳性率41.67%，两者对比有非常显著性差异(P<0.01)。
2.5 58例HBV DNA阳性母亲所生新生儿脐血检测结果，脐血HBV DNA阳性有35例，而脐血HBsAg阳性仅有13例，阳性主要分布于HBeAg阳性母亲所生新生儿中，阳性率分别为60.34%与22.41%，两者差异非常显著(P<0.01)。
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3 讨 论
3.1 孕妇HBV感染状况
3.1.1 我县是HBV感染高发区，人群中HBsAg阳性率达15%以上，高于国内5%～15%的报道[1]。本研究对象300例孕妇血HBsAg阳性有49例，阳性率16.67%，较接近于我区的报道[2]，这与我县的现状相符。
3.1.2 近年来，产前检查均要求检测HBsAg，并以HBsAg阳性来估计胎儿的宫内感染率，对HBsAg阳性母亲所生新生儿增加乙肝疫苗的剂量。近来有文献报道HBV宫内感染率与母血中的HBV DNA水平关系更为密切[3]。另有报道[4]母血中HBsAg(+)与HBV DNA(+)并不一致，HBsAg阳性同时合并HBeAg阳性，HBV DNA阳性率高，而单纯HBsAg(+)、HBV DNA阳性率较低，某些HBsAg阴性而HBeAg阳性或其他乙肝标志物阳性者其血中HBV DNA也可阳性。而HBV DNA(+)是病毒复制的特征，提示病人具有传染性。本研究49例HBsAg阳性孕妇HBV DNA阳性者40例，阳性率81.63%，而251例HBsAg阴性孕妇血中也有18例HBV DNA(+)，阳性率7.17%。由此提醒我们，对于HBsAg阴性的孕妇最好也要检测其乙肝标志物或HBV DNA，以指导新生儿的预防方案。
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3.2 HBV宫内感染率及相关因素
3.2.1 HBV宫内感染的诊断 七十年代有人开始在脐血中检出HBsAg，以后一直以脐血HBsAg阳性作为宫内感染的指标[5]。目前普遍认为，以循环血中HBV DNA水平判断宫内感染比血清学更可靠，其原因可能为：肝细胞未充分发育，HBsAg低水平表达；胎儿免疫系统尚未充分成熟，对HBV无或低反应等[6]。本研究58例HBV DNA阳性母亲所生婴儿脐血HBV DNA阳性率则明显高于脐血HBsAg阳性率，也证实了这一观点的正确。本研究中宫内感染的诊断以脐血HBV DNA阳性为准。
3.2.2 影响HBV宫内感染的相关因素 我国是HBV感染高发区，但对宫内感染率的研究目前尚无一致的结果。国内外文献报告活产新生儿宫内感染率为9.1%～36.7%[6]。一般认为母血HBsAg滴度、HBeAg阳性率和HBV DNA水平与宫内感染有关。本研究58例HBV DNA阳性者所生新生儿脐血有HBV DNA阳性35例，感染率60.34%，高于国内报道，可能与本县为HBV高发区有关。也说明了以母血HBV DNA判断宫内感染的重要性。
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许多研究表明，HBsAg和HBeAg同时阳性的孕妇体内均有HBV复制，传染性强，且极易发生母婴传播。母亲HBsAg(+)和HBV DNA阳性是母婴传播的两个主要指标。亦有作者认为：HBV DNA在血循环中的水平作母婴传播的标志更可靠。本文研究表明，58例HBV DNA阳性母亲所生婴儿中35例HBV DNA亦阳性，而13例HBsAg和HBeAg同时阳性者，婴儿HBV DNA全部阳性，说明HBeAg作为母婴传播指标的重要性。我们认为，在不具备检测HBV DNA的条件下，检测HBeAg不失为判断HBV宫内感染的重要手段。
3.3 PCR技术的评价 HBV DNA是反映HBV复制最直接而特异的指标，而PCR技术是目前检测HBV DNA最特异而简便的方法。很多研究证明，PCR检测HBV DNA其灵敏度较传统的印迹杂交高103～104倍，传统印迹杂交法能检测HBV DNA0.1Pg/ml，而PCR技术则能检测HBV的量为10fg/ml。本文结果显示，孕妇血中HBV DNA检出率明显高于资料所示其它乙肝标志物的检测结果。同时，脐血HBV DNA检出率远较其他方法的检出率高。因此我们认为，PCR技术是预测及诊断HBV母婴传播最直接、快速且可靠的方法。
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参考文献
1 姚珍薇，吴味辛.妊娠合并病毒性肝炎.实用妇产科杂志，1999，15(4)：185
2 黄华艺，周培慰，李 澄，等.1343例孕妇乙肝病毒感染情况分析.右江民族医学院学报，1996，(4)：543
3 刘忠华，德德忠，闫永平，等.孕妇血清中乙型肝炎病毒DNA含量与胎儿宫内感染的关系.中华妇产科杂志，1999，34(3)：133～134
4 李 红，杨伟文，孙希琰，等.乙型肝炎病毒产前传播的临床研究.实用妇产科杂志，1995，11(2)：86～87
5 钱小虎，闻良珍，马庭元，等.分子杂交技术监测孕期乙肝病毒的母婴传播.中华妇产科杂志，1995，30(7)：423
6 唐加敏，范冰梅，王宪华，等.乙型肝炎病毒宫内感染的研究进展.实用妇产科杂志，1998，14(1)：19～21
7 于广军，朱启熔.乙型肝炎病毒母婴传播及其免疫与预防的研究进展.国外医学流行病学传染病学分册，1999，23(4)：161, http://www.100md.com