五个完全性雄激素不敏感综合征家系雄激素受体基因突变的研究
作者：卢建 王进 陈光椿 张金山 陈丽瑜
单位：200433 上海，第二军医大学病理生理学教研室(卢建、王进、陈光椿、张金山)；广州市第一人民医院妇产科(陈丽瑜)
关键词：
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 雄激素受体(AR)是介导雄激素在靶细胞中作用的关键大分子，AR结构与功能异常是造成雄激素不敏感综合征(AIS)或雄激素抵抗征的主要原因。AIS为X连锁的隐性遗传病，分为完全型(CAIS)和不完全型，表现为程度不同的男性假两性畸形。迄今国外已报道了几十种AR基因的突变型，这些突变具有明显的异质性[1，2]。我们在国内已开展了对AIS患者AR蛋白质及基因水平的研究，并已报道了发生在国人AIS患者中的3种AR基因突变型，其中1种为国际上尚未报道的新突变[3，4]，为进一步探讨AIS发病的分子机制和了解国人AIS患者AR基因突变的特点，我们用邮寄的干血纸片直接PCR扩增AR基因，在此基础上，用SSCP和双链DNA循环测序法对来自5个CAIS家系的6例患者和7名家系成员的AR基因外显子B～H进行了突变检测。
, 百拇医药
一、对象与方法
1.对象：来自山东、广东、湖南5个家系的6个CAIS患者(CAIS7、CAIS8、CAIS10、CAIS 11、CAIS12a和12b)和7个家系成员。患者的核型为46，XY，有睾丸，表型为女性，但无女性内生殖器。血中睾酮水平正常或高于正常。对其中4个CAIS家系做了系谱分析，证实3个(CAIS7、CAIS11和CAIS12)有明显的家族史，符合X连锁的隐性遗传病的特点。
2.方法：(1)干血纸片制备：将患者耳垂或手指血滴于进口滤纸上，晾干后4℃保存备用。(2)引物：用7对引物分别扩增AR基因8个外显子中的7个(外显子B～H)，引物序列及产物长度见文献[3]。(3)干血纸片PCR直接扩增：将干血纸片剪成4×4 mm大小，置入Eppendorf管中，适量甲醇固定20分钟，真空抽干。加入PCR反应成分，总体积50 μl，内含1×Buffer[50 mmol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0), 2 mmol/L MgCl2， 0.1% Triton X-100, 0.45% NP-40, 0.45% Tween 20], dNTPs各50 μmol/L，引物各0.25 μmol/L，扩增前先在96 ℃ 5分钟，55 ℃ 5分钟重复3次，然后在80 ℃加Taq DNA聚合酶1 U，进行常规PCR反应，循环条件同文献[3]。(4)SSCP分析及DNA序列分析：方法及条件同文献[3]。
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二、结果
N为对照，10和12分别表示CAIS10和CAIS12
图1 CAIS10和CAIS12患者外显子G片段的SSCP分析结果
对6例患者及7例家族成员AR基因的7个外显子(外显子B～H)分别进行PCR扩增，结果显示，所有受检者上述外显子的PCR产物均显示与引物设计长度一致的单一条带，说明所测的外显子没有明显的插入或缺失突变。接着用SSCP分析筛选可能的点突变，结果证实患者CAIS10、CAIS12a和CAIS12b的外显子G以及患者CAIS11的外显子E片段在电泳时有泳动变位。图1显示了CAIS10和CAIS12外显子G片段的SSCP分析结果。最后经DNA序列分析证实CAIS10的AR基因在外显子G有一单碱基缺失(ΔG2881)(图2)，而CAIS11和CAIS12家系的两个患者分别在外显子E和G有一错义突变(Arg752Gln, Arg831Gln)。
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三、讨论
AIS患者AR基因突变的研究是近年来受体分子病理学研究的热点之一。AR基因位于X染色体q11～12区段，由8个外显子组成，编码AR的919个氨基酸残基。已报道的AR基因突变以点突变为主，其发生率以雄激素结合区(ABD)最高[2]。但国人AIS患者AR基因突变的特点尚不清楚。我们利用干血纸片直接扩增人AR基因的B～H 7个外显子，在此基础上，用SSCP分析及DNA测序法对5个CAIS家系的AR基因进行了突变研究。
*表示突变碱基
图2 CAIS10患者AR基因外显子G的序列分析结果
本实验证实，CAIS10患者AR基因的外显子G有一单碱基缺失(ΔG2881)，结果造成移码，使AR第840位氨基酸残基之后大片段异常，并使编码第881位氨基酸残基的密码子变成了终止密码，因此推测该突变基因的产物是一个C-末端多个氨基酸改变并缺失了39个氨基酸残基的截短AR。该突变国内外均未见报道，是一种新证实的AR基因的突变型。CAIS11的突变为Arg752Gln，同种错义突变我们以前曾有过报道[3]。本实验还证实该患者的母亲及姐姐等家系成员为该突变的携带者。CAIS12a和CAIS12b为姐妹俩，两患者AR的突变均为Arg831Gln。相同的突变国外亦有报道[2]。表明了Arg752和Arg831在AR结构与功能中的重要性及与AIS发生的密切关系。本实验证实的这3个CAIS家系患者的AR基因突变均位于编码受体雄激素结合区的外显子E或G中，这与国外报道的AIS患者AR基因突变以该区发生率为高，特别是高发于726～772和826～864位氨基酸残基之间相一致[2]。由于雄激素结合区是受体与雄激素结合所必需的，所以该部位的异常可使受体丧失配体结合和转录调节功能，不能介导雄激素诱导男性性分化发育的作用，从而导致AIS的发生。
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CAIS7和CAIS8家系的患者及成员在所测范围内没发现有突变，其原因可能是突变发生在我们尚未检测的外显子A，也可能存在AR功能所需的其他成分或受体后缺陷。本研究为阐明国人CAIS患者AR基因的突变特点及发病的分子机制提供了有意义的资料。
注释：本课题为国家自然科学基金资助项目(39270310)
参考文献
1 Brown CJ, Goss SJ, Lubahn DB, et al. Androgen receptor locus on the human X chromosome regional localization to Xq11-12 and description of a DNA polymorphism. Am J Hum Genet, 1989, 44:264-269.
2 Gottlieb B, Lehvaslaiho H, Beitel LK, et al. The androgen receptor gene mutations database. Nucleic Acids Res. 1998, 26:234-238.
3 陈光椿，卢建，徐晓春，等.七例睾丸女性化综合征患者雄激素受体基因突变的研究.第二军医大学学报，1996，17：205-209.
4 陈光椿，卢建，徐晓春，等.运用PCR-SSCP分析检测睾丸女性化综合征患者雄激素受体基因突变.中华医学遗传学杂志，1997，14：285-288.
收稿：1998-10-20 修回：1999-02-10, 百拇医药
单位：200433 上海，第二军医大学病理生理学教研室(卢建、王进、陈光椿、张金山)；广州市第一人民医院妇产科(陈丽瑜)
关键词：
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 雄激素受体(AR)是介导雄激素在靶细胞中作用的关键大分子，AR结构与功能异常是造成雄激素不敏感综合征(AIS)或雄激素抵抗征的主要原因。AIS为X连锁的隐性遗传病，分为完全型(CAIS)和不完全型，表现为程度不同的男性假两性畸形。迄今国外已报道了几十种AR基因的突变型，这些突变具有明显的异质性[1，2]。我们在国内已开展了对AIS患者AR蛋白质及基因水平的研究，并已报道了发生在国人AIS患者中的3种AR基因突变型，其中1种为国际上尚未报道的新突变[3，4]，为进一步探讨AIS发病的分子机制和了解国人AIS患者AR基因突变的特点，我们用邮寄的干血纸片直接PCR扩增AR基因，在此基础上，用SSCP和双链DNA循环测序法对来自5个CAIS家系的6例患者和7名家系成员的AR基因外显子B～H进行了突变检测。
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一、对象与方法
1.对象：来自山东、广东、湖南5个家系的6个CAIS患者(CAIS7、CAIS8、CAIS10、CAIS 11、CAIS12a和12b)和7个家系成员。患者的核型为46，XY，有睾丸，表型为女性，但无女性内生殖器。血中睾酮水平正常或高于正常。对其中4个CAIS家系做了系谱分析，证实3个(CAIS7、CAIS11和CAIS12)有明显的家族史，符合X连锁的隐性遗传病的特点。
2.方法：(1)干血纸片制备：将患者耳垂或手指血滴于进口滤纸上，晾干后4℃保存备用。(2)引物：用7对引物分别扩增AR基因8个外显子中的7个(外显子B～H)，引物序列及产物长度见文献[3]。(3)干血纸片PCR直接扩增：将干血纸片剪成4×4 mm大小，置入Eppendorf管中，适量甲醇固定20分钟，真空抽干。加入PCR反应成分，总体积50 μl，内含1×Buffer[50 mmol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0), 2 mmol/L MgCl2， 0.1% Triton X-100, 0.45% NP-40, 0.45% Tween 20], dNTPs各50 μmol/L，引物各0.25 μmol/L，扩增前先在96 ℃ 5分钟，55 ℃ 5分钟重复3次，然后在80 ℃加Taq DNA聚合酶1 U，进行常规PCR反应，循环条件同文献[3]。(4)SSCP分析及DNA序列分析：方法及条件同文献[3]。
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二、结果
N为对照，10和12分别表示CAIS10和CAIS12
图1 CAIS10和CAIS12患者外显子G片段的SSCP分析结果
对6例患者及7例家族成员AR基因的7个外显子(外显子B～H)分别进行PCR扩增，结果显示，所有受检者上述外显子的PCR产物均显示与引物设计长度一致的单一条带，说明所测的外显子没有明显的插入或缺失突变。接着用SSCP分析筛选可能的点突变，结果证实患者CAIS10、CAIS12a和CAIS12b的外显子G以及患者CAIS11的外显子E片段在电泳时有泳动变位。图1显示了CAIS10和CAIS12外显子G片段的SSCP分析结果。最后经DNA序列分析证实CAIS10的AR基因在外显子G有一单碱基缺失(ΔG2881)(图2)，而CAIS11和CAIS12家系的两个患者分别在外显子E和G有一错义突变(Arg752Gln, Arg831Gln)。
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三、讨论
AIS患者AR基因突变的研究是近年来受体分子病理学研究的热点之一。AR基因位于X染色体q11～12区段，由8个外显子组成，编码AR的919个氨基酸残基。已报道的AR基因突变以点突变为主，其发生率以雄激素结合区(ABD)最高[2]。但国人AIS患者AR基因突变的特点尚不清楚。我们利用干血纸片直接扩增人AR基因的B～H 7个外显子，在此基础上，用SSCP分析及DNA测序法对5个CAIS家系的AR基因进行了突变研究。
*表示突变碱基
图2 CAIS10患者AR基因外显子G的序列分析结果
本实验证实，CAIS10患者AR基因的外显子G有一单碱基缺失(ΔG2881)，结果造成移码，使AR第840位氨基酸残基之后大片段异常，并使编码第881位氨基酸残基的密码子变成了终止密码，因此推测该突变基因的产物是一个C-末端多个氨基酸改变并缺失了39个氨基酸残基的截短AR。该突变国内外均未见报道，是一种新证实的AR基因的突变型。CAIS11的突变为Arg752Gln，同种错义突变我们以前曾有过报道[3]。本实验还证实该患者的母亲及姐姐等家系成员为该突变的携带者。CAIS12a和CAIS12b为姐妹俩，两患者AR的突变均为Arg831Gln。相同的突变国外亦有报道[2]。表明了Arg752和Arg831在AR结构与功能中的重要性及与AIS发生的密切关系。本实验证实的这3个CAIS家系患者的AR基因突变均位于编码受体雄激素结合区的外显子E或G中，这与国外报道的AIS患者AR基因突变以该区发生率为高，特别是高发于726～772和826～864位氨基酸残基之间相一致[2]。由于雄激素结合区是受体与雄激素结合所必需的，所以该部位的异常可使受体丧失配体结合和转录调节功能，不能介导雄激素诱导男性性分化发育的作用，从而导致AIS的发生。
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CAIS7和CAIS8家系的患者及成员在所测范围内没发现有突变，其原因可能是突变发生在我们尚未检测的外显子A，也可能存在AR功能所需的其他成分或受体后缺陷。本研究为阐明国人CAIS患者AR基因的突变特点及发病的分子机制提供了有意义的资料。
注释：本课题为国家自然科学基金资助项目(39270310)
参考文献
1 Brown CJ, Goss SJ, Lubahn DB, et al. Androgen receptor locus on the human X chromosome regional localization to Xq11-12 and description of a DNA polymorphism. Am J Hum Genet, 1989, 44:264-269.
2 Gottlieb B, Lehvaslaiho H, Beitel LK, et al. The androgen receptor gene mutations database. Nucleic Acids Res. 1998, 26:234-238.
3 陈光椿，卢建，徐晓春，等.七例睾丸女性化综合征患者雄激素受体基因突变的研究.第二军医大学学报，1996，17：205-209.
4 陈光椿，卢建，徐晓春，等.运用PCR-SSCP分析检测睾丸女性化综合征患者雄激素受体基因突变.中华医学遗传学杂志，1997，14：285-288.
收稿：1998-10-20 修回：1999-02-10, 百拇医药