衍生性聚偏二氟乙烯膜用于蛋白质及肽的固相序列测定
作者：吴学玲 陈平 梁宋平
单位：吴学玲：湖南医学高等专科学校生化教研室(长沙 410006)； 陈平 梁宋平：湖南师范大学生命科学学院(长沙 410081)
关键词：氨基酸序列；膜，人工；乙烯类聚合物
湖南医学990603 摘要 目的 研究衍生聚偏二氟乙烯(PVDF)膜用于蛋白质及肽的固相序列测定的可行性。方法 在PVDF膜上引入对苯二异硫氰酸基(DITC)制成能与蛋白质及肽共价偶联的膜载体。用这种膜载体与蛋白质或肽样品偶联后，进行Edman降解及氨基酸顺序分析。结果 该膜载体化学性能稳定，偶联操作简单，结果准确，与蛋白质及肽的偶联率为78.19%，Edman降解的重复回收率为90.27%，所测氨基酸序列与已知序列完全相同。结论 衍生PVDF膜完全可用于蛋白质及肽的固相序列测定。
Derivatized Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane Used for Solid-Phase Sequencing of Proteins and Peptides
, 百拇医药
WU Xueling, CHEN Ping②, LIANG Songping②
Department of Biochemistry,Hunan Medical School,Changsha,410006
(②College of Life Sciences,Hunan Normal University,Changsha,410081)
Abstract Objective To investigate the feasibility of derivatized polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane used for solid-phase sequencing of proteins and peptides.Methods Derivatized PVDF membrane was prepared by introducing 1,4-phenylene diisothiocyanate group (DITC) into the PVDF membrane matrix,then Edman degradation and amino acid sequencing can be achieved through coupling of protein/peptide samples with this membrane.Results The DITC-PVDF membrane showed good mechanical and chemical stability during sequencing.It was simple and easy to couple,obtaining accurate results.The average attachment yield of protein and peptide samples to the DITC-PVDF membrane was 78.19%,the repetitive yield for Edman degradation of the DITC-PVDF membrane was 90.27%.The analyzed amino acid sequences tallied with the known ones.Conclusions DITC-PVDF membrane is very feasible for solid-phase sequencing of proteins and peptides.
, 百拇医药
Key words amino acid sequence;membranes,artificial;polyvinyls
蛋白质序列分析技术已经历了液相、固相、气相三个不同的发展阶段。气相法由于其高灵敏度及样品处理简单等优点，使得该方法成为80年代以来蛋白质序列测定的主要手段[1]。而固相法由于其独特的优点，如分析背景清晰、样品不易丢失等，仍为世界上许多实验室所采用。以往常用的固相载体多是聚苯乙烯树脂和微孔玻璃珠(CPG)[2]，但前者性能不稳定，易膨胀；后者则易造成样品的机械丢失，且偶联操作过程不便。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜有很好的化学稳定性和机械强度，曾被用于凝胶电泳所分离蛋白质的转印迹[3]，作者在该膜上引入能与蛋白质及肽进行共价偶联的功能基团对二异硫氰酸苯基(DITC)，通过与样品的固相化及Edman降解对蛋白质及肽的序列进行测定。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 原料及试剂 PVDF膜(Millipore公司)；DITC，2-氨基乙基异丁烯酸(AEM)，2.2′-双偶氮-2-脒基丙烷(AIBA)，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGD)，2-氨基异硫醇盐酸盐(Sigma公司)；二甲基甲酰胺(DMF)，三乙胺，三氟乙酸(TFA)，盐酸(HCl)，氯仿，甲醇等均为国产分析纯；标准PTH-氨基酸混合物(Backman公司)；异硫氰酸苯酯(PITC)，细胞色素C(Sigma公司)；20肽样品(LANFRIEWSPQVTMDCYHKG)(本研究室合成)。
1.2 仪器与方法 Milligen/Bioserch公司生产的6600型固相测序仪。
1.2.1 DITC-PVDF膜的制备 ①在100 ml的锥形瓶内加入1.8 ml双蒸水，336 mg AEM,90.3 mg AIBA，摇动溶解后加入4.2 ml DMF和0.2 ml EGD，塞住瓶口，继续摇动直到溶液透明澄清。将该溶液移入一盛有100片直径为8 mm的PVDF圆片的聚酯袋内，混匀，抽真空后封口。②将此袋浸入70 ℃水中，60 min后取出。切开袋口，将圆片倒入一锥形瓶内，用双蒸水洗涤圆片数次。继续加入20 ml水和10 μl 12N盐酸，置加热器上轻微沸腾45 min；倒出液体，用水及甲醇洗涤圆片各3次。弃去液体，真空干燥一夜。③将干燥的圆片放入一双颈圆底烧瓶内，加17 ml TFA回流1 h，弃去TFA，用甲醇洗涤圆片3次，真空干燥一夜。④在一锥形瓶内加入8 ml甲醇，1.5 ml乙二胺，0.5 g 2-氨基乙烷硫醇。将配成液加到圆片上，摇动，充分混和。反应20 min后倒出溶液，用双蒸水及甲醇洗涤圆片数次，真空干燥一夜。⑤在一锥形瓶内溶解176 g DITC于3 ml氯仿中，并转注到干燥好的圆片上。继而加25 μl三乙胺于圆片上，摇匀。2 h后将反应液倒掉，用氯仿洗涤圆片数次，真空干燥一夜。取出，置于小瓶内，充氮气密封，-20 ℃贮存。
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1.2.2 DITC-PVDF膜与蛋白质/肽样品的偶联[3] 取直径为8 mm的DITC-PVDF膜一片，加一滴润湿液(N-甲基吗啉∶甲醇∶水＝1∶24∶25)使膜片湿润。在盛有样品的EP管内，加入40 μl偶联液(N-甲基吗啉∶乙腈∶水＝1∶9∶40)，55 ℃保温20 min。继而将样品液加往DITC-PVDF膜上。待其溶剂全部蒸发后再添加10 μl润湿液，干燥后即可转入固相序列仪进行氨基酸序列分析。
1.2.3 氨基酸序列分析 在Milligen/Bioserch公司的固相序列分析仪上进行该项分析。采用连机HPLC分析PTH-氨基酸，分析柱为自装10 U的YWG-C18柱(3.9 mm×300 mm)，检测波长为269 nm，洗脱液为20 mmol/L的乙酸钠缓冲液[含40%乙腈，0.014%十二烷基磺酸钠(SDS)]，pH 7.4，流速0.7 ml/min，等梯度洗脱，室温操作。
1.2.4 氨基酸的组成分析 将样品偶联到DITC-PVDF膜上，置膜于水解指管中(6 mm×50 mm)，将指管放入带有特氟轮密封盖的水解瓶内。在瓶底部加入5.7 N盐酸200 μl，可同时加入巯基乙酸4 μl，苯酚4 μl以防止氧化[4]。将水解瓶抽真空及充氮气反复三次，最后抽真空后关闭水解瓶盖上的特氟轮阀门，在110 ℃恒温加热室中酸解24 h[4]。取出，将指管真空干燥1 h，加入衍生剂(PITC∶三乙胺∶乙醇∶水＝1∶1∶7∶1) 20 μl，衍生20 min后再真空干燥3～4 h。用样品稀释液(71% Na2HPO4溶液，10%H3PO4∶乙腈＝95∶5调至pH 7.40，0.22 μm滤膜过滤)稀释后即可进行氨基酸组成分析。色谱分析柱的柱温为45 ℃，检测波长254 nm，洗脱液A液为0.14 mol/L醋酸钠(含10%乙腈，0.05%三乙胺，pH 6.4)，B液为60%乙腈水溶液，流速0.7 ml/min，层析梯度如下(梯度曲线为6)。 时间(min)
, 百拇医药
流速(ml/min)
A(%)
B(%)
初始
0.7
100
0
1.0
0.7
100
0
21.0
0.7
, 百拇医药
54
46
21.5
0.7
0
100
30.0
0.7
0
100
31.0
0.7
100
, 百拇医药 0
2 结果
2.1 DITC-PVDF膜用于蛋白质及肽的固相序列分析 将已知序列的20肽样品偶联到DITC-PVDF膜上，转入蛋白质固相序列分析仪进行氨基酸序列分析，所得结果，与已知序列完全相同。
2.2 DITC-PVDF膜与样品的偶联率和灵敏度 将样品偶联到DITC-PVDF膜上进行酸解后作氨基酸的组成分析，同时作空白对照分析并与标准图谱比较。根据氨基酸峰的积分面积算出氨基酸的含量，从而获得该膜载体与样品的偶联率为54%～95%[(78.2%±13.6)%]。
2.3 DITC-PVDF膜对氨基酸进行序列测定的重复回收率 将已知序列的细胞色素C(Cyt c)偶联到DITC-PVDF膜上，转入蛋白质固相序列仪进行氨基酸序列分析。根据HPLC图谱中某一氨基酸残基第一次检测到的PTH信号峰面积，再记录下其后n次降解循环后的同一种残基的PTH信号峰面积，将后者与前者之比再开n次方即得重复回收率。可按下式计算：
, 百拇医药
根据计算：DITC-PVDF膜对氨基酸进行序列分析的重复回收率为(90.17±1.83)%。
3 讨论
DITC-PVDF膜作为蛋白质及肽序列分析的固相载体与样品偶联后进行测序，所得PTH信号准确、清晰、典型，背景基线干净，易于辨认。该方法的特点是：所测序列的第一个氨基酸残基L(亮氨酸，Leu)没有信号。这是因为在该PVDF膜上引入的功能基团是DITC，其固相化过程是蛋白质或多肽样品中的Lys(赖氨酸，K)残基通过其ε-氨基与载体上的功能基团发生共价偶联反应，此时样品的N-端第一个氨基酸残基的α-氨基也与载体上的DITC发生共价偶联反应从而被固定到载体上，在序列测定时便得不到该残基的PTH信号，降解反应只能从第二个氨基酸残基开始(若在偶联过程中加入少量PITC，可保护部分N-末端残基的α-氨基不被载体偶联，从而得到部分PTH信号，但总偶联率会有所降低)。由于赖氨酸残基的ε-氨基被固定在载体上，在整个测序过程中也得不到赖氨酸残基的PTH信号。如果赖氨酸残基不处于肽链的C-末端，则氨基酸的序列分析只能进行到近C-端的最后一个赖氨酸残基处，之后的肽段则因与载体已无任何共价键相连而丢失，致使序列分析终止。由于DITC-PVDF膜固定样品的方法是载体上的DITC与样品中赖氨酸残基的ε-氨基相连，所以该方法适合于含有赖氨酸残基的蛋白质和肽的序列分析。对于含有精氨酸残基(Arg，R)的肽，须先用水合肼处理脱胍转变为鸟氨酸才可使用，但固定产率较Lys为低。对于含氨乙基半胱氨酸(-S-CH2-CH2-NH2)残基的肽，用本法也能固定[5]。固相法能否成功，在很大程度上取决于蛋白质或肽与载体的偶联效果即偶联率[6]。作者用已知序列的20肽样品分别称重0.05 mg，0.10 mg，0.15 mg，0.20 mg等作氨基酸组成分析，得出其偶联率为(78.2±13.6)%，这表明，DITC-PVDF膜与样品的偶联率较高，完全能够成功地把蛋白质及多肽样品共价结合到该膜载体上。比较高的重复回收率亦说明本法的效率符合实验要求。
, http://www.100md.com
综上所述，DITC-PVDF膜性能稳定，与蛋白质和肽的偶联率较高，用于氨基酸序列测定时所得的PTH信号准确、灵敏，偶联操作简单，且有较高的重复回收率，完全可用于氨基酸序列分析。但因PVDF膜的衍生制备过程略繁琐，而且若不经特殊处理，不能得到N-末端残基及赖氨酸残基的PTH信号，故本方法有待进一步改进。
参考文献
1 Hewick,R.M.Hunkapiller.M.W,et al:A gas.liquid solid phase peptide and protein sequenator.J Biology Chem,1981，256:7990～7997
2 梁宋平.蛋白质固相序列分析技术新进展.生物化学与生物物理进展.1992，19(3)：181
3 Laurson RA Dixon JD.Liang SP,et al.Methods in protein sequence analysis,B Wittmann-Liebold edit.Berlin:Springer-Verlagpress,1989.61～68
4 夏其昌.蛋白质化学研究技术与进展.北京：科学出版社，1997，23～26
5 徐秀璋.蛋白质顺序分析技术.北京：科学出版社，1988.137～139
6 梁 逊，郭小丽.多肽、蛋白质的固相序列分析.生物化学与生物物理进展，1988，15(2)：105
(19990213 收稿), http://www.100md.com
单位：吴学玲：湖南医学高等专科学校生化教研室(长沙 410006)； 陈平 梁宋平：湖南师范大学生命科学学院(长沙 410081)
关键词：氨基酸序列；膜，人工；乙烯类聚合物
湖南医学990603 摘要 目的 研究衍生聚偏二氟乙烯(PVDF)膜用于蛋白质及肽的固相序列测定的可行性。方法 在PVDF膜上引入对苯二异硫氰酸基(DITC)制成能与蛋白质及肽共价偶联的膜载体。用这种膜载体与蛋白质或肽样品偶联后，进行Edman降解及氨基酸顺序分析。结果 该膜载体化学性能稳定，偶联操作简单，结果准确，与蛋白质及肽的偶联率为78.19%，Edman降解的重复回收率为90.27%，所测氨基酸序列与已知序列完全相同。结论 衍生PVDF膜完全可用于蛋白质及肽的固相序列测定。
Derivatized Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane Used for Solid-Phase Sequencing of Proteins and Peptides
, 百拇医药
WU Xueling, CHEN Ping②, LIANG Songping②
Department of Biochemistry,Hunan Medical School,Changsha,410006
(②College of Life Sciences,Hunan Normal University,Changsha,410081)
Abstract Objective To investigate the feasibility of derivatized polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane used for solid-phase sequencing of proteins and peptides.Methods Derivatized PVDF membrane was prepared by introducing 1,4-phenylene diisothiocyanate group (DITC) into the PVDF membrane matrix,then Edman degradation and amino acid sequencing can be achieved through coupling of protein/peptide samples with this membrane.Results The DITC-PVDF membrane showed good mechanical and chemical stability during sequencing.It was simple and easy to couple,obtaining accurate results.The average attachment yield of protein and peptide samples to the DITC-PVDF membrane was 78.19%,the repetitive yield for Edman degradation of the DITC-PVDF membrane was 90.27%.The analyzed amino acid sequences tallied with the known ones.Conclusions DITC-PVDF membrane is very feasible for solid-phase sequencing of proteins and peptides.
, 百拇医药
Key words amino acid sequence;membranes,artificial;polyvinyls
蛋白质序列分析技术已经历了液相、固相、气相三个不同的发展阶段。气相法由于其高灵敏度及样品处理简单等优点，使得该方法成为80年代以来蛋白质序列测定的主要手段[1]。而固相法由于其独特的优点，如分析背景清晰、样品不易丢失等，仍为世界上许多实验室所采用。以往常用的固相载体多是聚苯乙烯树脂和微孔玻璃珠(CPG)[2]，但前者性能不稳定，易膨胀；后者则易造成样品的机械丢失，且偶联操作过程不便。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜有很好的化学稳定性和机械强度，曾被用于凝胶电泳所分离蛋白质的转印迹[3]，作者在该膜上引入能与蛋白质及肽进行共价偶联的功能基团对二异硫氰酸苯基(DITC)，通过与样品的固相化及Edman降解对蛋白质及肽的序列进行测定。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 原料及试剂 PVDF膜(Millipore公司)；DITC，2-氨基乙基异丁烯酸(AEM)，2.2′-双偶氮-2-脒基丙烷(AIBA)，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGD)，2-氨基异硫醇盐酸盐(Sigma公司)；二甲基甲酰胺(DMF)，三乙胺，三氟乙酸(TFA)，盐酸(HCl)，氯仿，甲醇等均为国产分析纯；标准PTH-氨基酸混合物(Backman公司)；异硫氰酸苯酯(PITC)，细胞色素C(Sigma公司)；20肽样品(LANFRIEWSPQVTMDCYHKG)(本研究室合成)。
1.2 仪器与方法 Milligen/Bioserch公司生产的6600型固相测序仪。
1.2.1 DITC-PVDF膜的制备 ①在100 ml的锥形瓶内加入1.8 ml双蒸水，336 mg AEM,90.3 mg AIBA，摇动溶解后加入4.2 ml DMF和0.2 ml EGD，塞住瓶口，继续摇动直到溶液透明澄清。将该溶液移入一盛有100片直径为8 mm的PVDF圆片的聚酯袋内，混匀，抽真空后封口。②将此袋浸入70 ℃水中，60 min后取出。切开袋口，将圆片倒入一锥形瓶内，用双蒸水洗涤圆片数次。继续加入20 ml水和10 μl 12N盐酸，置加热器上轻微沸腾45 min；倒出液体，用水及甲醇洗涤圆片各3次。弃去液体，真空干燥一夜。③将干燥的圆片放入一双颈圆底烧瓶内，加17 ml TFA回流1 h，弃去TFA，用甲醇洗涤圆片3次，真空干燥一夜。④在一锥形瓶内加入8 ml甲醇，1.5 ml乙二胺，0.5 g 2-氨基乙烷硫醇。将配成液加到圆片上，摇动，充分混和。反应20 min后倒出溶液，用双蒸水及甲醇洗涤圆片数次，真空干燥一夜。⑤在一锥形瓶内溶解176 g DITC于3 ml氯仿中，并转注到干燥好的圆片上。继而加25 μl三乙胺于圆片上，摇匀。2 h后将反应液倒掉，用氯仿洗涤圆片数次，真空干燥一夜。取出，置于小瓶内，充氮气密封，-20 ℃贮存。
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1.2.2 DITC-PVDF膜与蛋白质/肽样品的偶联[3] 取直径为8 mm的DITC-PVDF膜一片，加一滴润湿液(N-甲基吗啉∶甲醇∶水＝1∶24∶25)使膜片湿润。在盛有样品的EP管内，加入40 μl偶联液(N-甲基吗啉∶乙腈∶水＝1∶9∶40)，55 ℃保温20 min。继而将样品液加往DITC-PVDF膜上。待其溶剂全部蒸发后再添加10 μl润湿液，干燥后即可转入固相序列仪进行氨基酸序列分析。
1.2.3 氨基酸序列分析 在Milligen/Bioserch公司的固相序列分析仪上进行该项分析。采用连机HPLC分析PTH-氨基酸，分析柱为自装10 U的YWG-C18柱(3.9 mm×300 mm)，检测波长为269 nm，洗脱液为20 mmol/L的乙酸钠缓冲液[含40%乙腈，0.014%十二烷基磺酸钠(SDS)]，pH 7.4，流速0.7 ml/min，等梯度洗脱，室温操作。
1.2.4 氨基酸的组成分析 将样品偶联到DITC-PVDF膜上，置膜于水解指管中(6 mm×50 mm)，将指管放入带有特氟轮密封盖的水解瓶内。在瓶底部加入5.7 N盐酸200 μl，可同时加入巯基乙酸4 μl，苯酚4 μl以防止氧化[4]。将水解瓶抽真空及充氮气反复三次，最后抽真空后关闭水解瓶盖上的特氟轮阀门，在110 ℃恒温加热室中酸解24 h[4]。取出，将指管真空干燥1 h，加入衍生剂(PITC∶三乙胺∶乙醇∶水＝1∶1∶7∶1) 20 μl，衍生20 min后再真空干燥3～4 h。用样品稀释液(71% Na2HPO4溶液，10%H3PO4∶乙腈＝95∶5调至pH 7.40，0.22 μm滤膜过滤)稀释后即可进行氨基酸组成分析。色谱分析柱的柱温为45 ℃，检测波长254 nm，洗脱液A液为0.14 mol/L醋酸钠(含10%乙腈，0.05%三乙胺，pH 6.4)，B液为60%乙腈水溶液，流速0.7 ml/min，层析梯度如下(梯度曲线为6)。 时间(min)
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流速(ml/min)
A(%)
B(%)
初始
0.7
100
0
1.0
0.7
100
0
21.0
0.7
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54
46
21.5
0.7
0
100
30.0
0.7
0
100
31.0
0.7
100
, 百拇医药 0
2 结果
2.1 DITC-PVDF膜用于蛋白质及肽的固相序列分析 将已知序列的20肽样品偶联到DITC-PVDF膜上，转入蛋白质固相序列分析仪进行氨基酸序列分析，所得结果，与已知序列完全相同。
2.2 DITC-PVDF膜与样品的偶联率和灵敏度 将样品偶联到DITC-PVDF膜上进行酸解后作氨基酸的组成分析，同时作空白对照分析并与标准图谱比较。根据氨基酸峰的积分面积算出氨基酸的含量，从而获得该膜载体与样品的偶联率为54%～95%[(78.2%±13.6)%]。
2.3 DITC-PVDF膜对氨基酸进行序列测定的重复回收率 将已知序列的细胞色素C(Cyt c)偶联到DITC-PVDF膜上，转入蛋白质固相序列仪进行氨基酸序列分析。根据HPLC图谱中某一氨基酸残基第一次检测到的PTH信号峰面积，再记录下其后n次降解循环后的同一种残基的PTH信号峰面积，将后者与前者之比再开n次方即得重复回收率。可按下式计算：
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根据计算：DITC-PVDF膜对氨基酸进行序列分析的重复回收率为(90.17±1.83)%。
3 讨论
DITC-PVDF膜作为蛋白质及肽序列分析的固相载体与样品偶联后进行测序，所得PTH信号准确、清晰、典型，背景基线干净，易于辨认。该方法的特点是：所测序列的第一个氨基酸残基L(亮氨酸，Leu)没有信号。这是因为在该PVDF膜上引入的功能基团是DITC，其固相化过程是蛋白质或多肽样品中的Lys(赖氨酸，K)残基通过其ε-氨基与载体上的功能基团发生共价偶联反应，此时样品的N-端第一个氨基酸残基的α-氨基也与载体上的DITC发生共价偶联反应从而被固定到载体上，在序列测定时便得不到该残基的PTH信号，降解反应只能从第二个氨基酸残基开始(若在偶联过程中加入少量PITC，可保护部分N-末端残基的α-氨基不被载体偶联，从而得到部分PTH信号，但总偶联率会有所降低)。由于赖氨酸残基的ε-氨基被固定在载体上，在整个测序过程中也得不到赖氨酸残基的PTH信号。如果赖氨酸残基不处于肽链的C-末端，则氨基酸的序列分析只能进行到近C-端的最后一个赖氨酸残基处，之后的肽段则因与载体已无任何共价键相连而丢失，致使序列分析终止。由于DITC-PVDF膜固定样品的方法是载体上的DITC与样品中赖氨酸残基的ε-氨基相连，所以该方法适合于含有赖氨酸残基的蛋白质和肽的序列分析。对于含有精氨酸残基(Arg，R)的肽，须先用水合肼处理脱胍转变为鸟氨酸才可使用，但固定产率较Lys为低。对于含氨乙基半胱氨酸(-S-CH2-CH2-NH2)残基的肽，用本法也能固定[5]。固相法能否成功，在很大程度上取决于蛋白质或肽与载体的偶联效果即偶联率[6]。作者用已知序列的20肽样品分别称重0.05 mg，0.10 mg，0.15 mg，0.20 mg等作氨基酸组成分析，得出其偶联率为(78.2±13.6)%，这表明，DITC-PVDF膜与样品的偶联率较高，完全能够成功地把蛋白质及多肽样品共价结合到该膜载体上。比较高的重复回收率亦说明本法的效率符合实验要求。
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综上所述，DITC-PVDF膜性能稳定，与蛋白质和肽的偶联率较高，用于氨基酸序列测定时所得的PTH信号准确、灵敏，偶联操作简单，且有较高的重复回收率，完全可用于氨基酸序列分析。但因PVDF膜的衍生制备过程略繁琐，而且若不经特殊处理，不能得到N-末端残基及赖氨酸残基的PTH信号，故本方法有待进一步改进。
参考文献
1 Hewick,R.M.Hunkapiller.M.W,et al:A gas.liquid solid phase peptide and protein sequenator.J Biology Chem,1981，256:7990～7997
2 梁宋平.蛋白质固相序列分析技术新进展.生物化学与生物物理进展.1992，19(3)：181
3 Laurson RA Dixon JD.Liang SP,et al.Methods in protein sequence analysis,B Wittmann-Liebold edit.Berlin:Springer-Verlagpress,1989.61～68
4 夏其昌.蛋白质化学研究技术与进展.北京：科学出版社，1997，23～26
5 徐秀璋.蛋白质顺序分析技术.北京：科学出版社，1988.137～139
6 梁 逊，郭小丽.多肽、蛋白质的固相序列分析.生物化学与生物物理进展，1988，15(2)：105
(19990213 收稿), http://www.100md.com