Bcl-2反义寡核苷酸诱导HL-60细胞凋亡的研究
作者：王丹红，艾辉胜，孙志贤，林汝仙，骈潍媛，王升启
单位：王丹红，艾辉胜，骈潍媛，解放军307医院(北京，100039)；孙志贤，林汝仙，王升启 军事医学科学院放射医学研究所(北京，100039)
关键词：bcl-2反义寡核苷酸；HL-60细胞；细胞凋亡
癌症990617
【摘要】目的：探讨bcl-2反义寡核苷酸诱导HL-60细胞的凋亡。方法：将人工合成的bcl-2反义寡聚脱氧核苷酸片段与HL-60细胞共培养，在作用的第0天、3天、5天通过免疫组化法(APAAP法)检测细胞内bcl-2蛋白表达水平的变化，通过流式细胞仪分析细胞凋亡的情况。结果：bcl-2反义寡核苷酸可下调HL-60细胞内bcl-2的蛋白表达水平，其作用与其浓度和时间呈正相关，同时可诱导细胞凋亡，而bcl-2正义寡核苷酸及对照无此作用。结论：bcl-2反义寡核苷酸诱导HL-60细胞凋亡的主要机制之一是下调bcl-2蛋白表达水平。
, 百拇医药
中图分类号：R318.12 文献标识码：A 文献编号：1000-467X(1999)06-0683-03
Bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides induce HL-60 cells apoptosis
WANG Dan-hong，AI Hui-sheng，SUN Zhi-xian，et al.
P.L.A.No.307 Hospital，Beijing 100039，P.R.China
【Abstract】Objective：To investigate the effect of bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides on inducing HL-60 cells apoptosis.Methods：Synthesized bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides were added to in vitro HL-60 culture system. We used immunocytochemical staining assay to detect the level of bcl-2 protein expression at day 0，3，5，and used the flow cytometer to detect the cellular DNA content to determine the cell apoptosis indirectly.Results：bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides reduced the level of bcl-2 protein expression in HL-60 cells by the dose-dependent manner and time-dependent manner，and induced cells apoptosis.There was no difference on the effect of the sense oligodeoxynucleotides while compared with the control.Conclusion：It is one of the mainly mechanism by which bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides induce HL-60 cells apoptosis to reduce the level of bcl-2 protein expression.
, 百拇医药
Key words：Bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides；HL-60 cells； Apoptosis
Bcl-2基因是一种癌基因，可抑制多种因素引起的细胞凋亡，并和肿瘤细胞的耐药性密切相关。在急性白血病的研究中，bcl-2基因的高表达者易对化疗、放疗产生耐受性，化疗缓解率低，生存期短〔1～3〕。近年来，国外个别学者报告用bcl-2反义核酸可解除bcl-2对细胞凋亡的抑制作用，加速肿瘤细胞的死亡过程。我们合成了与bcl-2m RNA翻译起始序列互补的一段反义寡核苷酸(20bp)〔4〕，将其作用于白血病HL-60细胞系，观察其对bcl-2蛋白的调变作用及其促凋亡作用。通过这一作用可能为白血病的治疗提供新的治疗手段。
1材料和方法
1.1细胞系
, 百拇医药
HL-60细胞系(军事医学科学院放射医学研究所提供)常规培养于含10%热灭活小牛血清的RPMI1640培养液中，实验用细胞均处于指数生长期。
1.2bcl-2反义寡核苷酸片段
应用ABI公司391DNA自动合成仪合成了含20个碱基的bcl-2正、反义寡核苷酸片段，经过硫代磷酸修饰及接14个碳的脂肪链，纯化备用。
合成的bcl-2正义寡核苷酸序列为：5’-GGGAAGGATGGCGCACGCTG-3’
合成的bcl-2反义寡核苷酸序列为：5’-CAGCGTGCGCCATCCTTCCC-3’
1.3免疫组化法(APAAP)
用中山公司提供的bcl-2单抗和APAAP试剂盒检测bcl-2蛋白的表达水平。人工合成的bcl-2正、反义寡核苷酸与HL-60细胞共培养1～5天，同时设立对照组(空白对照)，分别在培养的0、3、5天时取细胞制成细胞涂片，室温干燥后用固定液固定1～2分钟，PBS冲洗3次，分别加入bcl-2一抗、二抗、三抗，放室温30分钟，碱性磷酸酶底物显色，苏木素复染，甘油明胶封片。在高倍镜下计数200个细胞，计算阳性细胞百分率。
, 百拇医药
1.4流式细胞仪间接分析细胞凋亡
人工合成的bcl-2正、反义寡核苷酸与HL-60细胞共培养48小时后，离心沉淀，经70%乙醇固定过夜。细胞由碘化丙锭(PI)染色，4℃避光30分钟，流式细胞仪测定DNA非整倍体细胞，即具有凋亡间接特征的亚二倍体细胞数量。
1.5统计学方法
t检验。
2结果
2.1bcl-2反义寡核苷酸下调HL-60细胞的bcl-2蛋白表达水平
分别以5、10、15、20μmol/L共4种不同浓度的bcl-2正、反义寡核苷酸与HL-60细胞共培养，在培养0、3、5天时通过免疫组化法检测细胞bcl-2蛋白表达水平，同时设立对照组。由表1可看出，bcl-2反义寡核苷酸的浓度小于10μmol/L作用于HL-60细胞时，细胞内的bcl-2蛋白表达阳性率无变化；bcl-2反义寡核苷酸的浓度大于或等于10μmol/L作用于HL-60细胞时，细胞内的bcl-2蛋白表达阳性率下降，由原来的98%降至82%，而且在培养的第5天作用最明显。当浓度增至15μmol/L时，细胞内的bcl-2蛋白表达阳性率由原来的98%降至65%。对照组和bcl-2正义核酸组细胞内的bcl-2蛋白表达阳性率在第0、3、5天均无显著变化。而且反义组细胞内bcl-2蛋白表达阳性率低而且弱，而正义组和对照组细胞内bcl-2蛋白表达阳性率高而且强。
, 百拇医药
表1 不同浓度的bcl-2正、反义寡核苷酸作用于HL-60
细胞后细胞的bcl-2蛋白表达阳性率(%)
浓度(μmol/L)
0天
3天
5天
C
S
AS
C
S
AS
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5
98
99
99
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99
98
96
10
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94
82
15
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99
99
96
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65
20
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99
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99
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ND
C：对照组，S：正义组，AS：反义组，ND：无存活细胞
2.2bcl-2反义寡核苷酸诱导HL-60细胞凋亡
bcl-2正、反义寡核苷酸(10μmol/L)分别与HL-60细胞共培养48小时后，利用流式细胞仪分析细胞凋亡情况，同时设立对照组。结果见表2。对照组细胞凋亡的百分比是7.52%。加bcl-2正义核苷酸组细胞凋亡的百分比是6.907%，加bcl-2反义核苷酸组细胞凋亡的百分比是27.75%;正义组和对照组之间无差异，而反义组与正义组和对照组之间均有差异(P<0.05)。
表2 相同浓度(10μmol/L)的bcl-2正、反义寡核苷酸作用于HL-60细胞后细胞凋亡的百分比
, http://www.100md.com
C
S
AS
1
6.66
7.35
24.10
2
9.95
5.60
38.00
3
5.95
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7.77
21.15
平均值
7.52±1.9
6.91±1.15
27.75±8.99
P值
>0.05
<0.05
C：对照组，S：正义组，AS：反义组
3讨论
bcl-2基因(B-cell lymphoma/leukemia-2)首先在t(14，18)(q32;q21)染色体易位的滤泡性淋巴瘤细胞中发现。它对细胞凋亡有明显的抑制作用，并与肿瘤的耐药性密切相关。最近的研究表明，急性白血病细胞几乎均存在bcl-2基因的广泛表达，而且高表达bcl-2基因的急性白血病病人对化疗反应差，完全缓解率低，存活时间短。反义核苷酸是近年来发展起来的一种新的基因技术，反义核苷酸以其高度特异性、分子水平的作用机制，正以新一代信息药物的姿态为白血病和肿瘤的治疗开辟了一条新的途径。反义核苷酸用于CML的治疗已有成功报道。用MDR、c-myb、c-myc等的反义RNA研究白血病和肿瘤治疗的研究也在逐渐增多。
, http://www.100md.com
鉴于bcl-2原癌基因在肿瘤的细胞凋亡和耐药性研究中的重要地位，用bcl-2的反义核苷酸抑制白血病细胞的bcl-2表达和白血病细胞的增殖及诱导细胞凋亡无疑是白血病治疗中新的切入点。我们的研究表明bcl-2反义核苷酸可有效的抑制HL60细胞增殖、下调bcl-2蛋白的表达，并明显促进白血病细胞的凋亡，此和Campos〔3〕的结果一致。据Keith〔5〕等报告，急性白血病病人bcl-2表达升高，其完全缓解率降低，耐药性增高，用bcl-2的反义核苷酸可以明显降低bcl-2的基因表达并有效增加白血病细胞对阿糖胞苷化疗药物的敏感性。此和我们的结果相似，提示：bcl-2反义核苷酸有可能是一个克服白血病对化疗耐药性的潜在的治疗手段。
对于反义寡核苷酸抑制基因表达的机制尚未完全阐明，可能的机制为：①抑制mRNA的翻译起始；②结合前mRNA，影响干扰其剪切和加工，妨碍前mRNA成熟；③形成局部反义寡核苷酸-mRNA双链结构激活了RNase.H，导致mRNA降解破坏；④特异性阻断mRNA穿越核膜的转运作用；⑤干扰基因的复制。本实验中bcl-2反义寡核苷酸与bcl-2mRNA的翻译起始序列互补，推测两者可能互补结合形成双链结构，阻止了翻译，从而抑制了bcl-2蛋白的表达。这提示我们可把bcl-2基因作为一个靶基因，为治疗耐药肿瘤提供一个新的治疗手段。
, 百拇医药
资金项目：本课题受全军“九.五”医学重点题资助(9612025)
〔参考文献〕
〔1〕Dole M，Nunez G，Merchant AK，et al. Bcl-2 inhibits chemotherapyinduced apoptosis in neuroblastoma〔J〕.Cancer Res，1994，54：3253～3259.
〔2〕Epperly MW，Santucci MA，Reed JC，et al.Expression of the human Bcl-2 transgene increases the radiation resistance of a hematopoietic progenitor cell line〔J〕.Radiatin Oncol Invest，1994，2：77.
, 百拇医药
〔3〕Campos L，Sabido O，Sebban C，et al.Expression of bcl-2 proto-oncogene in adult acute lymphoblastic leukemia 〔J〕.Leukemia，1996，10：434～438.
〔4〕Reed JC，Stein C，Subasinghe C，et al.Antisense-mediated inhibition of bcl-2 protooncogene expression and leukemic cell growth and surival：comparisions of phosphodiester and phosphorothioate oligodeoxynucleotides〔J〕.Cancer Res，1990，50：6565～6570.
〔5〕Keith J，Bradbury DA，Zhu YM，et al.Inhibition of bcl-2 with antisense oligodeoxynucleotides induces apoptosis and increases the sesitivity of AML blast to Ara-C〔J〕.Leukemia，1995;9：131～138.
收稿日期：1998-09-30；修回日期：1999-08-12, 百拇医药
单位：王丹红，艾辉胜，骈潍媛，解放军307医院(北京，100039)；孙志贤，林汝仙，王升启 军事医学科学院放射医学研究所(北京，100039)
关键词：bcl-2反义寡核苷酸；HL-60细胞；细胞凋亡
癌症990617
【摘要】目的：探讨bcl-2反义寡核苷酸诱导HL-60细胞的凋亡。方法：将人工合成的bcl-2反义寡聚脱氧核苷酸片段与HL-60细胞共培养，在作用的第0天、3天、5天通过免疫组化法(APAAP法)检测细胞内bcl-2蛋白表达水平的变化，通过流式细胞仪分析细胞凋亡的情况。结果：bcl-2反义寡核苷酸可下调HL-60细胞内bcl-2的蛋白表达水平，其作用与其浓度和时间呈正相关，同时可诱导细胞凋亡，而bcl-2正义寡核苷酸及对照无此作用。结论：bcl-2反义寡核苷酸诱导HL-60细胞凋亡的主要机制之一是下调bcl-2蛋白表达水平。
, 百拇医药
中图分类号：R318.12 文献标识码：A 文献编号：1000-467X(1999)06-0683-03
Bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides induce HL-60 cells apoptosis
WANG Dan-hong，AI Hui-sheng，SUN Zhi-xian，et al.
P.L.A.No.307 Hospital，Beijing 100039，P.R.China
【Abstract】Objective：To investigate the effect of bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides on inducing HL-60 cells apoptosis.Methods：Synthesized bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides were added to in vitro HL-60 culture system. We used immunocytochemical staining assay to detect the level of bcl-2 protein expression at day 0，3，5，and used the flow cytometer to detect the cellular DNA content to determine the cell apoptosis indirectly.Results：bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides reduced the level of bcl-2 protein expression in HL-60 cells by the dose-dependent manner and time-dependent manner，and induced cells apoptosis.There was no difference on the effect of the sense oligodeoxynucleotides while compared with the control.Conclusion：It is one of the mainly mechanism by which bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides induce HL-60 cells apoptosis to reduce the level of bcl-2 protein expression.
, 百拇医药
Key words：Bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides；HL-60 cells； Apoptosis
Bcl-2基因是一种癌基因，可抑制多种因素引起的细胞凋亡，并和肿瘤细胞的耐药性密切相关。在急性白血病的研究中，bcl-2基因的高表达者易对化疗、放疗产生耐受性，化疗缓解率低，生存期短〔1～3〕。近年来，国外个别学者报告用bcl-2反义核酸可解除bcl-2对细胞凋亡的抑制作用，加速肿瘤细胞的死亡过程。我们合成了与bcl-2m RNA翻译起始序列互补的一段反义寡核苷酸(20bp)〔4〕，将其作用于白血病HL-60细胞系，观察其对bcl-2蛋白的调变作用及其促凋亡作用。通过这一作用可能为白血病的治疗提供新的治疗手段。
1材料和方法
1.1细胞系
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HL-60细胞系(军事医学科学院放射医学研究所提供)常规培养于含10%热灭活小牛血清的RPMI1640培养液中，实验用细胞均处于指数生长期。
1.2bcl-2反义寡核苷酸片段
应用ABI公司391DNA自动合成仪合成了含20个碱基的bcl-2正、反义寡核苷酸片段，经过硫代磷酸修饰及接14个碳的脂肪链，纯化备用。
合成的bcl-2正义寡核苷酸序列为：5’-GGGAAGGATGGCGCACGCTG-3’
合成的bcl-2反义寡核苷酸序列为：5’-CAGCGTGCGCCATCCTTCCC-3’
1.3免疫组化法(APAAP)
用中山公司提供的bcl-2单抗和APAAP试剂盒检测bcl-2蛋白的表达水平。人工合成的bcl-2正、反义寡核苷酸与HL-60细胞共培养1～5天，同时设立对照组(空白对照)，分别在培养的0、3、5天时取细胞制成细胞涂片，室温干燥后用固定液固定1～2分钟，PBS冲洗3次，分别加入bcl-2一抗、二抗、三抗，放室温30分钟，碱性磷酸酶底物显色，苏木素复染，甘油明胶封片。在高倍镜下计数200个细胞，计算阳性细胞百分率。
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1.4流式细胞仪间接分析细胞凋亡
人工合成的bcl-2正、反义寡核苷酸与HL-60细胞共培养48小时后，离心沉淀，经70%乙醇固定过夜。细胞由碘化丙锭(PI)染色，4℃避光30分钟，流式细胞仪测定DNA非整倍体细胞，即具有凋亡间接特征的亚二倍体细胞数量。
1.5统计学方法
t检验。
2结果
2.1bcl-2反义寡核苷酸下调HL-60细胞的bcl-2蛋白表达水平
分别以5、10、15、20μmol/L共4种不同浓度的bcl-2正、反义寡核苷酸与HL-60细胞共培养，在培养0、3、5天时通过免疫组化法检测细胞bcl-2蛋白表达水平，同时设立对照组。由表1可看出，bcl-2反义寡核苷酸的浓度小于10μmol/L作用于HL-60细胞时，细胞内的bcl-2蛋白表达阳性率无变化；bcl-2反义寡核苷酸的浓度大于或等于10μmol/L作用于HL-60细胞时，细胞内的bcl-2蛋白表达阳性率下降，由原来的98%降至82%，而且在培养的第5天作用最明显。当浓度增至15μmol/L时，细胞内的bcl-2蛋白表达阳性率由原来的98%降至65%。对照组和bcl-2正义核酸组细胞内的bcl-2蛋白表达阳性率在第0、3、5天均无显著变化。而且反义组细胞内bcl-2蛋白表达阳性率低而且弱，而正义组和对照组细胞内bcl-2蛋白表达阳性率高而且强。
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表1 不同浓度的bcl-2正、反义寡核苷酸作用于HL-60
细胞后细胞的bcl-2蛋白表达阳性率(%)
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C：对照组，S：正义组，AS：反义组，ND：无存活细胞
2.2bcl-2反义寡核苷酸诱导HL-60细胞凋亡
bcl-2正、反义寡核苷酸(10μmol/L)分别与HL-60细胞共培养48小时后，利用流式细胞仪分析细胞凋亡情况，同时设立对照组。结果见表2。对照组细胞凋亡的百分比是7.52%。加bcl-2正义核苷酸组细胞凋亡的百分比是6.907%，加bcl-2反义核苷酸组细胞凋亡的百分比是27.75%;正义组和对照组之间无差异，而反义组与正义组和对照组之间均有差异(P<0.05)。
表2 相同浓度(10μmol/L)的bcl-2正、反义寡核苷酸作用于HL-60细胞后细胞凋亡的百分比
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6.66
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平均值
7.52±1.9
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27.75±8.99
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C：对照组，S：正义组，AS：反义组
3讨论
bcl-2基因(B-cell lymphoma/leukemia-2)首先在t(14，18)(q32;q21)染色体易位的滤泡性淋巴瘤细胞中发现。它对细胞凋亡有明显的抑制作用，并与肿瘤的耐药性密切相关。最近的研究表明，急性白血病细胞几乎均存在bcl-2基因的广泛表达，而且高表达bcl-2基因的急性白血病病人对化疗反应差，完全缓解率低，存活时间短。反义核苷酸是近年来发展起来的一种新的基因技术，反义核苷酸以其高度特异性、分子水平的作用机制，正以新一代信息药物的姿态为白血病和肿瘤的治疗开辟了一条新的途径。反义核苷酸用于CML的治疗已有成功报道。用MDR、c-myb、c-myc等的反义RNA研究白血病和肿瘤治疗的研究也在逐渐增多。
, http://www.100md.com
鉴于bcl-2原癌基因在肿瘤的细胞凋亡和耐药性研究中的重要地位，用bcl-2的反义核苷酸抑制白血病细胞的bcl-2表达和白血病细胞的增殖及诱导细胞凋亡无疑是白血病治疗中新的切入点。我们的研究表明bcl-2反义核苷酸可有效的抑制HL60细胞增殖、下调bcl-2蛋白的表达，并明显促进白血病细胞的凋亡，此和Campos〔3〕的结果一致。据Keith〔5〕等报告，急性白血病病人bcl-2表达升高，其完全缓解率降低，耐药性增高，用bcl-2的反义核苷酸可以明显降低bcl-2的基因表达并有效增加白血病细胞对阿糖胞苷化疗药物的敏感性。此和我们的结果相似，提示：bcl-2反义核苷酸有可能是一个克服白血病对化疗耐药性的潜在的治疗手段。
对于反义寡核苷酸抑制基因表达的机制尚未完全阐明，可能的机制为：①抑制mRNA的翻译起始；②结合前mRNA，影响干扰其剪切和加工，妨碍前mRNA成熟；③形成局部反义寡核苷酸-mRNA双链结构激活了RNase.H，导致mRNA降解破坏；④特异性阻断mRNA穿越核膜的转运作用；⑤干扰基因的复制。本实验中bcl-2反义寡核苷酸与bcl-2mRNA的翻译起始序列互补，推测两者可能互补结合形成双链结构，阻止了翻译，从而抑制了bcl-2蛋白的表达。这提示我们可把bcl-2基因作为一个靶基因，为治疗耐药肿瘤提供一个新的治疗手段。
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资金项目：本课题受全军“九.五”医学重点题资助(9612025)
〔参考文献〕
〔1〕Dole M，Nunez G，Merchant AK，et al. Bcl-2 inhibits chemotherapyinduced apoptosis in neuroblastoma〔J〕.Cancer Res，1994，54：3253～3259.
〔2〕Epperly MW，Santucci MA，Reed JC，et al.Expression of the human Bcl-2 transgene increases the radiation resistance of a hematopoietic progenitor cell line〔J〕.Radiatin Oncol Invest，1994，2：77.
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〔3〕Campos L，Sabido O，Sebban C，et al.Expression of bcl-2 proto-oncogene in adult acute lymphoblastic leukemia 〔J〕.Leukemia，1996，10：434～438.
〔4〕Reed JC，Stein C，Subasinghe C，et al.Antisense-mediated inhibition of bcl-2 protooncogene expression and leukemic cell growth and surival：comparisions of phosphodiester and phosphorothioate oligodeoxynucleotides〔J〕.Cancer Res，1990，50：6565～6570.
〔5〕Keith J，Bradbury DA，Zhu YM，et al.Inhibition of bcl-2 with antisense oligodeoxynucleotides induces apoptosis and increases the sesitivity of AML blast to Ara-C〔J〕.Leukemia，1995;9：131～138.
收稿日期：1998-09-30；修回日期：1999-08-12, 百拇医药