p16基因的表达和突变与卵巢恶性肿瘤的发展
作者：张 瑜 杨 湛
单位：张瑜 (附属湘雅医院妇产科 长沙 410008)；曹 亚 (肿瘤研究所 长沙 410078)
关键词：卵巢肿瘤；p16；PCR；基因表达；免疫组织化学
湖南医科大学学报990610 提要 分别应用免疫组织化学和PCR-SSCP方法检测14例卵巢恶性肿瘤中p16蛋白的表达及p16基因外显子1和外显子2基因突变，其中5例还同时检测转移灶癌组织。结果示7例卵巢恶性肿瘤组织为p16蛋白表达阴性；无一例有p16基因外显子1突变；4例有p16基因外显子2突变，其中2例无p16蛋白表达；5例转移灶癌组织的基因突变和蛋白质表达与原发灶一致。提示部分卵巢恶性肿瘤的发生和发展与p16基因的失活有关，基因突变是其中一种失活方式；卵巢恶性肿瘤中p16基因突变发生在转移前，而非转移后。
中国图书分类号 R737.31
, http://www.100md.com
Mutation and expression of p16 in human ovarian neoplasms
Zhang Yu Yang Zhan
(Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
Chao Ya
Institute of Cancer Research, Hunan Medical University, Changsha 410078
Objectives: To detect mutation and expression of p16 in human ovariann eoplasms and to understand the relations between p16 and development of ovarian neoplasms. Methods: Polymerase chain reaction-single strand polymophism analysis and immunohistochemistry were respectively used to detect mutations in exon 1 and 2 and protein expession in 14 patients with ovarian neoplasms. Matastasis tissue of 5 mentioned patients were screened at the same time. Results: No expression of p16 was found in 7 ovarian neoplasm tissues. No mutation in exon 1 of p16 was found in any patient tissues, but mutations in exon 2 were found in 4 patie nts tissues and expression of p16 was not found in 2 of them. There was correspondence between primary focus and metastasis in either gene mutation or protein expression. Conclusions: Inactivation of p16 may be involved in the development of ovarian neoplasms. Gene mutation is a kind of inactivation. Alterations of p16 probably occur before matastasis.
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Key words ovarian neoplasms; p16; gene expression; immunohi stochemistry; polymerase chain reaction
p16(CDKN2，MTS1，INK4a)是一种直接参与细胞周期调节的抑瘤基因，在不同来源的肿瘤中存在多种失活形式[1]。卵巢癌细胞系中p16的纯合性缺失率为29%。目前尚未见同时从基因与蛋白质水平来研究p16基因与卵巢恶性肿瘤发生、发展关系的研究。本研究选择严格的自身配对标本，同时应用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)和免疫组织化学方法检测了14例卵巢恶性肿瘤组织中p16基因外显子1和2的突变及p16蛋白的表达，以 探讨其与卵巢恶性肿瘤的发生发展过程的关系。
1 资料与方法
1.1 标本来源 14例卵巢恶性肿瘤患者肿瘤组织取自附属湘雅医院和湖南省肿瘤医院1996年3～9月手术病人。每例病人同时取外周血或对侧正常卵巢、子宫组织作为自身对照。卵巢恶性肿瘤病人均为未接受过化疗或放疗的首次住院手术病人，3例内胚窦瘤，1例睾丸母细胞瘤，1例恶性畸胎瘤，1例恶性勃勒纳氏瘤，8例浆液性腺癌。同时收集其中5例病人的转移灶组织标本。所有病人按FIGO1985年制定的分类法进行临床分期(Ⅱ期2例，Ⅲ期10例，Ⅳ期2例)。6例正常对照卵巢组织均为非卵巢疾病手术切除标本。
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1.2 实验方法
1.2.1 活检组织、外周血DNA的提取 按常规方法，采用蛋白酶K消化，苯酚/氯仿/异戊醇抽提，RNA酶消化去RNA，乙醇沉淀后用TE溶解，紫外分光光度计定量，4℃保存备用。
1.2.2 PCR扩增 扩增p16基因外显子1和2的两对引物由上海细胞生物所赛尔公司合成，序列及扩增的产物长见附表。50μl反应体系含KCl50mmol，MgCl21.5mmol，dNTPs200μmol，Tris.HCl10mmolpH8.0，引物各0.4μmol，TaqDNA聚合酶1.5U，模板DNA0.2μg，50μl石蜡油覆盖后，94℃变性5min，然后在PCR上95℃50s，58℃50s，72℃50s，共进行35个循环。阴性对照用空白TE代替模板DNA。PCR完成后取5μl产物在含0.5μg.ml-1溴乙锭的1.5%普通琼脂糖凝胶上进行电泳，观察结果，其余置4℃备用。
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附表 p16基因各引物序列 扩增片段
名称
序列
片段
Exon1
eo1
eo2
GAAGAAAGAGGAGGGGATG
GCGCTACCTGATTCCAATTC
350bp
Exon2
eo3
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eo4
CATTCTGTTCTCTCTGGCAG
CTCAGATCATCAGTCCTCAC
347bp
1.2.3 单链构象多态性分析 取5μlPCR产物加等量的变性缓冲液(95%甲酰胺，20mmolEDTA，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青FF)混匀，98℃变性5min后迅速置酒精冰上3min，取4～6μl上述混合液上样于6%～8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=49∶1，不含或含5%～10%的甘油，用TEMED催化和10%过硫酸铵促进聚合)，用1×TBE作电泳缓冲液，300V恒压，4℃冷柜中电泳4～5h后，取下凝胶，按下列程序显色：10%乙醇固定10min，1%硝酸5min，去离子水漂洗2次，0.2%硝酸银20min，再用去离子水漂洗1 次，3%碳酸钠(含0.05%甲醛)显色。每个样品重复3次。
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1.2.4 免疫组织化学 取组织石蜡切片按常规ABC法进行免疫组化分析。一抗为p16多克隆抗体(美国SantaCruz生命技术公司产品)，抗原决定簇位于p16蛋白C末端的第128～147位氨基酸。每次实验均选用p16蛋白强表达的宫颈癌组织切片为阳性对照，用PBS代替一抗作空白对照，以细胞核有棕黄着色为阳性标准，仅胞浆着色或个别坏死细胞、周边着色细胞均不计入阳性细胞。按阳性细胞数占癌细胞总数的百分比为5%～10%，11%～50%，>50%，依次分为弱阳性(+)、阳性(++)和强阳性(+++)。
2 结 果
2.1 p16基因突变分析 14例样品均未发现外显子1突变，4例样品的癌组织中检测到外显子2突变，其中2例上皮来源的肿瘤(1例浆液腺癌，1例恶性勃勒纳氏瘤)，2例生殖细胞来源肿瘤(1例内胚窦瘤，1例恶性畸胎瘤)。5例转移灶癌组织(其中2例原发灶有突变)与原发灶之间无差别(图1)。
, http://www.100md.com 2.2 p16蛋白质表达 14例样品中7例呈p16蛋白阳性(6例上皮细胞来源，1例生殖细胞来源)，另7例为p16蛋白阴性。6例正常卵巢组织的上皮均为核阳性(图2)。13/14例有不同程度的胞浆阳性着色。
2.3 卵巢恶性肿瘤中p16蛋白表达与突变的关系 在有外显子2突变的4例肿瘤中2例没有p16蛋白表达(1例浆液性腺癌，1例未成熟畸胎瘤)。在无外显子2突变的10例肿瘤中，有5例没有p16蛋白的阳性表达(2例浆液性腺癌，2例内胚窦瘤，1例睾丸母细胞瘤)，5例有p16蛋白表达(均为上皮来源浆液性腺癌)。
图1 SSCP分析卵巢恶性肿瘤组织 中p16基因外显子2突变4号及14号样品显示变异带型 N：正常对照；T：肿瘤组织；M：转 移灶癌组织；ND：未变性PCR产物对照
Fig. 1 SSCP analysis of the mutation of p16 exon 2 Sample 4 and 14 showing abnormal migration N: normal control; T: tumor; M: metastasis;ND: non-denatured PCR products
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图2 A：卵巢恶性肿瘤组织中的p16表达(×400 ) B：无p16表达的卵巢恶性肿瘤组织(×400)
Fig. 2 A: Expression of p16 in ovarian neoplasms (×400) B: No expression of p16 in ovarian neoplasms (×400)
3 讨 论
目前，已发现p16基因在许多不同来源的肿瘤中存在纯合性缺失、点突变[1]等，部分未发现p16基因结构改变的肿瘤中还发现启动子区域的甲基化[4]。本研究联合应用免疫组化和PCR-SSCP方法，同时从基因与蛋白质水平来探讨p16基因在卵巢恶性肿瘤发生、发展过程中的意义。结果表明正常卵巢均有p16蛋白表达，而7例肿瘤无p16蛋白表达。PCR-SSCP分析发现4例有外显子2突变，此前尚未见卵巢恶性肿瘤中发现p16基因突变的报道[5]。在有外显子2突变的4例标本中有2例无p16蛋白表达，据此推测，所检获的突变不能完全导致p16蛋白的不表达，但这种蛋白质并不一定具有完整的生物学活性。人们在非小细胞肺癌Calu-3细胞系中发现一个位于编码第三个锚蛋白重复序列的第83位密码子处的His-Tyr突变，编码产生一种半衰期缩短的p16蛋白，这种蛋白不能与CDK4和CDK6形成复合物[6]。
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在7例无p16蛋白表达的标本中，除2例有p16基因外显子2突变外，尚有5例既无p16蛋白的表达，同时也无基因突变，提示卵巢恶性肿瘤中可能存在基因突变之外的p16失活途径，如甲基化。外显子1和启动子区域的C，G序列发生甲基化，导致p16基因不能正常转录，这种转录抑制可用去甲基化的因子去除[7]。目前尚无卵巢恶性肿瘤中甲基化状况的报道，推测可能与部分卵巢恶性肿瘤无p16蛋白表达有关。此外，非编码区的突变也有可能导致p16蛋白的不表达，这在非小细胞肺癌细胞系的研究中得到证实[6]。
研究黑色素瘤、胰腺癌等肿瘤时发现，p16的缺失或突变与术后缓解率、化疗缓解率及肿瘤的临床进展有关[8，9]。作者检测5例转移灶癌组织时发现，原发灶有基因突变，其转移灶中亦有，原发灶无基因突变，其转移灶中亦无。蛋白质表达的结果也显示转移灶与原发部位的表达水平一致，说明p16基因的突变发生在癌组织转移之前，而非转移后。p16蛋白表达和基因突变与卵巢恶性肿瘤的组织学来源、临床分期之间的关系尚待进一步研究。
, 百拇医药
作者简介:张瑜 女 27岁 医师
参 考 文 献
1 Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tomour types. Science, 1994,264:436
2 Sun Y, Hildesheim A, Lanier AEP, et al. No point mutation but decreased e xpression of the p16/MTS1 tumor suppressor gene in nasopharyngeal carcinomas. On cogene, 1996,10:785～788
3 Geradts J, Karatazke RA, Niehans GA. Immunohistochemical detection of the cyc lin-dependent kinase inhibitor 2/multipile tumor suppressor gene(CDKN2/MTS1) pr oduct p16 INK4 in archival human solid tumors: Correlation with retinoblastoma p rotein expression. Cancer Res, 1995,55:6006～6011
, http://www.100md.com
4 Otterson GA, Khilef SN, Chen W, et al. CDKN2 gene silencing in lung cancer by DNA hypermethylation and kinetics of p16 INK4 protein induction by 5-aza 2 ′deoxycytidine. Oncogene, 1995,11:1211～1216
5 Campbell IG, Beynon G, Davis M. LOH and mutational analysis of CDKN2 in prima ry human ovarian cancers. Int J Cancer, 1995,63:222～225
6 Shapiro GI, Park JE, Edwards CD, et al. Multiple mechanisms of p16 INK4a inactivation in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Res, 1995,55:6200～6209
, 百拇医药
7 Otterson GA, Khlief SN, Chen W, et al. CDKN2 gene silencing in lung cancer by DNA hypermethylation and kinetics of p16 INK4 protein induction by 5-aza 2 ′deoxycytidine. Oncogene, 1995,11:1211～1216
8 Reed JA, Loganzo F Jr, Shea CR, et al. Loss of experssion of the p16/cycl in-dependent kinase inhibitor 2 tumor suppressor gene in melanocytic lesions co rrelates with invasive stage of tumor progression. Cancer Res, 1995,55:2713～2718
9 Bartsch D, Shellin DW, Mark P, et al. Deduced survival in patients with ductal pancreatic adenocarcinoma associated with CDKN2 mutation. J Natl Cancer In st, 1996,88:680～682
1998-10-06 收稿, http://www.100md.com
单位：张瑜 (附属湘雅医院妇产科 长沙 410008)；曹 亚 (肿瘤研究所 长沙 410078)
关键词：卵巢肿瘤；p16；PCR；基因表达；免疫组织化学
湖南医科大学学报990610 提要 分别应用免疫组织化学和PCR-SSCP方法检测14例卵巢恶性肿瘤中p16蛋白的表达及p16基因外显子1和外显子2基因突变，其中5例还同时检测转移灶癌组织。结果示7例卵巢恶性肿瘤组织为p16蛋白表达阴性；无一例有p16基因外显子1突变；4例有p16基因外显子2突变，其中2例无p16蛋白表达；5例转移灶癌组织的基因突变和蛋白质表达与原发灶一致。提示部分卵巢恶性肿瘤的发生和发展与p16基因的失活有关，基因突变是其中一种失活方式；卵巢恶性肿瘤中p16基因突变发生在转移前，而非转移后。
中国图书分类号 R737.31
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Mutation and expression of p16 in human ovarian neoplasms
Zhang Yu Yang Zhan
(Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
Chao Ya
Institute of Cancer Research, Hunan Medical University, Changsha 410078
Objectives: To detect mutation and expression of p16 in human ovariann eoplasms and to understand the relations between p16 and development of ovarian neoplasms. Methods: Polymerase chain reaction-single strand polymophism analysis and immunohistochemistry were respectively used to detect mutations in exon 1 and 2 and protein expession in 14 patients with ovarian neoplasms. Matastasis tissue of 5 mentioned patients were screened at the same time. Results: No expression of p16 was found in 7 ovarian neoplasm tissues. No mutation in exon 1 of p16 was found in any patient tissues, but mutations in exon 2 were found in 4 patie nts tissues and expression of p16 was not found in 2 of them. There was correspondence between primary focus and metastasis in either gene mutation or protein expression. Conclusions: Inactivation of p16 may be involved in the development of ovarian neoplasms. Gene mutation is a kind of inactivation. Alterations of p16 probably occur before matastasis.
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Key words ovarian neoplasms; p16; gene expression; immunohi stochemistry; polymerase chain reaction
p16(CDKN2，MTS1，INK4a)是一种直接参与细胞周期调节的抑瘤基因，在不同来源的肿瘤中存在多种失活形式[1]。卵巢癌细胞系中p16的纯合性缺失率为29%。目前尚未见同时从基因与蛋白质水平来研究p16基因与卵巢恶性肿瘤发生、发展关系的研究。本研究选择严格的自身配对标本，同时应用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)和免疫组织化学方法检测了14例卵巢恶性肿瘤组织中p16基因外显子1和2的突变及p16蛋白的表达，以 探讨其与卵巢恶性肿瘤的发生发展过程的关系。
1 资料与方法
1.1 标本来源 14例卵巢恶性肿瘤患者肿瘤组织取自附属湘雅医院和湖南省肿瘤医院1996年3～9月手术病人。每例病人同时取外周血或对侧正常卵巢、子宫组织作为自身对照。卵巢恶性肿瘤病人均为未接受过化疗或放疗的首次住院手术病人，3例内胚窦瘤，1例睾丸母细胞瘤，1例恶性畸胎瘤，1例恶性勃勒纳氏瘤，8例浆液性腺癌。同时收集其中5例病人的转移灶组织标本。所有病人按FIGO1985年制定的分类法进行临床分期(Ⅱ期2例，Ⅲ期10例，Ⅳ期2例)。6例正常对照卵巢组织均为非卵巢疾病手术切除标本。
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1.2 实验方法
1.2.1 活检组织、外周血DNA的提取 按常规方法，采用蛋白酶K消化，苯酚/氯仿/异戊醇抽提，RNA酶消化去RNA，乙醇沉淀后用TE溶解，紫外分光光度计定量，4℃保存备用。
1.2.2 PCR扩增 扩增p16基因外显子1和2的两对引物由上海细胞生物所赛尔公司合成，序列及扩增的产物长见附表。50μl反应体系含KCl50mmol，MgCl21.5mmol，dNTPs200μmol，Tris.HCl10mmolpH8.0，引物各0.4μmol，TaqDNA聚合酶1.5U，模板DNA0.2μg，50μl石蜡油覆盖后，94℃变性5min，然后在PCR上95℃50s，58℃50s，72℃50s，共进行35个循环。阴性对照用空白TE代替模板DNA。PCR完成后取5μl产物在含0.5μg.ml-1溴乙锭的1.5%普通琼脂糖凝胶上进行电泳，观察结果，其余置4℃备用。
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附表 p16基因各引物序列 扩增片段
名称
序列
片段
Exon1
eo1
eo2
GAAGAAAGAGGAGGGGATG
GCGCTACCTGATTCCAATTC
350bp
Exon2
eo3
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eo4
CATTCTGTTCTCTCTGGCAG
CTCAGATCATCAGTCCTCAC
347bp
1.2.3 单链构象多态性分析 取5μlPCR产物加等量的变性缓冲液(95%甲酰胺，20mmolEDTA，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青FF)混匀，98℃变性5min后迅速置酒精冰上3min，取4～6μl上述混合液上样于6%～8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=49∶1，不含或含5%～10%的甘油，用TEMED催化和10%过硫酸铵促进聚合)，用1×TBE作电泳缓冲液，300V恒压，4℃冷柜中电泳4～5h后，取下凝胶，按下列程序显色：10%乙醇固定10min，1%硝酸5min，去离子水漂洗2次，0.2%硝酸银20min，再用去离子水漂洗1 次，3%碳酸钠(含0.05%甲醛)显色。每个样品重复3次。
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1.2.4 免疫组织化学 取组织石蜡切片按常规ABC法进行免疫组化分析。一抗为p16多克隆抗体(美国SantaCruz生命技术公司产品)，抗原决定簇位于p16蛋白C末端的第128～147位氨基酸。每次实验均选用p16蛋白强表达的宫颈癌组织切片为阳性对照，用PBS代替一抗作空白对照，以细胞核有棕黄着色为阳性标准，仅胞浆着色或个别坏死细胞、周边着色细胞均不计入阳性细胞。按阳性细胞数占癌细胞总数的百分比为5%～10%，11%～50%，>50%，依次分为弱阳性(+)、阳性(++)和强阳性(+++)。
2 结 果
2.1 p16基因突变分析 14例样品均未发现外显子1突变，4例样品的癌组织中检测到外显子2突变，其中2例上皮来源的肿瘤(1例浆液腺癌，1例恶性勃勒纳氏瘤)，2例生殖细胞来源肿瘤(1例内胚窦瘤，1例恶性畸胎瘤)。5例转移灶癌组织(其中2例原发灶有突变)与原发灶之间无差别(图1)。
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2.3 卵巢恶性肿瘤中p16蛋白表达与突变的关系 在有外显子2突变的4例肿瘤中2例没有p16蛋白表达(1例浆液性腺癌，1例未成熟畸胎瘤)。在无外显子2突变的10例肿瘤中，有5例没有p16蛋白的阳性表达(2例浆液性腺癌，2例内胚窦瘤，1例睾丸母细胞瘤)，5例有p16蛋白表达(均为上皮来源浆液性腺癌)。
图1 SSCP分析卵巢恶性肿瘤组织 中p16基因外显子2突变4号及14号样品显示变异带型 N：正常对照；T：肿瘤组织；M：转 移灶癌组织；ND：未变性PCR产物对照
Fig. 1 SSCP analysis of the mutation of p16 exon 2 Sample 4 and 14 showing abnormal migration N: normal control; T: tumor; M: metastasis;ND: non-denatured PCR products
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图2 A：卵巢恶性肿瘤组织中的p16表达(×400 ) B：无p16表达的卵巢恶性肿瘤组织(×400)
Fig. 2 A: Expression of p16 in ovarian neoplasms (×400) B: No expression of p16 in ovarian neoplasms (×400)
3 讨 论
目前，已发现p16基因在许多不同来源的肿瘤中存在纯合性缺失、点突变[1]等，部分未发现p16基因结构改变的肿瘤中还发现启动子区域的甲基化[4]。本研究联合应用免疫组化和PCR-SSCP方法，同时从基因与蛋白质水平来探讨p16基因在卵巢恶性肿瘤发生、发展过程中的意义。结果表明正常卵巢均有p16蛋白表达，而7例肿瘤无p16蛋白表达。PCR-SSCP分析发现4例有外显子2突变，此前尚未见卵巢恶性肿瘤中发现p16基因突变的报道[5]。在有外显子2突变的4例标本中有2例无p16蛋白表达，据此推测，所检获的突变不能完全导致p16蛋白的不表达，但这种蛋白质并不一定具有完整的生物学活性。人们在非小细胞肺癌Calu-3细胞系中发现一个位于编码第三个锚蛋白重复序列的第83位密码子处的His-Tyr突变，编码产生一种半衰期缩短的p16蛋白，这种蛋白不能与CDK4和CDK6形成复合物[6]。
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在7例无p16蛋白表达的标本中，除2例有p16基因外显子2突变外，尚有5例既无p16蛋白的表达，同时也无基因突变，提示卵巢恶性肿瘤中可能存在基因突变之外的p16失活途径，如甲基化。外显子1和启动子区域的C，G序列发生甲基化，导致p16基因不能正常转录，这种转录抑制可用去甲基化的因子去除[7]。目前尚无卵巢恶性肿瘤中甲基化状况的报道，推测可能与部分卵巢恶性肿瘤无p16蛋白表达有关。此外，非编码区的突变也有可能导致p16蛋白的不表达，这在非小细胞肺癌细胞系的研究中得到证实[6]。
研究黑色素瘤、胰腺癌等肿瘤时发现，p16的缺失或突变与术后缓解率、化疗缓解率及肿瘤的临床进展有关[8，9]。作者检测5例转移灶癌组织时发现，原发灶有基因突变，其转移灶中亦有，原发灶无基因突变，其转移灶中亦无。蛋白质表达的结果也显示转移灶与原发部位的表达水平一致，说明p16基因的突变发生在癌组织转移之前，而非转移后。p16蛋白表达和基因突变与卵巢恶性肿瘤的组织学来源、临床分期之间的关系尚待进一步研究。
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作者简介:张瑜 女 27岁 医师
参 考 文 献
1 Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tomour types. Science, 1994,264:436
2 Sun Y, Hildesheim A, Lanier AEP, et al. No point mutation but decreased e xpression of the p16/MTS1 tumor suppressor gene in nasopharyngeal carcinomas. On cogene, 1996,10:785～788
3 Geradts J, Karatazke RA, Niehans GA. Immunohistochemical detection of the cyc lin-dependent kinase inhibitor 2/multipile tumor suppressor gene(CDKN2/MTS1) pr oduct p16 INK4 in archival human solid tumors: Correlation with retinoblastoma p rotein expression. Cancer Res, 1995,55:6006～6011
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4 Otterson GA, Khilef SN, Chen W, et al. CDKN2 gene silencing in lung cancer by DNA hypermethylation and kinetics of p16 INK4 protein induction by 5-aza 2 ′deoxycytidine. Oncogene, 1995,11:1211～1216
5 Campbell IG, Beynon G, Davis M. LOH and mutational analysis of CDKN2 in prima ry human ovarian cancers. Int J Cancer, 1995,63:222～225
6 Shapiro GI, Park JE, Edwards CD, et al. Multiple mechanisms of p16 INK4a inactivation in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Res, 1995,55:6200～6209
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7 Otterson GA, Khlief SN, Chen W, et al. CDKN2 gene silencing in lung cancer by DNA hypermethylation and kinetics of p16 INK4 protein induction by 5-aza 2 ′deoxycytidine. Oncogene, 1995,11:1211～1216
8 Reed JA, Loganzo F Jr, Shea CR, et al. Loss of experssion of the p16/cycl in-dependent kinase inhibitor 2 tumor suppressor gene in melanocytic lesions co rrelates with invasive stage of tumor progression. Cancer Res, 1995,55:2713～2718
9 Bartsch D, Shellin DW, Mark P, et al. Deduced survival in patients with ductal pancreatic adenocarcinoma associated with CDKN2 mutation. J Natl Cancer In st, 1996,88:680～682
1998-10-06 收稿, http://www.100md.com