实验性变态反应性神经炎周围神经浸润CD4(+)T细胞的凋亡
作者：彭永 肖波 冯德云 杨欢 资小宏 谢光洁
单位：(第三附属医院神经内科 长沙 410013)
关键词：神经炎；实验性变应性；T淋巴细胞亚群；细胞凋亡；周围神经；免疫组织化学；原位末端标记法；疾病模型；动物；大鼠；Wistar
湖南医科大学学报990612
提要 为探讨实验性变态反应性神经炎(EAN)中周围神经浸润CD4(+)T细胞的凋亡，应用免疫组织化学和原位末端标记法动态检测不同发病阶段EAN大鼠坐骨神经浸润CD4(+)T细胞的形态学改变及断裂的DNA片段。结果发现具有凋亡形态学特征的浸润CD4(+)T细胞于免疫后第18d出现，在第22d达高峰后下降，第30d基本消失。原位末端标记法证实凋亡CD4(+)T细胞中存在断裂的DNA片段。提示CD4(+)T细胞凋亡是EAN浸润CD4(+)T细胞的重要清除机制。
, 百拇医药
中国图书分类号 R331.144
Apoptosis of CD4(+) T cells during experimental
autoi mmune neuritis in Wistar rats
Peng Yong Zi Xiaohong
(Department of Neurology, The Third Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410013)
Xiao Bo Yang Huan Xie Guangjie
Department of Neurology, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008
, 百拇医药
Feng Deyun
Department of Pathology, Hunan Medical University, Changsha 410078
The present study describes apoptosis of T cells in the sciatic nerve in Wistar rats with experimental autoimmune neuritis(EAN). Morphological characterizations of apoptosis were found at the 18th day from onset, peaked at the 22nd day by immunocytochemical analysis. In situ end labeling(ISEL) techniques confir med the presence of DNA fragmentation in CD4(+) T cells. It is suggested that apoptosis is an important clearance mechanism of infiltrated T cells in the peri pheral nervous system(PNS) in EAN.
, 百拇医药
Key words neuritis,experimental allergic; cell apoptosis; lym phocyte subsets; peripheral nerve; in situ end labeling; immunohistochemistry ; disease models,animal; rats,Wistar
实验性变态反应性神经炎(EAN)是一种T细胞介导的周围神经系统(PNS)自身免疫性疾病，常作为人类格林-巴利综合征的动物疾病模型[1]。其发病机制是致敏T细胞(主要为CD4(+)T细胞)通过血-神经屏障，在神经内膜与主要组织相容性抗原复合物(MHC)Ⅱ类抗原结合，导致周围神经产生炎症反应和脱髓鞘[2]。但浸润的CD4(+)T细胞在PNS中是如何被清除的，目前尚无定论。近年来研究发现凋亡与自身免疫性疾病的发生、发展和预后密切相关[3]。笔者根据凋亡细胞存在DNA片段断裂这一特性，应用原位末端标记法(ISEL)结合免疫组织化学法，动态检测EAN大鼠PNS浸润CD4(+)T细胞的形态学改变及断裂的DNA片段，观察这些细胞的凋亡阳性密度及其意义。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 蛋白酶K、弗氏完全佐剂(CFA)购自美国GibcoBRL公司；原位细胞凋亡检测试剂盒购自美国OncorTechnicalAssistance公司。小鼠抗大鼠CD4(+)单抗购自美国PharMingen公司。SP试剂盒购自福州迈新公司。
1.2 方法
1.2.1 EAN动物模型的建立[1]及标本处理 42只健康雄性Wistar大鼠(6～8周龄，重160～170g)，随机分为对照组(6只)和实验组(36只)。实验组分别于动物免疫后第7，14，18，22，26及30d处死，每组6只。实验各组足垫下注射0.1ml兔周围神经匀浆和等容量CFA。对照组用生理盐水取代兔周围神经匀浆。
动物处死后立即取坐骨神经置于10%福尔马林固定，石蜡包埋，3μm连续切片于54℃烘烤24h备用。
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1.2.2 周围神经浸润CD4(+)T细胞凋亡的检测 (1)免疫组织化学法：参照试剂盒提供的方法，根据形态学标准[4]，用SP法检测周围神经浸润CD4(+)T细胞的凋亡。阳性细胞密度计算见1.2.3。(2)原位末端检测法[5]：将切片常规脱蜡水化，2%H2O2阻断内源性过氧化物酶20min；PBS洗后，用20μg.ml15min；PBS洗5min，共3次，加平衡液室温孵育5min，吸干平衡液，加脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)工作液，加塑料盖片于37℃湿盒中孵育60min；去盖片滴加缓冲液5min以停止反应；PBS洗后，玻片置于pH6.0，柠檬酸盐缓冲液以中火档微波处理5min；过氧化物酶标记的抗地高辛抗体37℃孵育45min；PBS洗3次，每次5min，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片镜检。核固缩且呈棕黄的细胞为凋亡细胞。
1.2.3 阳性细胞密度的计算 将D16目镜放大400倍(面积为0.1024mm2)测微网网格中的阳性细胞数，每例 计数10网格，重复3次取均值为该例的凋亡细胞密度。
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1.3 统计学处理 数据用均数±标准差(
±s)表示，所有数据用方差分析进行比较。
2 结 果
2.1 临床表现及病理检查 对照组均未发病。实验组于第18d开始发病(33.3%，2/6)，第22d达最高峰(82.5%，5/6)；光镜检查周围神经发现淋巴细胞浸润明显增多，并围绕小静脉形成血管套，髓鞘片状脱失(图1)。第26d逐渐恢复(50%，3/6)，第30d动物基本恢复正常(16.6%，1/6)。
2.2 周围神经浸润CD4(+)T细胞的凋亡数 对照组未发现CD4(+)T细胞表达。实验各组CD4(+)T细胞数量与病程相平行，与凋亡细胞数量一致，凋亡率为24%(附表，图2)。具有凋亡细胞形态特征的CD4(+)T细胞(图3)于发病后第14d出现，后逐渐增多，至第22d达最高峰后降低，于第30d消失。为证实上述的细胞形态学改变是DNA断裂所致，笔者应用ISEL法在周围神经原位检测这些浸润T细胞。对照组未见凋亡细胞。实验各组阳性细胞密度与免疫组织化学方法检测的细胞凋亡率基本一致(图2)；其中第22d组可见大量棕黄色阳性细胞分布在周围神经及血管旁(图4)，阳性细胞密度明显高于其它组。
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图1 EAN组大鼠坐骨神经中大量 淋巴细胞浸润(HE，×100)
Fig. 1 Extensive infiltration of lymp hocytes in sciatic nerves of EAN rats (HE，×100)
图2 周围神经CD4(+) T细胞凋亡与EAN病程关系
Fig. 2 The relationship between apoptosis of CD4(+) T cells and the course of EAN
图3 具有凋亡细胞形态特征的CD 4(+) T细胞(免疫组化，×400)
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Fig. 3 CD4(+) T lymphocytes with th e characterizations of apoptosis
图4 神经及血管旁可见大量的棕黄色阳性细胞( ISEL，×400)
Fig. 4 A large number of yellowish-brown positive cells surrounded the blood vessel in the peripheral nerves (ISEL,×400)
附表 周围神经CD4(+) T细胞与EAN病程的关系(±s)
CD4(+) T细胞
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凋亡细胞
(免疫组化)
凋亡细胞
(ISEL法)
对照组
0
0
0
第7d
0
0
0
第14d
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3.0±0.3
1.5±0.2
1.6±0.3
第18d
12.2±0.4
3.2±0.2
3.1±0.2
第22d
25.1±0.4①
6.2±0.3①
5.1±0.2①
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第26d
13.9±0.3
4.1±0.2
3.9±0.2
第30d
2.0±0.1
0
0
与其他组比较：①P<0.01
3 讨 论
EAN是一种自身免疫性疾病的动物疾病模型。EAN中的T细胞在胸腺内逃避凋亡后进入血液，然后浸润于PNS中[6]。此时致敏的T细胞误认自身髓鞘蛋白为异己抗原，通过一系列的细胞免疫杀伤机制破坏髓鞘。但这些T细胞浸润于PNS后是如何被清除的，目前尚不清楚。笔者曾发现EAN中浸润T细胞主要是CD4(+)T细胞[2]。本实验发现，浸润CD4(+)T细胞随着病情的进展而逐渐增多，在第22d时为最高，此后逐渐降低，至第30d基本消失。同时凋亡的CD4(+)T细胞与EAN病程相一致，应用ISEL法证实上述CD4(+)T细胞存在DNA的断裂片段。由此推断EAN中浸润T细胞主要是通过凋亡方式被清除。
, 百拇医药
有人发现在多发性硬化的动物疾病模型，即实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)中细胞凋亡是中枢神经系统(CNS)浸润T细胞的主要清除机制，并发现T细胞凋亡仅局限于CNS的炎性组织中[7]。笔者在PNS中也发现类似机制，但本实验EAN的T细胞凋亡率(24%)远低于Schmied报道的EAE中者(49%)[8]。作者认为可能与两种疾病中抗原递呈细胞的不同有关，在EAN中，浸润T细胞接触的是雪旺细胞，后者分泌IL-1，可以减轻T细胞凋亡；而在EAE中，抗原递呈细胞主要为星形胶质细胞，此种胶质细胞能从类固醇前体合成神经类固醇，后者可增强T细胞凋亡[9]。
本文表明增强浸润T细胞的凋亡，可能具有减轻EAN发病的作用，这为临床治疗人类格林-巴利综合征开辟了新的途径。
参 考 文 献
1 王翠娣，郭玉璞.实验性变态反应性神经炎动物模型的建立和病理特点.中华神经精神科杂志，1995，28：202～205
, http://www.100md.com
2 杨欢，李静，肖波，等.T细胞亚群及粘附分子在实验性变态反应性神经炎中的作用.中 华神经精神科杂志，1998，31：44～47
3 Wadsworth S, Yui K, Siegel RM, et al. Origin and selection of peripheral CD4-, CD8- T cell bearing α/β T cell antigen receptors in autoimmune gld mice. Eur J Immunol, 1990,20:723～730
4 Gehrmann J, Gold R, Linington C, et al. Spinal cord microglia in experime ntal allergic neuritis: Evidence for fast abd remote activation. Lab Invest, 1992,67:100～113
, 百拇医药
5 Gevrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA, et al. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragment. J Cell Biol, 1992,119:493～500
6 Zettl UK, Gold R, Toylca KV, et al. In situ demonstration of T cell activation and elimination in the peripheral nervous system during experimental autoi mmune neuritis in the Lewis rat. Acta Neuropathol, 1996,91:360～367
7 Pender MP, Nguyen KB, McCombe PA, et al. Apoptosis in the nervous system in experimental allergic encephalomyelitis. J Neuro Sci, 1991,104:81～87
, 百拇医药
8 Schmied M, Breitschopf H, Gold R, et al. Apoptosis of T lymphocytes in ex perimental autoimmune encephalomyelitis: Evidence for programmed cell death as a mechanism to control inflammation in the brain. Am J Pathol, 1993,143:446～452
9 Kabbadj K, El-Etr M, Baulien EE, et al. Pregnenolone metabolism in rodent embryonic neurons and astrocytes. Glia, 1993,7:170～175, 百拇医药
单位：(第三附属医院神经内科 长沙 410013)
关键词：神经炎；实验性变应性；T淋巴细胞亚群；细胞凋亡；周围神经；免疫组织化学；原位末端标记法；疾病模型；动物；大鼠；Wistar
湖南医科大学学报990612
提要 为探讨实验性变态反应性神经炎(EAN)中周围神经浸润CD4(+)T细胞的凋亡，应用免疫组织化学和原位末端标记法动态检测不同发病阶段EAN大鼠坐骨神经浸润CD4(+)T细胞的形态学改变及断裂的DNA片段。结果发现具有凋亡形态学特征的浸润CD4(+)T细胞于免疫后第18d出现，在第22d达高峰后下降，第30d基本消失。原位末端标记法证实凋亡CD4(+)T细胞中存在断裂的DNA片段。提示CD4(+)T细胞凋亡是EAN浸润CD4(+)T细胞的重要清除机制。
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中国图书分类号 R331.144
Apoptosis of CD4(+) T cells during experimental
autoi mmune neuritis in Wistar rats
Peng Yong Zi Xiaohong
(Department of Neurology, The Third Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410013)
Xiao Bo Yang Huan Xie Guangjie
Department of Neurology, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008
, 百拇医药
Feng Deyun
Department of Pathology, Hunan Medical University, Changsha 410078
The present study describes apoptosis of T cells in the sciatic nerve in Wistar rats with experimental autoimmune neuritis(EAN). Morphological characterizations of apoptosis were found at the 18th day from onset, peaked at the 22nd day by immunocytochemical analysis. In situ end labeling(ISEL) techniques confir med the presence of DNA fragmentation in CD4(+) T cells. It is suggested that apoptosis is an important clearance mechanism of infiltrated T cells in the peri pheral nervous system(PNS) in EAN.
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Key words neuritis,experimental allergic; cell apoptosis; lym phocyte subsets; peripheral nerve; in situ end labeling; immunohistochemistry ; disease models,animal; rats,Wistar
实验性变态反应性神经炎(EAN)是一种T细胞介导的周围神经系统(PNS)自身免疫性疾病，常作为人类格林-巴利综合征的动物疾病模型[1]。其发病机制是致敏T细胞(主要为CD4(+)T细胞)通过血-神经屏障，在神经内膜与主要组织相容性抗原复合物(MHC)Ⅱ类抗原结合，导致周围神经产生炎症反应和脱髓鞘[2]。但浸润的CD4(+)T细胞在PNS中是如何被清除的，目前尚无定论。近年来研究发现凋亡与自身免疫性疾病的发生、发展和预后密切相关[3]。笔者根据凋亡细胞存在DNA片段断裂这一特性，应用原位末端标记法(ISEL)结合免疫组织化学法，动态检测EAN大鼠PNS浸润CD4(+)T细胞的形态学改变及断裂的DNA片段，观察这些细胞的凋亡阳性密度及其意义。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 蛋白酶K、弗氏完全佐剂(CFA)购自美国GibcoBRL公司；原位细胞凋亡检测试剂盒购自美国OncorTechnicalAssistance公司。小鼠抗大鼠CD4(+)单抗购自美国PharMingen公司。SP试剂盒购自福州迈新公司。
1.2 方法
1.2.1 EAN动物模型的建立[1]及标本处理 42只健康雄性Wistar大鼠(6～8周龄，重160～170g)，随机分为对照组(6只)和实验组(36只)。实验组分别于动物免疫后第7，14，18，22，26及30d处死，每组6只。实验各组足垫下注射0.1ml兔周围神经匀浆和等容量CFA。对照组用生理盐水取代兔周围神经匀浆。
动物处死后立即取坐骨神经置于10%福尔马林固定，石蜡包埋，3μm连续切片于54℃烘烤24h备用。
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1.2.2 周围神经浸润CD4(+)T细胞凋亡的检测 (1)免疫组织化学法：参照试剂盒提供的方法，根据形态学标准[4]，用SP法检测周围神经浸润CD4(+)T细胞的凋亡。阳性细胞密度计算见1.2.3。(2)原位末端检测法[5]：将切片常规脱蜡水化，2%H2O2阻断内源性过氧化物酶20min；PBS洗后，用20μg.ml15min；PBS洗5min，共3次，加平衡液室温孵育5min，吸干平衡液，加脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)工作液，加塑料盖片于37℃湿盒中孵育60min；去盖片滴加缓冲液5min以停止反应；PBS洗后，玻片置于pH6.0，柠檬酸盐缓冲液以中火档微波处理5min；过氧化物酶标记的抗地高辛抗体37℃孵育45min；PBS洗3次，每次5min，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片镜检。核固缩且呈棕黄的细胞为凋亡细胞。
1.2.3 阳性细胞密度的计算 将D16目镜放大400倍(面积为0.1024mm2)测微网网格中的阳性细胞数，每例 计数10网格，重复3次取均值为该例的凋亡细胞密度。
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1.3 统计学处理 数据用均数±标准差(
±s)表示，所有数据用方差分析进行比较。2 结 果
2.1 临床表现及病理检查 对照组均未发病。实验组于第18d开始发病(33.3%，2/6)，第22d达最高峰(82.5%，5/6)；光镜检查周围神经发现淋巴细胞浸润明显增多，并围绕小静脉形成血管套，髓鞘片状脱失(图1)。第26d逐渐恢复(50%，3/6)，第30d动物基本恢复正常(16.6%，1/6)。
2.2 周围神经浸润CD4(+)T细胞的凋亡数 对照组未发现CD4(+)T细胞表达。实验各组CD4(+)T细胞数量与病程相平行，与凋亡细胞数量一致，凋亡率为24%(附表，图2)。具有凋亡细胞形态特征的CD4(+)T细胞(图3)于发病后第14d出现，后逐渐增多，至第22d达最高峰后降低，于第30d消失。为证实上述的细胞形态学改变是DNA断裂所致，笔者应用ISEL法在周围神经原位检测这些浸润T细胞。对照组未见凋亡细胞。实验各组阳性细胞密度与免疫组织化学方法检测的细胞凋亡率基本一致(图2)；其中第22d组可见大量棕黄色阳性细胞分布在周围神经及血管旁(图4)，阳性细胞密度明显高于其它组。
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图1 EAN组大鼠坐骨神经中大量 淋巴细胞浸润(HE，×100)
Fig. 1 Extensive infiltration of lymp hocytes in sciatic nerves of EAN rats (HE，×100)
图2 周围神经CD4(+) T细胞凋亡与EAN病程关系
Fig. 2 The relationship between apoptosis of CD4(+) T cells and the course of EAN
图3 具有凋亡细胞形态特征的CD 4(+) T细胞(免疫组化，×400)
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Fig. 3 CD4(+) T lymphocytes with th e characterizations of apoptosis
图4 神经及血管旁可见大量的棕黄色阳性细胞( ISEL，×400)
Fig. 4 A large number of yellowish-brown positive cells surrounded the blood vessel in the peripheral nerves (ISEL,×400)
附表 周围神经CD4(+) T细胞与EAN病程的关系(
±s)CD4(+) T细胞
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凋亡细胞
(免疫组化)
凋亡细胞
(ISEL法)
对照组
0
0
0
第7d
0
0
0
第14d
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3.0±0.3
1.5±0.2
1.6±0.3
第18d
12.2±0.4
3.2±0.2
3.1±0.2
第22d
25.1±0.4①
6.2±0.3①
5.1±0.2①
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第26d
13.9±0.3
4.1±0.2
3.9±0.2
第30d
2.0±0.1
0
0
与其他组比较：①P<0.01
3 讨 论
EAN是一种自身免疫性疾病的动物疾病模型。EAN中的T细胞在胸腺内逃避凋亡后进入血液，然后浸润于PNS中[6]。此时致敏的T细胞误认自身髓鞘蛋白为异己抗原，通过一系列的细胞免疫杀伤机制破坏髓鞘。但这些T细胞浸润于PNS后是如何被清除的，目前尚不清楚。笔者曾发现EAN中浸润T细胞主要是CD4(+)T细胞[2]。本实验发现，浸润CD4(+)T细胞随着病情的进展而逐渐增多，在第22d时为最高，此后逐渐降低，至第30d基本消失。同时凋亡的CD4(+)T细胞与EAN病程相一致，应用ISEL法证实上述CD4(+)T细胞存在DNA的断裂片段。由此推断EAN中浸润T细胞主要是通过凋亡方式被清除。
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有人发现在多发性硬化的动物疾病模型，即实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)中细胞凋亡是中枢神经系统(CNS)浸润T细胞的主要清除机制，并发现T细胞凋亡仅局限于CNS的炎性组织中[7]。笔者在PNS中也发现类似机制，但本实验EAN的T细胞凋亡率(24%)远低于Schmied报道的EAE中者(49%)[8]。作者认为可能与两种疾病中抗原递呈细胞的不同有关，在EAN中，浸润T细胞接触的是雪旺细胞，后者分泌IL-1，可以减轻T细胞凋亡；而在EAE中，抗原递呈细胞主要为星形胶质细胞，此种胶质细胞能从类固醇前体合成神经类固醇，后者可增强T细胞凋亡[9]。
本文表明增强浸润T细胞的凋亡，可能具有减轻EAN发病的作用，这为临床治疗人类格林-巴利综合征开辟了新的途径。
参 考 文 献
1 王翠娣，郭玉璞.实验性变态反应性神经炎动物模型的建立和病理特点.中华神经精神科杂志，1995，28：202～205
, http://www.100md.com
2 杨欢，李静，肖波，等.T细胞亚群及粘附分子在实验性变态反应性神经炎中的作用.中 华神经精神科杂志，1998，31：44～47
3 Wadsworth S, Yui K, Siegel RM, et al. Origin and selection of peripheral CD4-, CD8- T cell bearing α/β T cell antigen receptors in autoimmune gld mice. Eur J Immunol, 1990,20:723～730
4 Gehrmann J, Gold R, Linington C, et al. Spinal cord microglia in experime ntal allergic neuritis: Evidence for fast abd remote activation. Lab Invest, 1992,67:100～113
, 百拇医药
5 Gevrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA, et al. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragment. J Cell Biol, 1992,119:493～500
6 Zettl UK, Gold R, Toylca KV, et al. In situ demonstration of T cell activation and elimination in the peripheral nervous system during experimental autoi mmune neuritis in the Lewis rat. Acta Neuropathol, 1996,91:360～367
7 Pender MP, Nguyen KB, McCombe PA, et al. Apoptosis in the nervous system in experimental allergic encephalomyelitis. J Neuro Sci, 1991,104:81～87
, 百拇医药
8 Schmied M, Breitschopf H, Gold R, et al. Apoptosis of T lymphocytes in ex perimental autoimmune encephalomyelitis: Evidence for programmed cell death as a mechanism to control inflammation in the brain. Am J Pathol, 1993,143:446～452
9 Kabbadj K, El-Etr M, Baulien EE, et al. Pregnenolone metabolism in rodent embryonic neurons and astrocytes. Glia, 1993,7:170～175, 百拇医药