自身血清抗体筛选人肝细胞癌抗原的分子辨认
作者：罗国容 刘启福 Frank Stenner Ugur Sahin
单位：530021 南宁，广西医科大学组织胚胎教研室(罗国容)；广西壮族自治区肿瘤研究所(刘启福)；Universittskliniken des saarlandes 66421 Homburg-Saar, Germary (Frank Stenner、Ugur Sahin)
关键词：
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 新近发展起的重组克隆表达抗原的血清学鉴定(SEREX)技术已成功证明了几种新的人肿瘤抗原[1]。此方法在肿瘤抗原与病人自身血清反应的基础上可直接确定抗原分子,这比传统的基因法和生物化学法前进了一步。我们使用此法在肝细胞癌也筛选出一系列特异抗原或相关抗原。现将部分人肝细胞癌(HCC)抗原的分子测定与血清分析的初步结果报道如下。
, 百拇医药
一、材料与方法
1.建立cDNA 文库：新鲜人HCC组织中提取总 RNA，mRNA 药盒制备mRNA，用Uni-λZAP II载体制作cDNA 表达文库。包装成嗜菌体后，转染到大肠杆菌(XL1-Blue MRF′)。
2.免疫筛选： 重组子转染到大肠杆菌，异丙基硫代-β-D 半乳糖苷 (IPTG) 诱导重组子表达，37℃培养12 小时。硝酸纤维膜印迹3～4小时， 质量分数为5%的低脂牛乳-Tris 缓冲液处理印迹膜1小时后行免疫染色：1∶100 病人自身血清孵育 12小时；1∶2 500碱性磷酸酶联羊抗人IgG孵育1小时；5-溴-4-氯-3吲哚磷酸和四唑氮蓝显色30分钟。
3.抗原DNA测序：阳性克隆亚克隆成单克隆后，提交到PBK-CMV嗜菌体 (Stratagene) 内剪切，用双脱氧核苷酸阻断法(用荧光标记核苷酸)在DNA荧光测序仪(DNA Sequencer MODEL 4000 L)测定 cDNA 插入片段核苷酸的顺序。DNA sis (Pharmacia)和Blast 软件校准。
, 百拇医药
4.异体血清检查：阳性克隆转染大肠杆菌后，异体血清代替自身血清行免疫染色。阴性嗜菌体作为内对照。 异体血清取样如下：肝细胞癌 4 例，成胶质细胞瘤、恶性黑色素瘤、肾细胞癌、非何杰金病性淋巴瘤、女性生殖系统恶性瘤等各4例；B 型肝炎、C型肝炎各10例；肝硬化4例，健康人20名。
二、结果
对人肝细胞癌cDNA文库的1.5×106个以上重组子进行了免疫筛选， 可见94个重组子与病人自身血清抗体有反应。初步测序结果表明,其中8个克隆未找到同源结构，9个克隆为已知结构,6个克隆只在5′末端或3′末端找到同源结构。从至今已作多种血清检查的10例抗原反应结果(表1)看，多数抗原只与HCC 病人血清有特异性反应。表中列出部分抗原同源结构检查和血清学检查结果。
表1 人肝细胞癌肿瘤抗原分子同源结构与体液免疫反应 克隆
, 百拇医药
同源结构
Hcc
Glio
Mm
Lym
Rcc
Gyn
Heal
HBV
HCV
Cir
1-8a
cgl-蛋白质动力素
, 百拇医药
4/5
0/4
0/4
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0/20
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22-5
衰化标记蛋白-30
3/5
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连结素
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3/4
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2/4
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5/10
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6-8b
14kda未知蛋白
3/5
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, http://www.100md.com
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2-5.1
DNA-结合因子
4/5
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1/4
1/4
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3/10
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2-3.2b
LDH-A乳酸脱氢酶A
4/5
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血清白蛋白
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注：Homol同源结构，Hcc肝细胞癌，Glio成胶质细胞瘤，Mm恶性黑色素瘤，Lym非何杰金病性淋巴瘤，Rcc肾细胞癌，Gyn女性生殖系恶性肿瘤，Heal健康组，HBV/HCV乙型/丙型肝炎，Cir肝硬化，表内数字中分子为抗体反应阳性例数，分母为检查例数
三、讨论
关于 HCC的特异抗原，除了病毒相关抗原以外，还鲜为人知。本研究应用新的 SEREX技术，首次筛选了多种 HCC特异抗原或相关的抗原，多数HCC肿瘤抗原的相应抗体反应只见于HCC病人，这对HCC的病理学诊断或预后有重要意义。少数抗体反应也见于非HCC病人，可能是抗原抗体交叉反应所致；少数健康人血清也与某些HCC抗原发生反应，很可能与某些炎症或病毒感染有关[1]。
, 百拇医药
为了弄清楚哪些肿瘤抗原对诊断或判断预后乃至治疗有意义，以及这些抗原与HCC组织学类型、临床参数的相关性，开展大量的血清学检查是必要的。
参考文献
1 Sahin U, Tureci O, Schmitt H, et al. Human neopasmas elicit multiple specific
immune responses in the autologous host. Proc Natl Acad Sci USA. 1995, 92:11810-11813.
收稿：1998-03-24 修回：1999-02-23, 百拇医药
单位：530021 南宁，广西医科大学组织胚胎教研室(罗国容)；广西壮族自治区肿瘤研究所(刘启福)；Universittskliniken des saarlandes 66421 Homburg-Saar, Germary (Frank Stenner、Ugur Sahin)
关键词：
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 新近发展起的重组克隆表达抗原的血清学鉴定(SEREX)技术已成功证明了几种新的人肿瘤抗原[1]。此方法在肿瘤抗原与病人自身血清反应的基础上可直接确定抗原分子,这比传统的基因法和生物化学法前进了一步。我们使用此法在肝细胞癌也筛选出一系列特异抗原或相关抗原。现将部分人肝细胞癌(HCC)抗原的分子测定与血清分析的初步结果报道如下。
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一、材料与方法
1.建立cDNA 文库：新鲜人HCC组织中提取总 RNA，mRNA 药盒制备mRNA，用Uni-λZAP II载体制作cDNA 表达文库。包装成嗜菌体后，转染到大肠杆菌(XL1-Blue MRF′)。
2.免疫筛选： 重组子转染到大肠杆菌，异丙基硫代-β-D 半乳糖苷 (IPTG) 诱导重组子表达，37℃培养12 小时。硝酸纤维膜印迹3～4小时， 质量分数为5%的低脂牛乳-Tris 缓冲液处理印迹膜1小时后行免疫染色：1∶100 病人自身血清孵育 12小时；1∶2 500碱性磷酸酶联羊抗人IgG孵育1小时；5-溴-4-氯-3吲哚磷酸和四唑氮蓝显色30分钟。
3.抗原DNA测序：阳性克隆亚克隆成单克隆后，提交到PBK-CMV嗜菌体 (Stratagene) 内剪切，用双脱氧核苷酸阻断法(用荧光标记核苷酸)在DNA荧光测序仪(DNA Sequencer MODEL 4000 L)测定 cDNA 插入片段核苷酸的顺序。DNA sis (Pharmacia)和Blast 软件校准。
, 百拇医药
4.异体血清检查：阳性克隆转染大肠杆菌后，异体血清代替自身血清行免疫染色。阴性嗜菌体作为内对照。 异体血清取样如下：肝细胞癌 4 例，成胶质细胞瘤、恶性黑色素瘤、肾细胞癌、非何杰金病性淋巴瘤、女性生殖系统恶性瘤等各4例；B 型肝炎、C型肝炎各10例；肝硬化4例，健康人20名。
二、结果
对人肝细胞癌cDNA文库的1.5×106个以上重组子进行了免疫筛选， 可见94个重组子与病人自身血清抗体有反应。初步测序结果表明,其中8个克隆未找到同源结构，9个克隆为已知结构,6个克隆只在5′末端或3′末端找到同源结构。从至今已作多种血清检查的10例抗原反应结果(表1)看，多数抗原只与HCC 病人血清有特异性反应。表中列出部分抗原同源结构检查和血清学检查结果。
表1 人肝细胞癌肿瘤抗原分子同源结构与体液免疫反应 克隆
, 百拇医药
同源结构
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注：Homol同源结构，Hcc肝细胞癌，Glio成胶质细胞瘤，Mm恶性黑色素瘤，Lym非何杰金病性淋巴瘤，Rcc肾细胞癌，Gyn女性生殖系恶性肿瘤，Heal健康组，HBV/HCV乙型/丙型肝炎，Cir肝硬化，表内数字中分子为抗体反应阳性例数，分母为检查例数
三、讨论
关于 HCC的特异抗原，除了病毒相关抗原以外，还鲜为人知。本研究应用新的 SEREX技术，首次筛选了多种 HCC特异抗原或相关的抗原，多数HCC肿瘤抗原的相应抗体反应只见于HCC病人，这对HCC的病理学诊断或预后有重要意义。少数抗体反应也见于非HCC病人，可能是抗原抗体交叉反应所致；少数健康人血清也与某些HCC抗原发生反应，很可能与某些炎症或病毒感染有关[1]。
, 百拇医药
为了弄清楚哪些肿瘤抗原对诊断或判断预后乃至治疗有意义，以及这些抗原与HCC组织学类型、临床参数的相关性，开展大量的血清学检查是必要的。
参考文献
1 Sahin U, Tureci O, Schmitt H, et al. Human neopasmas elicit multiple specific
immune responses in the autologous host. Proc Natl Acad Sci USA. 1995, 92:11810-11813.
收稿：1998-03-24 修回：1999-02-23, 百拇医药