维甲酸和地塞米松对骨肉瘤细胞分化与端粒酶活性的影响
作者：王林,文剑明，张萌,董书堃,赵国强
单位：王林，文剑明，张萌，赵国强 中山医科大学病理学教研室(广州，510080)；王林，董书堃 中山医科大学孙逸仙纪念医院病理科(广州，510120)
关键词：骨肿瘤；分化；端粒酶活性；细胞周期
癌症990606 【摘要】目的:观察维甲酸(RA)和地塞米松(DEX)对骨肉瘤细胞(HOS)形态和功能分化的诱导作用以及分化后细胞周期与端粒酶活性的变化。方法：用RA和DEX诱导HOS细胞分化，观察分化后瘤细胞的细胞形态和功能的变化。细胞周期用流式细胞仪测定。端粒酶活性用TRAP-银染法检测。结果：RA和DEX可使体外培养的HOS细胞停留在G2/M期，细胞生长受到明显抑制，细胞形态和功能分化成熟，碱性磷酸酶(AP)活性明显升高，瘤细胞端粒酶活性随药物作用时间和浓度的增加而明显减弱。结论：RA和DEX能诱导骨肉瘤细胞形态和功能上的分化，端粒酶活性的调节可能发生于细胞周期的S期，其活性的下降可作为骨肉瘤细胞分化的指标，端粒酶活性下降与细胞分化之间的关系比与细胞周期的关系更为密切。
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中图分类号：R730.231 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)06-0642-04
The effect of RA and DEX on the differentiation and telomerase activity of
cultured osteosarcoma cells
WANG Lin, WEN Jian-ming, ZHANG Meng,et al.Department of Pathology,Sun Yat-sen University of Medical
Sciences,Guangzhou 510080,P.R.China
【Abstract】 Objective：To investigate the relationship between morphological and functional induction of differentiation and the expression levels of telomerase activity in osteosarcoma cells.Methods：Osteosarcoma cells were treated with all-trans-retinoic acid (RA) and dexamethasone (DEX) for the induction of differentiation.The morphological and functional changes of the cells were observed. Cell cycle of the cells was determined by flow cytometry.Telomerase activity of treated cells was detected by TRAP method.Results：RA and DEX can arrest the cell cycle of cultured HOS cells at G2/M phase. After treatment with RA or DEX,the growth of HOS cells was inhibited. The cells underwent morphological and functional differentiation.Alkaline phosphatase activity of the cells increased significantly more than before.The differentiated HOS cells showed a dose-and time-dependent decline of telomerase activity.Conclusions：Both RA and DEX could inhibit cell growth and induce differentiation of HOS cells morphologically and functionally.The decrease of telomerase activity can be considered as an indicator of differentiation.These results suggest,therefore, that telomerase regulation directly links to cell differentiation rather than cell cycle.
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Key words：Bone tumor；Differentiation; Telomerase activity; Cell cycle
肿瘤细胞的逆转诱导是肿瘤研究的重要组成部分。目前认为，处在去分化状态的恶性肿瘤细胞在促分化因素诱导下，可出现形态和功能的再分化。最近有文献报导〔1～3〕，在诱导肿瘤细胞分化的过程中检测到端粒酶活性的下降，这引起人们对细胞分化与端粒酶活性调节的关注。本文拟用维甲酸(all-trans-retinoicacid,RA)和地塞米松(dexamethasone,DEX)处理体外培养的人骨肉瘤细胞株HOS细胞，观察RA和DEX对HOS细胞的增殖、细胞周期和端粒酶活性表达水平的影响，探讨端粒酶活性与骨肿瘤细胞诱导分化的关系。
1材料和方法
1.1细胞和细胞培养
人骨肉瘤细胞株HOS由上海第二军医大学引进，在1640RPMI+10%FBS中常规培养。
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1.2细胞分化指标
形态上：将RA或DEX处理后的细胞接种于盖玻片上，经Giemsa染色后观察。
功能上：将HOS细胞接种于24孔板中，实验组加入含有10-5molRA或DEX，对照组加入相同量的溶剂乙醇。7天后两组各取三孔细胞计数，取其平均值比较细胞增殖状况，其余细胞进行碱性磷酸酶(alkalinephospha,AP)活性测定：用1%TritonX-100裂解细胞，取上清于Monarch761全自动生化分析仪测定AP活性,用蛋白质浓度(考马斯亮兰G-250染色法测定)来校正,AP单位为U.min-1.mg-1蛋白。
1.3细胞周期变化测定
将HOS细胞接种于塑料培养瓶中，实验组加入10-5molRA或DEX并设立对照组。培养3天和7天后收集每组细胞，用70%冷酒精(4℃)固定，然后加入DNA-Prep试剂盒(CoulterCo.)试剂，染色30分钟后上机(CoulterCo.Elite流式细胞仪)，用波长488nm检测。鸡红细胞作标准调通道数为100±2，计数10,000个HOS细胞，测出的直方图用Phoenix公司Multicycle处理，得出细胞周期各期的DNA相对含量和百分数。
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1.4端粒酶活性测定〔4〕
收集细胞，按照1×105个细胞/20μl加入裂解缓冲液〔10mmol/LTris-HCl(pH7.5)，1mmol/LMgCl2，1mmol/LEGTA，0.1mmol/LAEBSF，5mmol/Lβ-巯基乙醇，0.5%CHAPS，10%甘油〕，13,000rpm离心取上清。PCR反应：每一反应管中加入20mmol/LTris-HCl(pH8.3)，1.5mmol/LMgCl2，63mmol/LKCl，0.005%Tween-20，1mmol/LEGTA，0.1mg/mlBSA，0.1μgTS引物(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')，2uTaqpolymerase，50μmml/LdNTP，2μl细胞抽提液，反应液置25℃30min使端粒酶对TS引物进行延伸。然后于72℃加入0.1μgCX引物(5'-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3')，进行31个循环扩增(循环参数为94℃30sec，50℃30sec，72℃1.5min)。取一半反应产物于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后银染观察结果。
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2结果
2.1HOS细胞形态的改变
未经处理的骨肉瘤细胞在光镜下观察主要为短梭形，细胞排列紧密，核大，核分裂多见，可见较多的瘤巨细胞，细胞密集时呈多层生长。经RA或DEX处理7天后，细胞形态变成以多角形为主，单层排列，细胞大小趋向均一，胞浆丰富，核小而深染，瘤巨细胞减少，提示形态上出现分化改变(图1)。
图1 RA处理前后HOS细胞形态的改变
2.2HOS细胞生长速度及分化指标的测定
HOS细胞经10-5molRA和10-5molDEX处理后生长速度变缓，倍增时间由原来的39小时分别延长到48小时和44小时，7天后活细胞计数分别为对照组的62%和70%。AP活性明显升高，分别为对照组的1.38和1.57倍，经统计学处理有显著性差异(表1)。
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表1 RA和DEX对HOS增殖和AP活性的影响分组
分组
活细胞计数(×105)
AP活性(u.min-1.mg-1蛋白)
RA对照组
6.30(100%)
0.398(100%)
10-5molRA实验组
3.93(62%)*
0.545(138%)*
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DEX对照组
4.69(100%)
0.260(100%)
10-5molDEX实验组
3.26(70%)*
0.408(157%)*
*实验组与对照组比较，t检验，P<0.001
2.3RA和DEX对HOS细胞端粒酶活性的影响
HOS细胞经RA及DEX作用后，端粒酶活性均有不同程度的下降，且存在明显的浓度-时间依赖关系。以薄层扫描仪分析各条带峰值总面积代表端粒酶活性，用10-7、10-6和10-5molRA处理7天时(图2)，HOS细胞端粒酶活性分别下降至对照组的56.7%、20.0%和19.1%。用10-5molRA处理3、7和10天时(图3)，HOS细胞端粒酶活性下降至对照组的70.1%、52.1%和43.1%。DEX对HOS细胞端粒酶活性的作用也与浓度及作用时间呈反相关。用10-7、10-6和10-5molDEX处理3天时，端粒酶活性下降至对照组的76.2%、82.3%和74.9%；而处理7天时，端粒酶活性分别下降至对照组的36.7%、52.7%和13.5%(图4)。
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图2 HOS细胞经不同浓度RA处理7天的端粒酶活性变化A为端粒酶活性(lane4=10-7、lane5=10-6、lane6=10-5molRA)；B为处理后端粒酶活性较处理前(lane2)下降的比例。
图3 HOS细胞经RA处理不同时间后端粒酶活性的变化A为端粒酶活性(lane3=3天，lane4=7天，lane5=10天)；B为处理后端粒酶活性较处理前(lane2)下降的比例。
图4 HOS细胞经DEX处理前后端粒酶活性的变化A为端粒酶活性(lane3=10-7mol、3天，lane4=10-6mol、3天，lane5=10-5mol、3天，lane6=10-7mol、7天，lane7=10-6mol、7天，lane8=10-5mol、7天)；B为处理后端粒酶活性较处理前(lane1)下降的比例。
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2.4RA和DEX对HOS细胞周期的影响
经RA(图5)和DEX(图6)作用3天和7天后，处于G1期的HOS细胞比例从对照组的78.6%分别下降为67.5%和69.1%(3天)，58.9%和54.9%(7天)，而处于DNA合成期(S期)的细胞比例则从对照组的15.6%分别上升为23.3%和23.2%(3天)，34.7%和32.6%(7天)。与此同时，处于G2/M期的HOS细胞百分比数从对照组的5.8%分别上升为9.2%和7.7%(3天)，6.4%和12.5%(7天)。
图5 经10-5molRA处理后HOS细胞周期百分比的变化黑柱为G1期，纹柱为5期，白柱为G2/M期
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图6 经10-5molDEX处理后HOS细胞周期百分比的变化黑柱为G1期，纹柱为5期，白柱为G2/M期
3讨论
文献报道，DEX能诱导大鼠骨髓干细胞向成骨细胞分化〔5〕，分化后的成骨细胞表达骨桥素、骨钙素mRNA，胶原的合成增加，AP活性明显升高(AP活性升高是成骨细胞成熟分化的重要标志)。RA也可诱导骨肉瘤细胞在形态发生改变及AP活性升高〔6〕。本实验进一步证实了DEX和RA对培养的骨肉瘤细胞有生长抑制和分化诱导作用，表现为细胞形态趋向成熟，AP活性升高。经细胞周期测定，RA和DEX主要作用于G2/M期，使细胞群体停止于G2/M期或使G2/M期的时间延长，HOS细胞形态和功能上的分化，也可能发生于细胞周期的G2/M期。
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我们过去的研究表明，恶性骨肿瘤有端粒酶活性的表达，可在84%的骨肉瘤、60%的软骨肉瘤中检测到，然而在瘤旁正常组织中却检测不到，这些结果表明端粒酶活性是恶性肿瘤细胞的一种标志〔4〕。实验证明，通过诱导肿瘤细胞分化可使端粒酶活性下调，说明肿瘤恶性和逆转均与端粒酶活性密切相关〔1～3〕。然而，目前人们对端粒酶活性的调控机制尚不清楚。本实验用RA及DEX作用HOS细胞一段时间后，细胞生长速度明显下降，形态趋于分化成熟，AP活性升高，同时端粒酶活性明显下降，细胞形态和功能分化的程度与端粒酶活性呈负相关。因此，我们认为，端粒酶活性的降低也是细胞分化的指标之一。Sharma等〔1〕发现分化诱导剂如RA、佛波醇脂、二甲基亚砜等并不直接抑制端粒酶活性，说明端粒酶活性的降低是分化的结果。文献报道〔3,7〕，一些细胞株如白血病、上皮和胚胎细胞株等诱导分化后均可检测到端粒酶活性的下降，与我们的结果相一致。一般认为，RA与DEX诱导细胞分化机制是与胞浆中相应的受体结合，运输到核内并作用于转录基因，因此，我们也推测RA和DEX通过相似的途径作用于编码端粒酶RNA或蛋白质亚基的一个或多个基因，使其在转录水平上受到抑制，导致端粒酶活性下降。然而，分化与端粒酶活性的减少是有细胞选择性的，如神经母细胞瘤在诱导分化时端粒酶活性并无改变〔3〕。
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端粒酶的作用是将端粒序列添加到染色体的末端。因此，端粒酶是在细胞周期的S期发挥作用的〔8〕。Zhu等人报道处于S期的细胞端粒酶活性较其他期为高，而停滞于G2/M期的细胞其端粒酶活性几乎消失〔9〕。然而一些学者〔10〕发现，处在不同细胞周期的瘤细胞，其端粒酶活性并无显著差异，提出细胞周期与端粒酶活性之间并无必然的联系。本研究表明，在RA和DEX的作用下，HOS细胞由G1期进入S期，进而停滞于G2/M期，同时出现一系列形态和功能上的分化。在此过程中，尽管S期及G2/M期细胞的比例增加了，但细胞中端粒酶活性的表达水平依然下降。这些结果说明端粒酶活性的下降与细胞分化的关系更为密切。
基金项目：本课题受中华医学基金会(CMB)综合发展项目资助(1998年No.3)
〔参考文献〕
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〔1〕Sharma HW, Sokoloski JA, Perez JR, et al.Differentiation of immortal cells inhibits telomerase activity〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92：12343～12346. 〔2〕Albanell J,Han W, Mellado B,et al.Telomerase activity is repressed during differentiation of maturation-sensitive but not resistant human tumor cell lines 〔J〕.Cancer Res,1996,56：1503～1508.
〔3〕Bestilny LJ,Brown CB, Miura Y, et al.Selective inhibition of telomerase activity during terminal differentiation of immortal cell lines〔J〕.Cancer Res， 1996, 56：3796～3802.
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〔4〕Wen JM,Sun LB,Zhang M,et al.A non-isotopic method for the detection of telomerase activity in tumour tissues：TRAP-silver staining assay〔J〕.Mol Pathol, 1998,51：110～112.
〔5〕Leboy PS,Beresford JN,Devlin C,et al.Dexamethasone induction of osteoblast mRNAs in rat marrow stromal cell cultures〔J〕.J Cell Physiol,1991,146：370～378.
〔6〕宋亮年.视黄酸对人骨肉瘤细胞增殖分化的影响〔J〕.第二军医大学学报,1992,13：426～430.
〔7〕Savoysky E, Yoshida K, Ohtomo T, et al.Down-regulation of telomerase activity is an early event in the differentiation of HL60 cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,1996,226：329～334.
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〔8〕Shimada Y,Nakano M, Kanda N,et al.Cell cycle-dependent activation of telomerase in naturally synchronized culture of a true slime mold, Physarum polycephalum〔J〕.Biochem Biophy Res Commun,1997,232：492～496.
〔9〕Zhu X,Kumar R,Mandal M,et al.Cell cycle-dependent modulation of telomerase activity in tumor cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93：6091～6095.
〔10〕Kruk PA,Orren DK,Bohr VA.Telomerase activity is elevated in early S phase in hamster cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,1997,233：717～722.
收稿日期：1999-03-06；修回日期：1999-05-04, 百拇医药
单位：王林，文剑明，张萌，赵国强 中山医科大学病理学教研室(广州，510080)；王林，董书堃 中山医科大学孙逸仙纪念医院病理科(广州，510120)
关键词：骨肿瘤；分化；端粒酶活性；细胞周期
癌症990606 【摘要】目的:观察维甲酸(RA)和地塞米松(DEX)对骨肉瘤细胞(HOS)形态和功能分化的诱导作用以及分化后细胞周期与端粒酶活性的变化。方法：用RA和DEX诱导HOS细胞分化，观察分化后瘤细胞的细胞形态和功能的变化。细胞周期用流式细胞仪测定。端粒酶活性用TRAP-银染法检测。结果：RA和DEX可使体外培养的HOS细胞停留在G2/M期，细胞生长受到明显抑制，细胞形态和功能分化成熟，碱性磷酸酶(AP)活性明显升高，瘤细胞端粒酶活性随药物作用时间和浓度的增加而明显减弱。结论：RA和DEX能诱导骨肉瘤细胞形态和功能上的分化，端粒酶活性的调节可能发生于细胞周期的S期，其活性的下降可作为骨肉瘤细胞分化的指标，端粒酶活性下降与细胞分化之间的关系比与细胞周期的关系更为密切。
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中图分类号：R730.231 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)06-0642-04
The effect of RA and DEX on the differentiation and telomerase activity of
cultured osteosarcoma cells
WANG Lin, WEN Jian-ming, ZHANG Meng,et al.Department of Pathology,Sun Yat-sen University of Medical
Sciences,Guangzhou 510080,P.R.China
【Abstract】 Objective：To investigate the relationship between morphological and functional induction of differentiation and the expression levels of telomerase activity in osteosarcoma cells.Methods：Osteosarcoma cells were treated with all-trans-retinoic acid (RA) and dexamethasone (DEX) for the induction of differentiation.The morphological and functional changes of the cells were observed. Cell cycle of the cells was determined by flow cytometry.Telomerase activity of treated cells was detected by TRAP method.Results：RA and DEX can arrest the cell cycle of cultured HOS cells at G2/M phase. After treatment with RA or DEX,the growth of HOS cells was inhibited. The cells underwent morphological and functional differentiation.Alkaline phosphatase activity of the cells increased significantly more than before.The differentiated HOS cells showed a dose-and time-dependent decline of telomerase activity.Conclusions：Both RA and DEX could inhibit cell growth and induce differentiation of HOS cells morphologically and functionally.The decrease of telomerase activity can be considered as an indicator of differentiation.These results suggest,therefore, that telomerase regulation directly links to cell differentiation rather than cell cycle.
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Key words：Bone tumor；Differentiation; Telomerase activity; Cell cycle
肿瘤细胞的逆转诱导是肿瘤研究的重要组成部分。目前认为，处在去分化状态的恶性肿瘤细胞在促分化因素诱导下，可出现形态和功能的再分化。最近有文献报导〔1～3〕，在诱导肿瘤细胞分化的过程中检测到端粒酶活性的下降，这引起人们对细胞分化与端粒酶活性调节的关注。本文拟用维甲酸(all-trans-retinoicacid,RA)和地塞米松(dexamethasone,DEX)处理体外培养的人骨肉瘤细胞株HOS细胞，观察RA和DEX对HOS细胞的增殖、细胞周期和端粒酶活性表达水平的影响，探讨端粒酶活性与骨肿瘤细胞诱导分化的关系。
1材料和方法
1.1细胞和细胞培养
人骨肉瘤细胞株HOS由上海第二军医大学引进，在1640RPMI+10%FBS中常规培养。
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1.2细胞分化指标
形态上：将RA或DEX处理后的细胞接种于盖玻片上，经Giemsa染色后观察。
功能上：将HOS细胞接种于24孔板中，实验组加入含有10-5molRA或DEX，对照组加入相同量的溶剂乙醇。7天后两组各取三孔细胞计数，取其平均值比较细胞增殖状况，其余细胞进行碱性磷酸酶(alkalinephospha,AP)活性测定：用1%TritonX-100裂解细胞，取上清于Monarch761全自动生化分析仪测定AP活性,用蛋白质浓度(考马斯亮兰G-250染色法测定)来校正,AP单位为U.min-1.mg-1蛋白。
1.3细胞周期变化测定
将HOS细胞接种于塑料培养瓶中，实验组加入10-5molRA或DEX并设立对照组。培养3天和7天后收集每组细胞，用70%冷酒精(4℃)固定，然后加入DNA-Prep试剂盒(CoulterCo.)试剂，染色30分钟后上机(CoulterCo.Elite流式细胞仪)，用波长488nm检测。鸡红细胞作标准调通道数为100±2，计数10,000个HOS细胞，测出的直方图用Phoenix公司Multicycle处理，得出细胞周期各期的DNA相对含量和百分数。
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1.4端粒酶活性测定〔4〕
收集细胞，按照1×105个细胞/20μl加入裂解缓冲液〔10mmol/LTris-HCl(pH7.5)，1mmol/LMgCl2，1mmol/LEGTA，0.1mmol/LAEBSF，5mmol/Lβ-巯基乙醇，0.5%CHAPS，10%甘油〕，13,000rpm离心取上清。PCR反应：每一反应管中加入20mmol/LTris-HCl(pH8.3)，1.5mmol/LMgCl2，63mmol/LKCl，0.005%Tween-20，1mmol/LEGTA，0.1mg/mlBSA，0.1μgTS引物(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')，2uTaqpolymerase，50μmml/LdNTP，2μl细胞抽提液，反应液置25℃30min使端粒酶对TS引物进行延伸。然后于72℃加入0.1μgCX引物(5'-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3')，进行31个循环扩增(循环参数为94℃30sec，50℃30sec，72℃1.5min)。取一半反应产物于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后银染观察结果。
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2结果
2.1HOS细胞形态的改变
未经处理的骨肉瘤细胞在光镜下观察主要为短梭形，细胞排列紧密，核大，核分裂多见，可见较多的瘤巨细胞，细胞密集时呈多层生长。经RA或DEX处理7天后，细胞形态变成以多角形为主，单层排列，细胞大小趋向均一，胞浆丰富，核小而深染，瘤巨细胞减少，提示形态上出现分化改变(图1)。
图1 RA处理前后HOS细胞形态的改变
2.2HOS细胞生长速度及分化指标的测定
HOS细胞经10-5molRA和10-5molDEX处理后生长速度变缓，倍增时间由原来的39小时分别延长到48小时和44小时，7天后活细胞计数分别为对照组的62%和70%。AP活性明显升高，分别为对照组的1.38和1.57倍，经统计学处理有显著性差异(表1)。
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表1 RA和DEX对HOS增殖和AP活性的影响分组
分组
活细胞计数(×105)
AP活性(u.min-1.mg-1蛋白)
RA对照组
6.30(100%)
0.398(100%)
10-5molRA实验组
3.93(62%)*
0.545(138%)*
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DEX对照组
4.69(100%)
0.260(100%)
10-5molDEX实验组
3.26(70%)*
0.408(157%)*
*实验组与对照组比较，t检验，P<0.001
2.3RA和DEX对HOS细胞端粒酶活性的影响
HOS细胞经RA及DEX作用后，端粒酶活性均有不同程度的下降，且存在明显的浓度-时间依赖关系。以薄层扫描仪分析各条带峰值总面积代表端粒酶活性，用10-7、10-6和10-5molRA处理7天时(图2)，HOS细胞端粒酶活性分别下降至对照组的56.7%、20.0%和19.1%。用10-5molRA处理3、7和10天时(图3)，HOS细胞端粒酶活性下降至对照组的70.1%、52.1%和43.1%。DEX对HOS细胞端粒酶活性的作用也与浓度及作用时间呈反相关。用10-7、10-6和10-5molDEX处理3天时，端粒酶活性下降至对照组的76.2%、82.3%和74.9%；而处理7天时，端粒酶活性分别下降至对照组的36.7%、52.7%和13.5%(图4)。
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图2 HOS细胞经不同浓度RA处理7天的端粒酶活性变化A为端粒酶活性(lane4=10-7、lane5=10-6、lane6=10-5molRA)；B为处理后端粒酶活性较处理前(lane2)下降的比例。
图3 HOS细胞经RA处理不同时间后端粒酶活性的变化A为端粒酶活性(lane3=3天，lane4=7天，lane5=10天)；B为处理后端粒酶活性较处理前(lane2)下降的比例。
图4 HOS细胞经DEX处理前后端粒酶活性的变化A为端粒酶活性(lane3=10-7mol、3天，lane4=10-6mol、3天，lane5=10-5mol、3天，lane6=10-7mol、7天，lane7=10-6mol、7天，lane8=10-5mol、7天)；B为处理后端粒酶活性较处理前(lane1)下降的比例。
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2.4RA和DEX对HOS细胞周期的影响
经RA(图5)和DEX(图6)作用3天和7天后，处于G1期的HOS细胞比例从对照组的78.6%分别下降为67.5%和69.1%(3天)，58.9%和54.9%(7天)，而处于DNA合成期(S期)的细胞比例则从对照组的15.6%分别上升为23.3%和23.2%(3天)，34.7%和32.6%(7天)。与此同时，处于G2/M期的HOS细胞百分比数从对照组的5.8%分别上升为9.2%和7.7%(3天)，6.4%和12.5%(7天)。
图5 经10-5molRA处理后HOS细胞周期百分比的变化黑柱为G1期，纹柱为5期，白柱为G2/M期
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图6 经10-5molDEX处理后HOS细胞周期百分比的变化黑柱为G1期，纹柱为5期，白柱为G2/M期
3讨论
文献报道，DEX能诱导大鼠骨髓干细胞向成骨细胞分化〔5〕，分化后的成骨细胞表达骨桥素、骨钙素mRNA，胶原的合成增加，AP活性明显升高(AP活性升高是成骨细胞成熟分化的重要标志)。RA也可诱导骨肉瘤细胞在形态发生改变及AP活性升高〔6〕。本实验进一步证实了DEX和RA对培养的骨肉瘤细胞有生长抑制和分化诱导作用，表现为细胞形态趋向成熟，AP活性升高。经细胞周期测定，RA和DEX主要作用于G2/M期，使细胞群体停止于G2/M期或使G2/M期的时间延长，HOS细胞形态和功能上的分化，也可能发生于细胞周期的G2/M期。
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我们过去的研究表明，恶性骨肿瘤有端粒酶活性的表达，可在84%的骨肉瘤、60%的软骨肉瘤中检测到，然而在瘤旁正常组织中却检测不到，这些结果表明端粒酶活性是恶性肿瘤细胞的一种标志〔4〕。实验证明，通过诱导肿瘤细胞分化可使端粒酶活性下调，说明肿瘤恶性和逆转均与端粒酶活性密切相关〔1～3〕。然而，目前人们对端粒酶活性的调控机制尚不清楚。本实验用RA及DEX作用HOS细胞一段时间后，细胞生长速度明显下降，形态趋于分化成熟，AP活性升高，同时端粒酶活性明显下降，细胞形态和功能分化的程度与端粒酶活性呈负相关。因此，我们认为，端粒酶活性的降低也是细胞分化的指标之一。Sharma等〔1〕发现分化诱导剂如RA、佛波醇脂、二甲基亚砜等并不直接抑制端粒酶活性，说明端粒酶活性的降低是分化的结果。文献报道〔3,7〕，一些细胞株如白血病、上皮和胚胎细胞株等诱导分化后均可检测到端粒酶活性的下降，与我们的结果相一致。一般认为，RA与DEX诱导细胞分化机制是与胞浆中相应的受体结合，运输到核内并作用于转录基因，因此，我们也推测RA和DEX通过相似的途径作用于编码端粒酶RNA或蛋白质亚基的一个或多个基因，使其在转录水平上受到抑制，导致端粒酶活性下降。然而，分化与端粒酶活性的减少是有细胞选择性的，如神经母细胞瘤在诱导分化时端粒酶活性并无改变〔3〕。
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端粒酶的作用是将端粒序列添加到染色体的末端。因此，端粒酶是在细胞周期的S期发挥作用的〔8〕。Zhu等人报道处于S期的细胞端粒酶活性较其他期为高，而停滞于G2/M期的细胞其端粒酶活性几乎消失〔9〕。然而一些学者〔10〕发现，处在不同细胞周期的瘤细胞，其端粒酶活性并无显著差异，提出细胞周期与端粒酶活性之间并无必然的联系。本研究表明，在RA和DEX的作用下，HOS细胞由G1期进入S期，进而停滞于G2/M期，同时出现一系列形态和功能上的分化。在此过程中，尽管S期及G2/M期细胞的比例增加了，但细胞中端粒酶活性的表达水平依然下降。这些结果说明端粒酶活性的下降与细胞分化的关系更为密切。
基金项目：本课题受中华医学基金会(CMB)综合发展项目资助(1998年No.3)
〔参考文献〕
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收稿日期：1999-03-06；修回日期：1999-05-04, 百拇医药