细胞微核的研究进展
作者：吴茅
单位：浙江省人民医院杭州，310014
关键词：微核；细胞；白液病；贫血
临床血液学杂志990624 钱志尧 林修基 审校
微核是细胞在有丝分裂时因各种有害因素损伤，使细胞核成份残留在核外的微小核染色质块。其作为评价药物、放射线及细胞毒性物质对人、动物及体外细胞损伤已有较长的历史。为了解最新相关的研究情况，我们就最近国外有关细胞微核的形成机理、特性及临床实用价值等综述如下。
1 微核形成的机理
1.1 微核形成的机理 ①化学毒性物质损伤所致的微核：纺锤丝毒性类药物如秋水仙碱、HO-221等能直接抑制动物细胞纺锤丝的形成，阻止细胞分裂中期纺锤丝将染色体拉至细胞的两端。Ando等〔1〕应用抗肿瘤药(HO-221)抑制纺锤丝微管组装，破坏纺锤丝，结果在染色体分析时诱导出多倍体和亚二倍体细胞，未见染色体断裂，鼠体内细胞也常被诱导出较大的微核。有机苯能引起微核增多且有明显的致癌作用，苯三酚(1，2，4-苯三酚，BT)在氧化成醌时产生活性氧损伤DNA和其它一些细胞大分子，实验中BT能使淋巴细胞微核率上升2倍，使HK-60细胞微核率上升8倍，且总微核数两类细胞呈剂量相关性增高，BT不仅引起染色体数目和结构变化，而且通过产生新生氧间接引发点突变。②细胞组成成份缺乏所致微核：有作者对9位健康志愿者进行了叶酸限量试验，从基础用量的195 mg/d，减到56 mg/d，维持5周，然后慢慢补充叶酸，减量后的双核淋巴细胞和全系淋巴细胞内的微核频率均增高，且着丝点阳性和阴性的微核都增加。当叶酸补充后，两类细胞微核率明显下降，着丝点阳性微核变化更为显著。实验表明，低叶酸血症在临床贫血症状之前，就出现了血液和口腔粘膜细胞遗传物质损伤〔1〕。③其它致微核因素：体内外细胞放射线照射也是导致遗传物质损伤是诱发微核形成的一个重要因素〔2，3〕。微核又是细胞凋亡产物，当程序性死亡基因被激活，随之Ca2+依赖性内切酶激活，切割DNA，形成细胞核碎片，形态学表现为核深染，染色质边缘分布的帽形核，最后导致无数微核。
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1.2 减少微核产生或减少有害物质的细胞损伤因素 Giri等〔4〕研究认为，维生素C有预防顺铂诱导鼠致畸的作用，联合该两类药物，发现鼠骨髓细胞微核，染色体畸变等指标明显低于单独使用顺铂。有趣的是他们还发现联合治疗过程中鼠骨髓细胞谷胱甘肽(GSH)水平也明显增高，可解释维生素C保护活体细胞免受顺铂诱导畸变的部分机理。BarthT等〔5〕对24名口腔粘膜白斑和24名原发性口腔癌根除术病人进行研究发现，β-胡萝卜素、维生素E及维生素C等抗氧化剂，能使异常粘膜细胞再分化，使微核数目减少且导致细胞角蛋白基因的正常表达。Gatena等〔3〕经微核试验发现同一照射剂量下体内放射治疗的病人较体外细胞的微核发生低，因此推测体内可能存在细胞遗传恢复因子K。另外，观察切脾病人幼红细胞微核变化，发现切除脾脏加化疗的病人，每1万个幼红细胞的微核细胞(65.2+/-17.7)明显高于没有切脾的化疗病人(2.5+/-1.5)和没有化疗的切脾病人(29.5+/-5.8)，可推测微核幼红细胞可能在脾脏加速清除〔6〕。
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2 微核的特性
微核与染色体的关系：Zhang等用抗着丝点抗体将微核分为含着丝点的微核与无着丝点的微核，前者是完整的染色体。在经BT诱导所致的淋巴细胞及HK-60细胞中，抗着丝点染色体阳性的微核检出率较高，分别为62%和82%。1，3丁二烯代谢物双环氧丁烷(DEB)和单环氧丁烷(MEB)，在达到一定浓度时也可显著增加微核，试验组较对照组高出2～6倍(P<0.01)，DEB和MEB引起剂量依赖性的染色体12和X超二倍体的增多，及诱导7，8，12染色体缺失的非整倍体〔7〕。TK1位点位于11号染色体，可能在微核群中处于低表达状态，用11号染色体修饰的原位杂交荧光技术检测由秋水仙碱和长春新碱诱导的微核，发现实际含11号染色体的微核比因基因突变而觉察到的要多得多。所以认为含整条染色体的微核常不会导致该体系的基因突变〔8〕。经X线、丝裂霉素、秋水仙碱、长春新碱等因素作用体外培养细胞，结果在较低浓度下就可出现微核增多，其微核细胞也常能稳定和再生，但在同一浓度下，TK6细胞株的微核就明显多于L5178Y细胞株。因此，认为不同品系细胞对毒性损伤的抗性也存在差异。
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3 微核研究的范围及实用价值
近期微核研究范围仍局限于人体试验和体外试验，后者有动物试验和培养细胞分析。被观察的细胞有淋巴细胞、有核红细胞、口腔粘膜细胞及体外细胞株。微核的实用价值主要表现为三方面：①用于致癌物质的调查：例如调查苯的毒性作用，当分别给鼠吸入苯0，1，10，100及200 ppm 8周，只有100和200 ppm浓度的苯才显著诱导骨髓和血的幼红细胞微核频率增高，而吸入1或10 ppm苯达8周时幼红细胞微核频率并无统计学差异。Han等〔10〕在研究哔可(Beicun)乡村地区环境污染，调查空气、河水、饮用水、蔬菜和人血清时，发现该地区苯芘、空气总悬浮颗粒、饮用水及蔬菜中的硝酸根和亚硝酸根都明显高于其它受控的乡村地区(P<0.01)。被培养的该地区居民淋巴细胞微核和核畸变显著增多，且与苯并芘、空气中的悬浮颗粒、饮用水及蔬菜中的硝酸根和亚硝酸根含量呈显著相关。推测空气和水源严重污染可能是升高该地区居民细胞遗传学损伤和癌症死亡率的重要因素。②微核常用于肿瘤放疗后的遗传学损伤分析：文献介绍用细胞动力封闭微核分析法评价111 MBq89 Sr治疗8位病人后的淋巴细胞辐射线损伤情况，结果治疗后每500个双核细胞的微核平均值(17.1+/-3.0)明显高于治疗前的对照细胞(6.0+/-1.7)，治疗后6周内的微核数呈逐渐恢复。0.53+/-0.13Gy外部照射后的微核数几乎接近89 Sr治疗后的体内情况，体内暴露89 Sr的淋巴细胞微核率较低，从而认为使用111 MBqSr照射疼痛的肿瘤骨转移病人的非随机遗传学损伤只是轻微的短期损伤〔9〕。其它放疗病人淋巴细胞及幼红细胞的微核变化也提示了微核观察对了解辐射损伤的意义。③微核用于白血病化疗后细胞学损伤及预后的观察：Rytwinski等人回顾性地分析140例急性淋巴细胞白血病的儿童骨髓细胞幼红细胞微核变化与贫血和复发的相关性，发现幼红细胞微核与贫血密切相关而与复发无关，BFM方案治疗的儿童幼红细胞微核率低于孟菲斯(Memphis)方案，认为BFM方案化疗的基因毒性更小，后来有人分析41例急性淋巴细胞性白血病的儿童，观察病人2年治疗期幼红细胞微核率变化，发现多数病人从初诊到结束治疗，微核呈进行性升高，但与病人预后无相关性。Elias-L等对15例化疗或放疗急淋儿童外周血淋巴细胞微核变化进行分析，用长春新碱、甲基喋啉、柔红霉素、强的松化疗和首次强化疗末期使用了头部放疗的病人，他们的淋巴细胞微核(平均19.96+/-12.9%)，明显高于对照组(平均3.67+/-1.55%)，6例作了2年治疗期动态观察，多数病人贯穿治疗期淋巴细胞微核频率显著增高。因而认为微核检测法是评价抗白血病化疗药物诱导机体细胞遗传学损伤的有效方法。
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总之，用微核来评价药物、放射线、有毒物质，对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤仍是一个直观可行的方法。文献报告也不少，近几年DNA碎片的分析和细胞凋亡的研究及单克抗体的应用进一步丰富了微核理论，但研究范围仍局限于幼红细胞、成熟淋巴细胞及体外细胞株，而有关白血病和贫血病例临床实用性文献仍甚少。
参考文献
1 Titenko-holland N,jacob RA,shang N,et al.Micronuclei in lymphocytes and exfoliated buccal cells of postmenopausal women with dietary changes in folate.Hum genet,1997,(6):710
2 Watanabe N,Yokoyama K,Kinuya S,et al.Radiotoxicity after strontium-89 therapy for bone metastases using the micronucleus assay.Mutat Res,1998,3;421(2):139
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3 Catena C,Parasacchip,Conti D,et al.Peripheral blood lymphocyte decrease and Micronucleus yields during radiotherapy.Jpn J cancer Res.1997,88(9):907
4 Giri A,Khynrian D, Prasad SB, et al. Vitamin C Mediated protection on cisplatin induced mutagenicity in mice. Chung Hua Liu Hsing Ping Hsueh Tsa Chih 1997,18(2):83～85
5 Barth TJ, Zoller J, Kubler A, et al. Redifferentiation of oral dysplastic mucosa by the application of the antioxidants beta-carotene,alpha-tocopherol and vitamin C Int J cancer,1997,72(6):1070
, http://www.100md.com
6 Zuniga G,Torres Bugarin O,Ramirez-Munoz MP,et al. Micronucleated erythrocytes in splenectomized patients with and without chemotherepy. Mutat-Res.1996,12;361(2～3):107
7 XiL,Zhang L,Wang Y, et al. Induction of chromo some-spcific aneuploidy and micronuclei in human lymphocytes by metabolites of 1,3-butadiene. Matagenewsis,1997,12(5):379
8 Eckert I, Caspary WJ, Nusse M,et al. Micronuclei containing whole chromosomes harbouring the selectable gene do not Lead to mutagenesis.Exp Toxicol Pathol,1997,49(1～2):15
, 百拇医药
9 Watanabe N, Yokoyama K, Kinuya S et al. Radiotoxicity after Strontium-89 therapy for bone metastases using the micronucleus assay. Mutate Res,1998, 3,421(2):139
10 Han C, Jing JX,Sun GX. Study of environnmental pollution and damage of cytogenetic materials in urban residents. Teratog Carcinog Mutagen,1998,18(4):199
(1999-03-31 收稿), 百拇医药
单位：浙江省人民医院杭州，310014
关键词：微核；细胞；白液病；贫血
临床血液学杂志990624 钱志尧 林修基 审校
微核是细胞在有丝分裂时因各种有害因素损伤，使细胞核成份残留在核外的微小核染色质块。其作为评价药物、放射线及细胞毒性物质对人、动物及体外细胞损伤已有较长的历史。为了解最新相关的研究情况，我们就最近国外有关细胞微核的形成机理、特性及临床实用价值等综述如下。
1 微核形成的机理
1.1 微核形成的机理 ①化学毒性物质损伤所致的微核：纺锤丝毒性类药物如秋水仙碱、HO-221等能直接抑制动物细胞纺锤丝的形成，阻止细胞分裂中期纺锤丝将染色体拉至细胞的两端。Ando等〔1〕应用抗肿瘤药(HO-221)抑制纺锤丝微管组装，破坏纺锤丝，结果在染色体分析时诱导出多倍体和亚二倍体细胞，未见染色体断裂，鼠体内细胞也常被诱导出较大的微核。有机苯能引起微核增多且有明显的致癌作用，苯三酚(1，2，4-苯三酚，BT)在氧化成醌时产生活性氧损伤DNA和其它一些细胞大分子，实验中BT能使淋巴细胞微核率上升2倍，使HK-60细胞微核率上升8倍，且总微核数两类细胞呈剂量相关性增高，BT不仅引起染色体数目和结构变化，而且通过产生新生氧间接引发点突变。②细胞组成成份缺乏所致微核：有作者对9位健康志愿者进行了叶酸限量试验，从基础用量的195 mg/d，减到56 mg/d，维持5周，然后慢慢补充叶酸，减量后的双核淋巴细胞和全系淋巴细胞内的微核频率均增高，且着丝点阳性和阴性的微核都增加。当叶酸补充后，两类细胞微核率明显下降，着丝点阳性微核变化更为显著。实验表明，低叶酸血症在临床贫血症状之前，就出现了血液和口腔粘膜细胞遗传物质损伤〔1〕。③其它致微核因素：体内外细胞放射线照射也是导致遗传物质损伤是诱发微核形成的一个重要因素〔2，3〕。微核又是细胞凋亡产物，当程序性死亡基因被激活，随之Ca2+依赖性内切酶激活，切割DNA，形成细胞核碎片，形态学表现为核深染，染色质边缘分布的帽形核，最后导致无数微核。
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1.2 减少微核产生或减少有害物质的细胞损伤因素 Giri等〔4〕研究认为，维生素C有预防顺铂诱导鼠致畸的作用，联合该两类药物，发现鼠骨髓细胞微核，染色体畸变等指标明显低于单独使用顺铂。有趣的是他们还发现联合治疗过程中鼠骨髓细胞谷胱甘肽(GSH)水平也明显增高，可解释维生素C保护活体细胞免受顺铂诱导畸变的部分机理。BarthT等〔5〕对24名口腔粘膜白斑和24名原发性口腔癌根除术病人进行研究发现，β-胡萝卜素、维生素E及维生素C等抗氧化剂，能使异常粘膜细胞再分化，使微核数目减少且导致细胞角蛋白基因的正常表达。Gatena等〔3〕经微核试验发现同一照射剂量下体内放射治疗的病人较体外细胞的微核发生低，因此推测体内可能存在细胞遗传恢复因子K。另外，观察切脾病人幼红细胞微核变化，发现切除脾脏加化疗的病人，每1万个幼红细胞的微核细胞(65.2+/-17.7)明显高于没有切脾的化疗病人(2.5+/-1.5)和没有化疗的切脾病人(29.5+/-5.8)，可推测微核幼红细胞可能在脾脏加速清除〔6〕。
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2 微核的特性
微核与染色体的关系：Zhang等用抗着丝点抗体将微核分为含着丝点的微核与无着丝点的微核，前者是完整的染色体。在经BT诱导所致的淋巴细胞及HK-60细胞中，抗着丝点染色体阳性的微核检出率较高，分别为62%和82%。1，3丁二烯代谢物双环氧丁烷(DEB)和单环氧丁烷(MEB)，在达到一定浓度时也可显著增加微核，试验组较对照组高出2～6倍(P<0.01)，DEB和MEB引起剂量依赖性的染色体12和X超二倍体的增多，及诱导7，8，12染色体缺失的非整倍体〔7〕。TK1位点位于11号染色体，可能在微核群中处于低表达状态，用11号染色体修饰的原位杂交荧光技术检测由秋水仙碱和长春新碱诱导的微核，发现实际含11号染色体的微核比因基因突变而觉察到的要多得多。所以认为含整条染色体的微核常不会导致该体系的基因突变〔8〕。经X线、丝裂霉素、秋水仙碱、长春新碱等因素作用体外培养细胞，结果在较低浓度下就可出现微核增多，其微核细胞也常能稳定和再生，但在同一浓度下，TK6细胞株的微核就明显多于L5178Y细胞株。因此，认为不同品系细胞对毒性损伤的抗性也存在差异。
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3 微核研究的范围及实用价值
近期微核研究范围仍局限于人体试验和体外试验，后者有动物试验和培养细胞分析。被观察的细胞有淋巴细胞、有核红细胞、口腔粘膜细胞及体外细胞株。微核的实用价值主要表现为三方面：①用于致癌物质的调查：例如调查苯的毒性作用，当分别给鼠吸入苯0，1，10，100及200 ppm 8周，只有100和200 ppm浓度的苯才显著诱导骨髓和血的幼红细胞微核频率增高，而吸入1或10 ppm苯达8周时幼红细胞微核频率并无统计学差异。Han等〔10〕在研究哔可(Beicun)乡村地区环境污染，调查空气、河水、饮用水、蔬菜和人血清时，发现该地区苯芘、空气总悬浮颗粒、饮用水及蔬菜中的硝酸根和亚硝酸根都明显高于其它受控的乡村地区(P<0.01)。被培养的该地区居民淋巴细胞微核和核畸变显著增多，且与苯并芘、空气中的悬浮颗粒、饮用水及蔬菜中的硝酸根和亚硝酸根含量呈显著相关。推测空气和水源严重污染可能是升高该地区居民细胞遗传学损伤和癌症死亡率的重要因素。②微核常用于肿瘤放疗后的遗传学损伤分析：文献介绍用细胞动力封闭微核分析法评价111 MBq89 Sr治疗8位病人后的淋巴细胞辐射线损伤情况，结果治疗后每500个双核细胞的微核平均值(17.1+/-3.0)明显高于治疗前的对照细胞(6.0+/-1.7)，治疗后6周内的微核数呈逐渐恢复。0.53+/-0.13Gy外部照射后的微核数几乎接近89 Sr治疗后的体内情况，体内暴露89 Sr的淋巴细胞微核率较低，从而认为使用111 MBqSr照射疼痛的肿瘤骨转移病人的非随机遗传学损伤只是轻微的短期损伤〔9〕。其它放疗病人淋巴细胞及幼红细胞的微核变化也提示了微核观察对了解辐射损伤的意义。③微核用于白血病化疗后细胞学损伤及预后的观察：Rytwinski等人回顾性地分析140例急性淋巴细胞白血病的儿童骨髓细胞幼红细胞微核变化与贫血和复发的相关性，发现幼红细胞微核与贫血密切相关而与复发无关，BFM方案治疗的儿童幼红细胞微核率低于孟菲斯(Memphis)方案，认为BFM方案化疗的基因毒性更小，后来有人分析41例急性淋巴细胞性白血病的儿童，观察病人2年治疗期幼红细胞微核率变化，发现多数病人从初诊到结束治疗，微核呈进行性升高，但与病人预后无相关性。Elias-L等对15例化疗或放疗急淋儿童外周血淋巴细胞微核变化进行分析，用长春新碱、甲基喋啉、柔红霉素、强的松化疗和首次强化疗末期使用了头部放疗的病人，他们的淋巴细胞微核(平均19.96+/-12.9%)，明显高于对照组(平均3.67+/-1.55%)，6例作了2年治疗期动态观察，多数病人贯穿治疗期淋巴细胞微核频率显著增高。因而认为微核检测法是评价抗白血病化疗药物诱导机体细胞遗传学损伤的有效方法。
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总之，用微核来评价药物、放射线、有毒物质，对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤仍是一个直观可行的方法。文献报告也不少，近几年DNA碎片的分析和细胞凋亡的研究及单克抗体的应用进一步丰富了微核理论，但研究范围仍局限于幼红细胞、成熟淋巴细胞及体外细胞株，而有关白血病和贫血病例临床实用性文献仍甚少。
参考文献
1 Titenko-holland N,jacob RA,shang N,et al.Micronuclei in lymphocytes and exfoliated buccal cells of postmenopausal women with dietary changes in folate.Hum genet,1997,(6):710
2 Watanabe N,Yokoyama K,Kinuya S,et al.Radiotoxicity after strontium-89 therapy for bone metastases using the micronucleus assay.Mutat Res,1998,3;421(2):139
, http://www.100md.com
3 Catena C,Parasacchip,Conti D,et al.Peripheral blood lymphocyte decrease and Micronucleus yields during radiotherapy.Jpn J cancer Res.1997,88(9):907
4 Giri A,Khynrian D, Prasad SB, et al. Vitamin C Mediated protection on cisplatin induced mutagenicity in mice. Chung Hua Liu Hsing Ping Hsueh Tsa Chih 1997,18(2):83～85
5 Barth TJ, Zoller J, Kubler A, et al. Redifferentiation of oral dysplastic mucosa by the application of the antioxidants beta-carotene,alpha-tocopherol and vitamin C Int J cancer,1997,72(6):1070
, http://www.100md.com
6 Zuniga G,Torres Bugarin O,Ramirez-Munoz MP,et al. Micronucleated erythrocytes in splenectomized patients with and without chemotherepy. Mutat-Res.1996,12;361(2～3):107
7 XiL,Zhang L,Wang Y, et al. Induction of chromo some-spcific aneuploidy and micronuclei in human lymphocytes by metabolites of 1,3-butadiene. Matagenewsis,1997,12(5):379
8 Eckert I, Caspary WJ, Nusse M,et al. Micronuclei containing whole chromosomes harbouring the selectable gene do not Lead to mutagenesis.Exp Toxicol Pathol,1997,49(1～2):15
, 百拇医药
9 Watanabe N, Yokoyama K, Kinuya S et al. Radiotoxicity after Strontium-89 therapy for bone metastases using the micronucleus assay. Mutate Res,1998, 3,421(2):139
10 Han C, Jing JX,Sun GX. Study of environnmental pollution and damage of cytogenetic materials in urban residents. Teratog Carcinog Mutagen,1998,18(4):199
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