从多利到波来：用体细胞核转移克隆
作者：Darius Moradpour, Hubert E.Blum
单位：郝连杰 同济医科大学附属同济医院
关键词：
德国医学/990622 Dolly,Polly et al.:
Klonieren durch somatischen Zellkerntransfer
绵羊多利(Dolly)是第一只从成年动物成熟体细胞克隆出来的哺乳动物，这一研究一方面向基础生物发生学原则提出了挑战；另一方面为生殖生物学、医学以及制药学等的基础研究和应用开创了全新的前景。因此，用体细胞核转移克隆的技术具有巨大潜在意义。同时，它也提出了伦理问题，不仅在专业领域，而且在社会上引起广泛的讨论。
自然繁殖-转基因动物-多利
, 百拇医药
多利的特点是什么自然繁殖是通过减数分裂形成单倍体种子细胞，在受精时单倍体精子和单倍体卵细胞融合成二倍体细胞，再经过分裂和分化发展成一新生机体，在此过程中父母双方遗传物质出现重组和重新分配。转基因技术是现代分子遗传学研究常用的标准技术，方法是在受精卵细胞的原核注入需要的基因DNA片段(转基因)。这段基因被整合到基因组内，成为每个体细胞基因组的一部分，继续遗传给后代。机体在发育成熟过程中，按转基因相关启动子的活性和其细胞或组织特异性，转入的基因将在所期望的组织内得到表达。
绵羊多利却是通过另一个崭新的处理方法——体细胞核转移获得的，这方法是从二倍体体细胞取出细胞核，接种于预先去除细胞核的卵细胞内。用作体细胞核转移的细胞核可以取自胚胎组织，或者——例如多利——甚至取自成年动物已经分化的体细胞，再转移到预先去核的卵细胞内。这是非常令人注目的事，因为传统生物学发生一直认为只有未分化的全能细胞方才具有发育成不同细胞和组织的能力，最终发育成完整的机体。多利和最近克隆出的小鼠Cumulina却表明在适当的实验条件下，成熟的体细胞也有可能返祖，重新再活化其全部原始发生能力。然而，现在仍不清楚，哪一种细胞或者组织类型，何种年龄以及细胞周期的哪一阶段最适合体细胞转移。
, 百拇医药
克隆的特征是无性繁殖遗传性相同的机体。克隆化在植物繁殖已经有上千年的历史，在动物繁殖(分裂胚胎，split embryos)业已进行了10多年。体细胞核转移技术早在50年代已在青蛙、80年代在哺乳动物进行了研究。直到1996年才首次成功的将体外培养液中保存数月的胚胎细胞克隆出小羔羊。因此，也为作体细胞转移前进行改变遗传性在理论上提供了可能性。绵羊多利是第一只从6岁绵羊的乳房细胞克隆出的动物，激起专业领域和社会公众极大的关注。因为从成年个体可以产生无数遗传上相似的拷贝，成为理论上可实现的梦想，但是由于技术方法上的限制，进一步推广应用这种克隆技术仍很困难。而且，必须认识到体细胞转移产生的克隆遗传性并不完全一致，因为线粒体DNA总是来自母方的卵细胞，而且宫内因素和产后发育对原型也起着决定性影响。
从多利到波来(Polly)等等
1997年绵羊波来的诞生是基因技术的进一步突破，用于克隆化的细胞核是预先在体外经人类IX因子基因转导过的胚胎纤维母细胞，在一乳腺特异性启动子——β乳球蛋白-启动子的控制下引入IX因子基因。在体外选出具有此结构稳定的转染细胞，分离出细胞核，再转移到去核的卵细胞内。遗传性修饰过的细胞核所产生的波来在乳腺特异性β乳球蛋白-启动子的控制下，它的乳汁内人类IX因子的含量可达40g/l。从而，使人们从理论上认识到可以用相对低廉的代价，制备出大量极有价值的纯化产品，而且没有传播HIV和丙型肝炎病毒的危险，用于B型血友病作替代治疗。波来可以继续用常规的方法繁殖，以它作为母畜繁殖出一大群能产生IX因子的绵羊。与制备原核注射转基因动物相比较，在体外培养中选择细胞更为容易，基因修饰更为精确。而且，通过体细胞核转移制备转基因动物比常规原核注射方法只需要用少量动物。最后，理论上不仅可以引入异己的基因，而且还可以去除某种基因，或者修饰某种基因。根据胚胎干细胞提供的可能性，这些方法已在小鼠进行。
, 百拇医药
紧接着最近数月发表了另一些关于克隆牛犊和小鼠的报道(表1)。现在成功地将成熟卵巢细胞、载卵丘细胞(Cumulus-Zellen)核转移给去核卵细胞，产生另一小鼠克隆，这只小鼠可通过体细胞转移再克隆，因此最后产生的小鼠与其“双亲”、“祖父母”和“曾祖父母”遗传性完全相似。体细胞核转移克隆技术也可在小鼠进行，能很好地做生物学鉴定，并且复制周期较短，特别为基础研究展现了全新的前景。
表1 通过体细胞转移克隆 动 物
特 点
文 献
Megan和Morag
绵羊来自培养的胚胎细胞
Campbell et al.,Nature380(1996)，64-66.
, 百拇医药
Dolly→Bonnie
绵羊来自成年绵羊乳房细胞
Wilmut et al.,Nature385(1997),810-813.
Polly和Molly
绵羊来自人IX因子转导的
Schieke et al.,Science278(1997),2130-2133.
胚胎纤维母细胞
ACT-3,-4,-5
牛犊来自基因修饰的胚胎纤
Cibelli et al.,Science280(1998),1256-1258.
, 百拇医药
维母细胞
Cumulina和其克隆
小鼠来自卵巢的载卵丘细胞
Wakayama et al.,Nature394(1998),369-374.
应用的可能性和问题
表2列出新克隆技术应用的潜在可能性。如上所述，通过体细胞转移可以产生农业上有用的家畜，这些家畜的乳汁能产生对人类疾病诊断、治疗或者预防上重要的人体蛋白质，例如：凝血因子、白蛋白、α1抗胰蛋白酶等。乳制品蛋白质成分可能对一些人不能耐受或引起过敏反应，有关动物蛋白质可以用相应的人体蛋白质基因替换。在异种移植的领域内，例如猪供体器官可以改变其遗传性，使其能被受体的免疫和补体系统更好地耐受。克隆技术和从中获得的关于细胞分化的新认识也对于细胞和组织的治疗具有重要价值，例如从克隆牛胚胎获得的有产生多巴胺能力的细胞，不久前在巴金森氏病动物的模型获得显著的治疗效果。最后，生物发生学、遗传学和肿瘤研究等临床重要的科学问题均可以用这种新技术实验分析研究。例如，如何改变一个细胞如何改变基因在一妇女如何灭活第2个X染色体如何再活化端粒(Telomere)有何作用
, http://www.100md.com
表2 体细胞核转移技术的应用 为人类疾病的诊断治疗和预防生产人体蛋白质
分子药物学(Nutriceuticals)
异种移植
细胞和组织治疗
基础研究
值得庆幸的是多利仍然很健康，通过自然途径产一幼羔博利(Bonnie)，但是目前尚无克隆动物长期随访的报道，因此尚不能判断体细胞核转移克隆会出现何种不良远期反应。在细胞核内DNA显示经常受到损害和修复，并出现改变。因为体细胞核转移在卵细胞和精子的单倍体细胞不能通过分裂和融合重组和重新分配遗传物质，使DNA-损伤聚集，形成癌变的风险也随之增高。
展 望
通过基础研究、药物和食品工业以及广大公众等对此有兴趣的人们之间的持续的具有实质性的交流和探讨，将会使体细胞核转移这一新克隆技术获得进一步发展和得到有意义的实施。体细胞核转移克隆化已经是现实，直接或间接参与或关心这技术的人们面临的问题是思考如何确定这技术应用的范围以及限制。
Dtsch.Med Wochenschr.1999,124:255-256, 百拇医药
单位：郝连杰 同济医科大学附属同济医院
关键词：
德国医学/990622 Dolly,Polly et al.:
Klonieren durch somatischen Zellkerntransfer
绵羊多利(Dolly)是第一只从成年动物成熟体细胞克隆出来的哺乳动物，这一研究一方面向基础生物发生学原则提出了挑战；另一方面为生殖生物学、医学以及制药学等的基础研究和应用开创了全新的前景。因此，用体细胞核转移克隆的技术具有巨大潜在意义。同时，它也提出了伦理问题，不仅在专业领域，而且在社会上引起广泛的讨论。
自然繁殖-转基因动物-多利
, 百拇医药
多利的特点是什么自然繁殖是通过减数分裂形成单倍体种子细胞，在受精时单倍体精子和单倍体卵细胞融合成二倍体细胞，再经过分裂和分化发展成一新生机体，在此过程中父母双方遗传物质出现重组和重新分配。转基因技术是现代分子遗传学研究常用的标准技术，方法是在受精卵细胞的原核注入需要的基因DNA片段(转基因)。这段基因被整合到基因组内，成为每个体细胞基因组的一部分，继续遗传给后代。机体在发育成熟过程中，按转基因相关启动子的活性和其细胞或组织特异性，转入的基因将在所期望的组织内得到表达。
绵羊多利却是通过另一个崭新的处理方法——体细胞核转移获得的，这方法是从二倍体体细胞取出细胞核，接种于预先去除细胞核的卵细胞内。用作体细胞核转移的细胞核可以取自胚胎组织，或者——例如多利——甚至取自成年动物已经分化的体细胞，再转移到预先去核的卵细胞内。这是非常令人注目的事，因为传统生物学发生一直认为只有未分化的全能细胞方才具有发育成不同细胞和组织的能力，最终发育成完整的机体。多利和最近克隆出的小鼠Cumulina却表明在适当的实验条件下，成熟的体细胞也有可能返祖，重新再活化其全部原始发生能力。然而，现在仍不清楚，哪一种细胞或者组织类型，何种年龄以及细胞周期的哪一阶段最适合体细胞转移。
, 百拇医药
克隆的特征是无性繁殖遗传性相同的机体。克隆化在植物繁殖已经有上千年的历史，在动物繁殖(分裂胚胎，split embryos)业已进行了10多年。体细胞核转移技术早在50年代已在青蛙、80年代在哺乳动物进行了研究。直到1996年才首次成功的将体外培养液中保存数月的胚胎细胞克隆出小羔羊。因此，也为作体细胞转移前进行改变遗传性在理论上提供了可能性。绵羊多利是第一只从6岁绵羊的乳房细胞克隆出的动物，激起专业领域和社会公众极大的关注。因为从成年个体可以产生无数遗传上相似的拷贝，成为理论上可实现的梦想，但是由于技术方法上的限制，进一步推广应用这种克隆技术仍很困难。而且，必须认识到体细胞转移产生的克隆遗传性并不完全一致，因为线粒体DNA总是来自母方的卵细胞，而且宫内因素和产后发育对原型也起着决定性影响。
从多利到波来(Polly)等等
1997年绵羊波来的诞生是基因技术的进一步突破，用于克隆化的细胞核是预先在体外经人类IX因子基因转导过的胚胎纤维母细胞，在一乳腺特异性启动子——β乳球蛋白-启动子的控制下引入IX因子基因。在体外选出具有此结构稳定的转染细胞，分离出细胞核，再转移到去核的卵细胞内。遗传性修饰过的细胞核所产生的波来在乳腺特异性β乳球蛋白-启动子的控制下，它的乳汁内人类IX因子的含量可达40g/l。从而，使人们从理论上认识到可以用相对低廉的代价，制备出大量极有价值的纯化产品，而且没有传播HIV和丙型肝炎病毒的危险，用于B型血友病作替代治疗。波来可以继续用常规的方法繁殖，以它作为母畜繁殖出一大群能产生IX因子的绵羊。与制备原核注射转基因动物相比较，在体外培养中选择细胞更为容易，基因修饰更为精确。而且，通过体细胞核转移制备转基因动物比常规原核注射方法只需要用少量动物。最后，理论上不仅可以引入异己的基因，而且还可以去除某种基因，或者修饰某种基因。根据胚胎干细胞提供的可能性，这些方法已在小鼠进行。
, 百拇医药
紧接着最近数月发表了另一些关于克隆牛犊和小鼠的报道(表1)。现在成功地将成熟卵巢细胞、载卵丘细胞(Cumulus-Zellen)核转移给去核卵细胞，产生另一小鼠克隆，这只小鼠可通过体细胞转移再克隆，因此最后产生的小鼠与其“双亲”、“祖父母”和“曾祖父母”遗传性完全相似。体细胞核转移克隆技术也可在小鼠进行，能很好地做生物学鉴定，并且复制周期较短，特别为基础研究展现了全新的前景。
表1 通过体细胞转移克隆 动 物
特 点
文 献
Megan和Morag
绵羊来自培养的胚胎细胞
Campbell et al.,Nature380(1996)，64-66.
, 百拇医药
Dolly→Bonnie
绵羊来自成年绵羊乳房细胞
Wilmut et al.,Nature385(1997),810-813.
Polly和Molly
绵羊来自人IX因子转导的
Schieke et al.,Science278(1997),2130-2133.
胚胎纤维母细胞
ACT-3,-4,-5
牛犊来自基因修饰的胚胎纤
Cibelli et al.,Science280(1998),1256-1258.
, 百拇医药
维母细胞
Cumulina和其克隆
小鼠来自卵巢的载卵丘细胞
Wakayama et al.,Nature394(1998),369-374.
应用的可能性和问题
表2列出新克隆技术应用的潜在可能性。如上所述，通过体细胞转移可以产生农业上有用的家畜，这些家畜的乳汁能产生对人类疾病诊断、治疗或者预防上重要的人体蛋白质，例如：凝血因子、白蛋白、α1抗胰蛋白酶等。乳制品蛋白质成分可能对一些人不能耐受或引起过敏反应，有关动物蛋白质可以用相应的人体蛋白质基因替换。在异种移植的领域内，例如猪供体器官可以改变其遗传性，使其能被受体的免疫和补体系统更好地耐受。克隆技术和从中获得的关于细胞分化的新认识也对于细胞和组织的治疗具有重要价值，例如从克隆牛胚胎获得的有产生多巴胺能力的细胞，不久前在巴金森氏病动物的模型获得显著的治疗效果。最后，生物发生学、遗传学和肿瘤研究等临床重要的科学问题均可以用这种新技术实验分析研究。例如，如何改变一个细胞如何改变基因在一妇女如何灭活第2个X染色体如何再活化端粒(Telomere)有何作用
, http://www.100md.com
表2 体细胞核转移技术的应用 为人类疾病的诊断治疗和预防生产人体蛋白质
分子药物学(Nutriceuticals)
异种移植
细胞和组织治疗
基础研究
值得庆幸的是多利仍然很健康，通过自然途径产一幼羔博利(Bonnie)，但是目前尚无克隆动物长期随访的报道，因此尚不能判断体细胞核转移克隆会出现何种不良远期反应。在细胞核内DNA显示经常受到损害和修复，并出现改变。因为体细胞核转移在卵细胞和精子的单倍体细胞不能通过分裂和融合重组和重新分配遗传物质，使DNA-损伤聚集，形成癌变的风险也随之增高。
展 望
通过基础研究、药物和食品工业以及广大公众等对此有兴趣的人们之间的持续的具有实质性的交流和探讨，将会使体细胞核转移这一新克隆技术获得进一步发展和得到有意义的实施。体细胞核转移克隆化已经是现实，直接或间接参与或关心这技术的人们面临的问题是思考如何确定这技术应用的范围以及限制。
Dtsch.Med Wochenschr.1999,124:255-256, 百拇医药