容量超负荷心功能不全大鼠心肌一氧化氮合酶的变化
作者：韩福生 邢东琦 于维汉 周令望 曾宪惠 曾绍娟 高广道
单位：韩福生 于维汉 周令望 曾宪惠 曾绍娟 哈尔滨医科大学克山病研究所；邢东琦 高广道 西安医科大学病理生理教研室
关键词：一氧化氮；一氧化氮合酶；心功能不全
中国地方病学杂志990603
[摘要] 目的 探讨一氧化氮合酶(nitric oxdie synthase,NOS)在心功能不全发生机制中的意义。方法 复制容量超负荷心功能不全大鼠模型，用比色法检测了心肌NOS活性，用Griess法间接检测了一氧化氮(nitric oxide,NO)血浓度的变化。结果 心功能不全心肌NOS活性增高，血NO水平显著升高(P<0.05及P<0.001)。结论 提示NOS的改变参与了心功能不全的发生发展过程，这可能与NOS活性增加生成超量的NO通过抑制心肌收缩力、损伤心肌细胞等机制有关。
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[中图分类号] R365;Q591.9 [文献标识码] A [文章编号]1000-4955(1999)06-0408-03
Changes of nitric oxide synthase in dysfunctional rat hearts induced by volume overload
HAN Fu-sheng,XING Dong-qi,YU Wei-han,et al
(Institue of Keshan Disease,Harbin Medical Univercity,Harbin 150086,China)
[Abstract] Objective To investigate the role of nitric oxide synthase(NOS) in cardiac dysfunction.Methods The cardiac dysfunctional rat models with volume-overload was made.NOS activity was examined with colorimetric method,plasma nitric oxide(NO) was determined indirectly with Griess method.Result The results showed that NOS activity in dysfunctional myocardium increased significantly and plasma NO greatly increased as well (P<0.05 and P<0.001).Conclusions The results suggest that the change of NOS may be involved in the development of cardiac dysfunction.NOS may lead to excess NO and subsequently inhibi myocardial contraction and cause myocyte injury.
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[Key words] Nitric oxide;Nitric oxide synthase;Cardiac dysfunction
心力衰竭是诸多心脏疾病发展的终末阶段，其发病机制中循环内分泌和心脏自分泌、旁分泌的异常激活是近年来的研究热点。循环内分泌和心脏组织自分泌、旁分泌异常激活主要包括：(1)交感神经系统、肾素-血管紧张素-醛固酮系统、精氨酸血管加压素；(2)心脏的心房利钠肽、脑利肽及血管内皮细胞的血管利钠肽；(3)细胞因子；(4)内皮素与一氧化氮。本实验复制了容量超负荷心功能不全大鼠模型，通过检测心肌NOS及血浆NO水平，旨在探讨NOS在心功能不全发病机制中的生物学意义。
1 材料与方法
1.1 复制容量超负荷大鼠模型 选取体重150～180g健康SD大鼠，雌雄各半，随机分为心功能不全(cardiac dysfunction,CD)组及假手术组(sham-operation,SO)组，参照Garvcia等人的方法[1]加以改进，行腹主动脉-后腔静脉造瘘术复制容量超负荷模型，SO组只分离腹主动脉-后腔静脉，但不造瘘。术后常规饲养、观察。
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1.2 心功能测定[2，3] 大鼠饲养10周后，以RM-6000型八道生理记录仪、MFV-1200型电磁血流量计分别检测心率(HR)、平均颈动脉压(MAP)、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室等容相室内压变化最大速率(±dp/dt max)，经股静脉以40ml.kg-1.min-1速度输入37℃的无菌Tyrode溶液(NaCl8.0,KCl 0.2,CaCl2 0.2,MgCl2 0.1,NaH2PO4 0.05,NaHCO3 1.0,Glucose 1.0加去离子水至1000ml)，测左心室最大每搏量和最大每分钟输出量(peak cardiac output,pCO)，再根据容量负荷下左心室每分钟贮备量(cardiac output reverse function,CORF)=(pCO-CO)/CO×100%计算CORF。上述操作完成后，稳定10min,用无菌注射器抽取血液2ml,肝素抗凝，4℃保存备检。摘取心脏以生理盐水冲洗干净，-20℃冻存备检。
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1.3 血浆NO检测 用Griess法，试剂购自邦定公司。
1.4 NOS活性检测[4]
1.4.1 原理：L-精氨酸(L-arginine,L-Arg)在NOS作用下生成NO，后者与血红蛋白反应生成高铁血红蛋白，根据401nm与421nm波长吸光度变化，来反映NOS活性。
1.4.2 方法：制备组织匀浆：取心肌组织，加入40mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.2)20%(W:V),匀浆，4℃离心，20min;取上清液，按20%体积比，将上清液加入含1.6μmol/L HbO2,200μmol/L CaCl2,1mmol/L MgCl2,100μmol/L L-Arg,100μmol/L NADPH,50μmol/L L-缬氨酸，40mmol/L KPO3的反应缓冲液中，立即计时，振荡，比色。比色：先用401nm测定一个样品，再用421nm测定另一个样品，记录时间应一致，同样每隔30秒记录OD值，共记录到30min(每分钟OD值可以任意选择间隔时间，但必须是1min)，对照用40mmol/L磷酸外缓冲液(pH7.2)2.4ml加组织匀浆提取上清液0.6ml。
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1.4.3 计算：NOS活性单位：每克组织每分钟产生NO量(nmol.min-1.g-1)来表示，计算公式：NOS活性=[(a-b)-(a′-b′)]×194.3(a:30秒时401nm处吸光值，b:30秒时421nm处吸光值，a′：90秒时401nm处吸光值，b′:90秒时421nm处吸光值)。
1.5 统计学处理 计量资料以平均值±标准差表示(
±s)，样本均数的比较用t检验。
2 结果
2.1 腹主动脉—后腔静脉造瘘10周后，大鼠左室收缩压，左室等容相室内压变化最大速率均降低，左室舒张末压升高(表1)；心输出量增加，pCO及CORF降低(表2)，表明容量超负荷心功能不全模型已建立。
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表1 SO组与CD组大鼠左心室收缩、舒张功能的变化(±s)
n(只)
HR
(次/分)
MAP
(kPa)
LVSP
(kPa)
+dp/dt max
(kPa/S)
LVEDP
, 百拇医药
(kPa)
-dp/dt max
(kPa)
SO
14
326±36
13.6±1.4
17.5±2.4
616±69
0.53±0.11
473±78
CD
, http://www.100md.com 32
376±30△
12.7±1.6△
14.8±1.5**
461±75**
0.77±0.25*
393±75*
注：△为与对照组比较，P>0.05;*为与对照比较，P<0.01;**为与对照比较，P<0.001表2 SO组与CD组静息时心泵功能与心泵贮备功能的比较(±s)
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n
(只)
CO
(ml/min)
pCO
(ml/min)
CORF
(%)
SO
14
54.5±6.4
160.6±24.8
195±40
, 百拇医药
CD
32
63.4±7.3**
124.5±19.0**
102±53**
注：**为与对照比较，P<0.001
2.2 心功能不全大鼠心肌组织NOS活性、血浆NO水平较对照显著升高，见表3。
表3 SO组与CD组大鼠血浆中NO的水平(±s)
SO
, 百拇医药
CD
n(只)
NO(μmol/L)
NOS(nmol.min-1.g-1)
14
19.6±3.0
0.65±0.06
32
30.5±4.2**
0.79±0.19*
注：**为与对照比较，P<0.001；*为与对照比较，P<0.05
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3 讨论
体内的NO是由L-Arg经NOS催化而成。NO为生物体内一种多功能生物信号分子，在人体正常功能调节和许多疾病的发生中起着重要作用，在不同条件下，NO可呈现出细胞保护和细胞毒性双重作用。研究发现NO可使心肌组织cGMP产生增加，激活cGMP依赖性蛋白激酶，减少细胞Ca2+内流，抑制心肌功能[5]；缺血再灌注过程产生大量的NO与心功能损害密切相关[6]，这提示过量的NO对心肌功能有抑制或损伤作用。
NOS广泛分布于机体内多种细胞、组织和器官，它分为结构型NOS和诱生型NOS，在生理情况下，心肌细胞产生的NO与心脏功能调节有关，病理情况下心肌NOS过度表达，产生大量的NO对心肌有损伤作用，实验结果提示，在心功能不全时心肌NOS活性明显升高，说明心肌NOS增加参与心功能损伤的病理生理过程。
原生型NOS主要存在于神经元、血管内皮细胞与心肌细胞等，参与机体防御免疫功能，调节心血管功能和脏器血流，参与神经信息传递等；诱生型NOS几乎分布于所有组织中，一般情况下不表达，在病理情况下可大量产生，继之生成大量的NO，介导细胞毒性作用，因此，心功不全时，心肌NOS活性增加主要是由于诱生型NOS的高表达(我们的实验已证实，将在另文发表)所致。推测诱生型NOS高表达可能与心功能不全时血液中肿瘤坏死因子等细胞因子水平增加有关[7]。而后者可诱导诱生型NOS基因的表达[8]。
, 百拇医药
参考文献
[1] Garvcia R,Diebold S.Simple,rapid and effective method of producting aortovaval shunts in the rat[J].Cardiovas Res,1990;24:430-436.
[2] 杜晓军，卢 兴，杨继声，等.心肌梗塞时心泵储备功能指标的实验研究探讨[J].中华心血管病杂志，1987；15(1)：44-46.
[3] 张 静，杨继声.慢性高输出量型心功能不全发展过程中心室舒、缩功能和顺应性的变化及其心泵功能的关系[J].中国病理生理杂志，1992；8(4)：341-345.
[4] Knowles RG,Salter M,Brooks SL,et al.Anti-inflammatory glucocorticoids inhibit the induction by endotoxin of nirtic oxide synthase in the lung,Liver and aorta of the rat[J].Biochem Biophys Res Commun,1990;172(3):1042-1048.
, 百拇医药
[5] Mery P-F,Lohmann SM,Walter U,et al.Ca2+ Current is regulated by cyclic GMP-dependent protein kinase in mammalian cardiac myocytes[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991;88(4):1197-1201.
[6] Matheis G,Shermn MP,Buckberg GD,et al.Role of L-arginine-nitric oxide pathway in myocardial reoxygenation injury[J].Am J Physiol,1992,262:16-20.
[7] Levine B,Kalman J,Mayer L,et al.Elevated circulating levels of tumor necrosis factor in severe chronic heart failure[J].N Eng J Med,1990;323(4):236-241.
[8] Balligand J L,Ungureanu-Longrois D,Simmons WW,et al.Cytokine-inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression in cardiac myocytes[J].J Biol Chem,1994,269:27580-27588., 百拇医药
单位：韩福生 于维汉 周令望 曾宪惠 曾绍娟 哈尔滨医科大学克山病研究所；邢东琦 高广道 西安医科大学病理生理教研室
关键词：一氧化氮；一氧化氮合酶；心功能不全
中国地方病学杂志990603
[摘要] 目的 探讨一氧化氮合酶(nitric oxdie synthase,NOS)在心功能不全发生机制中的意义。方法 复制容量超负荷心功能不全大鼠模型，用比色法检测了心肌NOS活性，用Griess法间接检测了一氧化氮(nitric oxide,NO)血浓度的变化。结果 心功能不全心肌NOS活性增高，血NO水平显著升高(P<0.05及P<0.001)。结论 提示NOS的改变参与了心功能不全的发生发展过程，这可能与NOS活性增加生成超量的NO通过抑制心肌收缩力、损伤心肌细胞等机制有关。
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[中图分类号] R365;Q591.9 [文献标识码] A [文章编号]1000-4955(1999)06-0408-03
Changes of nitric oxide synthase in dysfunctional rat hearts induced by volume overload
HAN Fu-sheng,XING Dong-qi,YU Wei-han,et al
(Institue of Keshan Disease,Harbin Medical Univercity,Harbin 150086,China)
[Abstract] Objective To investigate the role of nitric oxide synthase(NOS) in cardiac dysfunction.Methods The cardiac dysfunctional rat models with volume-overload was made.NOS activity was examined with colorimetric method,plasma nitric oxide(NO) was determined indirectly with Griess method.Result The results showed that NOS activity in dysfunctional myocardium increased significantly and plasma NO greatly increased as well (P<0.05 and P<0.001).Conclusions The results suggest that the change of NOS may be involved in the development of cardiac dysfunction.NOS may lead to excess NO and subsequently inhibi myocardial contraction and cause myocyte injury.
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[Key words] Nitric oxide;Nitric oxide synthase;Cardiac dysfunction
心力衰竭是诸多心脏疾病发展的终末阶段，其发病机制中循环内分泌和心脏自分泌、旁分泌的异常激活是近年来的研究热点。循环内分泌和心脏组织自分泌、旁分泌异常激活主要包括：(1)交感神经系统、肾素-血管紧张素-醛固酮系统、精氨酸血管加压素；(2)心脏的心房利钠肽、脑利肽及血管内皮细胞的血管利钠肽；(3)细胞因子；(4)内皮素与一氧化氮。本实验复制了容量超负荷心功能不全大鼠模型，通过检测心肌NOS及血浆NO水平，旨在探讨NOS在心功能不全发病机制中的生物学意义。
1 材料与方法
1.1 复制容量超负荷大鼠模型 选取体重150～180g健康SD大鼠，雌雄各半，随机分为心功能不全(cardiac dysfunction,CD)组及假手术组(sham-operation,SO)组，参照Garvcia等人的方法[1]加以改进，行腹主动脉-后腔静脉造瘘术复制容量超负荷模型，SO组只分离腹主动脉-后腔静脉，但不造瘘。术后常规饲养、观察。
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1.2 心功能测定[2，3] 大鼠饲养10周后，以RM-6000型八道生理记录仪、MFV-1200型电磁血流量计分别检测心率(HR)、平均颈动脉压(MAP)、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室等容相室内压变化最大速率(±dp/dt max)，经股静脉以40ml.kg-1.min-1速度输入37℃的无菌Tyrode溶液(NaCl8.0,KCl 0.2,CaCl2 0.2,MgCl2 0.1,NaH2PO4 0.05,NaHCO3 1.0,Glucose 1.0加去离子水至1000ml)，测左心室最大每搏量和最大每分钟输出量(peak cardiac output,pCO)，再根据容量负荷下左心室每分钟贮备量(cardiac output reverse function,CORF)=(pCO-CO)/CO×100%计算CORF。上述操作完成后，稳定10min,用无菌注射器抽取血液2ml,肝素抗凝，4℃保存备检。摘取心脏以生理盐水冲洗干净，-20℃冻存备检。
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1.3 血浆NO检测 用Griess法，试剂购自邦定公司。
1.4 NOS活性检测[4]
1.4.1 原理：L-精氨酸(L-arginine,L-Arg)在NOS作用下生成NO，后者与血红蛋白反应生成高铁血红蛋白，根据401nm与421nm波长吸光度变化，来反映NOS活性。
1.4.2 方法：制备组织匀浆：取心肌组织，加入40mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.2)20%(W:V),匀浆，4℃离心，20min;取上清液，按20%体积比，将上清液加入含1.6μmol/L HbO2,200μmol/L CaCl2,1mmol/L MgCl2,100μmol/L L-Arg,100μmol/L NADPH,50μmol/L L-缬氨酸，40mmol/L KPO3的反应缓冲液中，立即计时，振荡，比色。比色：先用401nm测定一个样品，再用421nm测定另一个样品，记录时间应一致，同样每隔30秒记录OD值，共记录到30min(每分钟OD值可以任意选择间隔时间，但必须是1min)，对照用40mmol/L磷酸外缓冲液(pH7.2)2.4ml加组织匀浆提取上清液0.6ml。
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1.4.3 计算：NOS活性单位：每克组织每分钟产生NO量(nmol.min-1.g-1)来表示，计算公式：NOS活性=[(a-b)-(a′-b′)]×194.3(a:30秒时401nm处吸光值，b:30秒时421nm处吸光值，a′：90秒时401nm处吸光值，b′:90秒时421nm处吸光值)。
1.5 统计学处理 计量资料以平均值±标准差表示(
±s)，样本均数的比较用t检验。2 结果
2.1 腹主动脉—后腔静脉造瘘10周后，大鼠左室收缩压，左室等容相室内压变化最大速率均降低，左室舒张末压升高(表1)；心输出量增加，pCO及CORF降低(表2)，表明容量超负荷心功能不全模型已建立。
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表1 SO组与CD组大鼠左心室收缩、舒张功能的变化(
±s)n(只)
HR
(次/分)
MAP
(kPa)
LVSP
(kPa)
+dp/dt max
(kPa/S)
LVEDP
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(kPa)
-dp/dt max
(kPa)
SO
14
326±36
13.6±1.4
17.5±2.4
616±69
0.53±0.11
473±78
CD
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376±30△
12.7±1.6△
14.8±1.5**
461±75**
0.77±0.25*
393±75*
注：△为与对照组比较，P>0.05;*为与对照比较，P<0.01;**为与对照比较，P<0.001表2 SO组与CD组静息时心泵功能与心泵贮备功能的比较(
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n
(只)
CO
(ml/min)
pCO
(ml/min)
CORF
(%)
SO
14
54.5±6.4
160.6±24.8
195±40
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CD
32
63.4±7.3**
124.5±19.0**
102±53**
注：**为与对照比较，P<0.001
2.2 心功能不全大鼠心肌组织NOS活性、血浆NO水平较对照显著升高，见表3。
表3 SO组与CD组大鼠血浆中NO的水平(
±s)SO
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CD
n(只)
NO(μmol/L)
NOS(nmol.min-1.g-1)
14
19.6±3.0
0.65±0.06
32
30.5±4.2**
0.79±0.19*
注：**为与对照比较，P<0.001；*为与对照比较，P<0.05
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3 讨论
体内的NO是由L-Arg经NOS催化而成。NO为生物体内一种多功能生物信号分子，在人体正常功能调节和许多疾病的发生中起着重要作用，在不同条件下，NO可呈现出细胞保护和细胞毒性双重作用。研究发现NO可使心肌组织cGMP产生增加，激活cGMP依赖性蛋白激酶，减少细胞Ca2+内流，抑制心肌功能[5]；缺血再灌注过程产生大量的NO与心功能损害密切相关[6]，这提示过量的NO对心肌功能有抑制或损伤作用。
NOS广泛分布于机体内多种细胞、组织和器官，它分为结构型NOS和诱生型NOS，在生理情况下，心肌细胞产生的NO与心脏功能调节有关，病理情况下心肌NOS过度表达，产生大量的NO对心肌有损伤作用，实验结果提示，在心功能不全时心肌NOS活性明显升高，说明心肌NOS增加参与心功能损伤的病理生理过程。
原生型NOS主要存在于神经元、血管内皮细胞与心肌细胞等，参与机体防御免疫功能，调节心血管功能和脏器血流，参与神经信息传递等；诱生型NOS几乎分布于所有组织中，一般情况下不表达，在病理情况下可大量产生，继之生成大量的NO，介导细胞毒性作用，因此，心功不全时，心肌NOS活性增加主要是由于诱生型NOS的高表达(我们的实验已证实，将在另文发表)所致。推测诱生型NOS高表达可能与心功能不全时血液中肿瘤坏死因子等细胞因子水平增加有关[7]。而后者可诱导诱生型NOS基因的表达[8]。
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参考文献
[1] Garvcia R,Diebold S.Simple,rapid and effective method of producting aortovaval shunts in the rat[J].Cardiovas Res,1990;24:430-436.
[2] 杜晓军，卢 兴，杨继声，等.心肌梗塞时心泵储备功能指标的实验研究探讨[J].中华心血管病杂志，1987；15(1)：44-46.
[3] 张 静，杨继声.慢性高输出量型心功能不全发展过程中心室舒、缩功能和顺应性的变化及其心泵功能的关系[J].中国病理生理杂志，1992；8(4)：341-345.
[4] Knowles RG,Salter M,Brooks SL,et al.Anti-inflammatory glucocorticoids inhibit the induction by endotoxin of nirtic oxide synthase in the lung,Liver and aorta of the rat[J].Biochem Biophys Res Commun,1990;172(3):1042-1048.
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[5] Mery P-F,Lohmann SM,Walter U,et al.Ca2+ Current is regulated by cyclic GMP-dependent protein kinase in mammalian cardiac myocytes[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991;88(4):1197-1201.
[6] Matheis G,Shermn MP,Buckberg GD,et al.Role of L-arginine-nitric oxide pathway in myocardial reoxygenation injury[J].Am J Physiol,1992,262:16-20.
[7] Levine B,Kalman J,Mayer L,et al.Elevated circulating levels of tumor necrosis factor in severe chronic heart failure[J].N Eng J Med,1990;323(4):236-241.
[8] Balligand J L,Ungureanu-Longrois D,Simmons WW,et al.Cytokine-inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression in cardiac myocytes[J].J Biol Chem,1994,269:27580-27588., 百拇医药