5-FC/CD 系统对荷大肠癌裸鼠肿瘤的杀伤效应*
作者：崔 龙 林言箴 朱正纲 陈雪华 顾琴龙 刘炳亚 郁宝铭
单位：上海第二医科大学附属瑞金医院外科，上海市消化外科研究所 上海市 200025
关键词：结直肠肿瘤；cd基因；癌胚抗原；基因治疗
摘 要 目的 研究cd基因对大肠肿瘤的特异杀伤作用摘 要
目的 研究cd基因对大肠肿瘤的特异杀伤作用，探索自杀基因靶向治疗大肠癌的有效途径.
方法 逆转录病毒感染法将G1ceacdNa及pcd2分别转导入高分泌CEA的大肠癌细胞Lovo中，再分别接种到裸鼠皮下. 成瘤后腹腔给予5-FC(500mg/kg)治疗，观察肿瘤重量的变化及病理学特点.
结果 含G1ceacdNa及pcd2 逆转录病毒载体的病毒滴度分别为：1.3×107及2.1×108 CFU/L. 所有转基因成功并接种动物均成瘤. 腹腔给予5-FC治疗后发现，转由CEA基因顺式转录调控序列(TRS)驱动cd基因的组织特异性重组逆转录病毒载体G1ceacdNa的肿瘤对5-FC的敏感性明显高于转非cea调控cd基因的肿瘤，治疗结束后肿瘤重量分别为31mg±8mg及113mg±23mg(P<0.01).
, 百拇医药
结论 本实验提示cea转录调控序列可控制cd基因在CEA阳性的大肠癌组织中高效表达，进而在前药5-FC 的作用下发挥选择性杀伤肿瘤的作用.
中国图书馆分类号 R735.34
Killing effect of 5-FC/CD system on nude mice bearing human colorectal carcinoma*
CUI Long, LIN Yan-Zhen, ZHU Zheng-Gang, CHEN Xue-Hua, GU Qin-Long, LIU Bing-Ya and YU Bao-Ming
Shanghai Institute of Digetive Surgery, Department of Surgery of Ruijin Hospital, Shanghai 200025, China
, 百拇医药
Subject headings colorectal neoplasms; cd gene; carcinoembryonic antigen; gene therapy
Abstract
AIM To study the killing effect of cytosine deaminase (cd) and targeted therapy for colorectal.
METHODS The recombinant retroviral vector G1 ceacdNa, in which carcinoembryonic antigen (CEA) promoter was employed to drive the cd gene, was constructed. After packaging in PA317 cells and havesting viral supernant, the retroviral construct and pcd2 were produced to CEA highly produced clolorectal carcinoma cell line Lovo and then 1.2×106 parental Lovo cells, Lovo cells transfected pcd2 retroviral vectors and Lovo cells transfected G1 ceacdNa retroviral vectors were injected sc into flanking nude mice respectively. 500mg/kg 5-FC were given ip daily when the tumors were palpable. All the mice were sacrificed at the end of the treatment and the pathological analysis was made.
, 百拇医药
RESULTS Virus titer of pcd2 and G1ceacdNa was 1.3×107 and 2.1×108 CFU/L respectively. All mice with implanted tumor cells developed tumors and a higher antitumor effect was observed in nude mice bearing ceacd tumors than in the mice bearing cd tumors following administration of 5-FC systemically (P<0.01).
CONCLUSION This efficient therapeutic approach involving cea/cd chimeric gene might be a potential tool for the colorectal carcinoma-specific gene therapy. Suicide gene controlled by tissue-specific promotor could result in obvious antitumor effects.
, 百拇医药
0 引言 将外源的自杀基因转导到肿瘤细胞中后，可以表达一种前药转换酶，使得本身无毒的前药转换成类似化疗作用的药物，从而使肿瘤细胞“自杀”死亡. 不仅如此，许多实验均证实，在转自杀基因肿瘤细胞“自杀”的同时，其周围也有相当一部分未转基因肿瘤细胞也一同被杀死. 即所谓的“旁观者杀伤效应”[1]. 正因为自杀基因具备以上特殊的肿瘤杀伤作用，因此近几年，其在肿瘤治疗的基础研究正日渐深入，而且部分研究已进入临床Ⅰ期实验阶段. 胞嘧啶脱氨酶(cd)基因是来源于真菌及大肠杆菌的一种自杀基因，其编码的cd酶可以将对真核细胞相对无毒的5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨基转换成肿瘤化疗药5-氟尿嘧啶(5-FU)，在前期实验中，我们构建了含CEA特异性cd基因的重组逆转录病毒载体G1ceacdNa，将其转移到CEA阳性大肠癌细胞中进行体外抑瘤实验并取得成功[2]. 在此基础上，我们再将转基因细胞接种到裸鼠皮下进行大肠癌细胞抑瘤实验，试图探索有效的大肠癌辅助治疗手段.
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 材料 含cd基因的重组逆转录病毒载体pCD2由美国Anderson癌症研究中心儿科研究所的Craig A. Mullen博士惠赠[3]. 癌胚抗原(cea)基因5’端转录调控序列pCEA424/2 CAT由德国Freiburg Albert-Ludwigs大学的Zimmermann教授惠赠[4]. 逆转录病毒载体G1Na由美国Fred Huchison癌症研究中心的Miller教授惠赠. 各种工具酶均为美国Promega公司产品；PA317细胞，Psi-2细胞及大肠癌Lovo细胞均引自ATCC；牛血清、脂质体、G418，DMEM均购于Gibco公司；5-FC，MTT，polybrene购于Sigma公司；Balb/c裸鼠购于上海计生所.
1.2 大肠癌组织特异性逆转录病毒载体的构建 构建方法见文献[5]. 将cd基因片段和CEATRS片段经过在pUC118质粒中转换后同时克隆到逆转录病毒载体G1Na的多克隆位点HindⅢ中，以SalⅠ鉴定阳性克隆.
, 百拇医药
1.3 载体包装、病毒上清的收获及滴度测定 参照Dusty Miller[6]经典的方法对pcd2及G1ceacdNa进行包装. 先以脂质体将Pcd2及G1ceacdNa在包装细胞Psi-2细胞中进行包装. 以400mg/L G418进行筛选阳性克隆扩增后收集上清. 再以此上清感染PA317细胞，同样以G418筛选阳性克隆. 回收生长旺盛期阳性克隆细胞的培养液，以孔径为0.45μm的滤膜过滤培液以获得病毒上清. 在6cm2细胞培养瓶中接种1×103 Hella细胞，以含8mg/L polybrene的病毒上清培养24h后，Hella细胞按1∶20，1∶50，1∶100的比例稀释细胞，分别接种到24孔细胞培养板中，同时加入含600mg/L G418的1640培养基选择培养14d. 数每孔的细胞克隆数，按接种比例计算出病毒滴度.
1.4 大肠癌细胞的转染 在6cm2细胞培养瓶中接种1×105个Lovo细胞. 换成含8mg/L的polybrene的病毒上清培养24h. 以含400mg/L G418及100ml/L 胎牛血清的1640培养基传代培养转染细胞、选择培养14d，其中再传代2次，筛选抗性克隆并扩增.
, 百拇医药
1.5 前药5-FC对转基因大肠癌组织的抑瘤作用 将1.2×106转染成功pcd2，G1ceacdNa之Lovo细胞及未转基因之Lovo细胞分别接种到4周龄之Balb/c裸鼠大腿外侧皮下，观察成瘤情况. 接种20d开始，所有裸鼠均已成瘤后，开始每天腹腔注射500mg/kg体质量的5-FC，观察肿瘤生长情况并测量肿瘤直径，估算肿瘤重量公式如下：[长(mm)×宽(mm)]2/2=肿瘤重量(mg)[7]. 在5-FC治疗40d后将动物处死，肿瘤标本制作成石蜡切片，HE染色后在显微镜下观察肿瘤病理学变化.
在Word Excel作图软件中输入接种肿瘤细胞后每5d测量的各组肿瘤重量，作线图，采用配对计量资料的t检验进行统计处理.
2 结果
2.1 逆转录病毒包装收获的病毒上清的病毒滴度 含G1ceacdNa及pcd2逆转录病毒载体的病毒滴度分别为：1.3×107及2.1×108CFU/L.
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2.2 转基因Lovo细胞的成瘤实验及前药抑瘤实验 瘤细胞皮下注射2wk后，在注射部位均可见肿瘤生长. 开始药物治疗后测量的肿瘤大小及其抑瘤效果(图1). 转由cea基因顺式转录调控序列(TRS)驱动cd基因的组织特异性重组逆转录病毒载体G1ceacdNa的肿瘤对5-FC的敏感性明显大于转非cea调控cd基因的肿瘤，治疗结束后肿瘤重量分别为31mg±8mg及113mg±23mg(P<0.01).
图1 5-FC抑瘤作用曲线.
Non-cd tumors: 5-FC治疗未转基因肿瘤组(n=5). pcd2 tumors: 转pcd2基因肿瘤组(n=5). G1ceacdNa tumors: 转G1ceacdNa基因肿瘤组(n=5). Non 5-FC tumors: 未转基因且无5-FC治疗肿瘤组(n=5).
, http://www.100md.com
2.3 肿瘤病理学变化 镜下观察发现，对照组肿瘤细胞大部分生长活跃并可见核分裂相；而转基因组肿瘤标本内可见大片状空泡变性区，特别是转G1ceacdNa基因的标本内，瘤细胞几乎全部消失，仅可见散在的成纤维细胞及炎细胞(图2).
图2 经5-FC治疗后的肿瘤病理学改变. A：对照组 B：转pcd2基因组 C：转G1ceacdNa组
3 讨论
肿瘤基因治疗是目前发展比较迅速的现代生物治疗方法. 经过近几年肿瘤基因治疗的研究，自杀基因在前药的作用下直接对肿瘤发挥杀伤作用，又兼有强效的旁观者杀伤效应的作用，因此其有广泛的应用前景. cd自杀基因的前药转换抗肿瘤作用已得到肯定；人体细胞不含cd序列，因而不表达cd基因；研究者已将其改造成可在真核细胞中表达的pcd2基因.
, 百拇医药
将治疗基因特异性地转移到肿瘤组织或在肿瘤组织中特异地表达，从而使抗肿瘤作用主要集中在肿瘤原发或转移灶内，避免影响正常组织，此即靶向基因治疗. 癌胚抗原是人类胚胎时期特异分泌的，正常成人cea基因表达关闭，因此，cea基因属于组织特异性表达基因. 许多大肠癌中晚期大肠癌细胞其cea基因又重新开放表达. 已有报道将癌胚抗原(cea)基因的转录调控序列来特异调控自杀基因在cea阳性分泌肿瘤细胞中特异表达；从而达到靶向杀伤肿瘤细胞的目的[8，9].
在本研究中，我们首先构建了cea转录调控序列驱动cd基因的大肠癌组织逆转录病毒表达载体，再以逆转录病毒感染法将其转导入Lovo细胞中；将含转cd基因的大肠癌细胞接种到裸鼠皮下成瘤，系统给予前药后观察到，转ceacd基因的大肠肿瘤的生长抑制更明显. 在镜下观察肿瘤病理学变化，与对照组肿瘤相比较，转ceacd基因的肿瘤切片中大部分肿瘤细胞消失，取而代之的为大量纤维细胞和组织，肿瘤细胞出现明显的空泡变性，而很少有坏死灶；这提示cd自杀基因引致的肿瘤杀伤效应可能是引发了肿瘤细胞的凋亡机制，这点需要进一步的实验来证实.
, 百拇医药
本实验提示，在临床上可以利用这种5-FC/ceacd系统来定向性灭那些未切除干净的残留瘤灶或肉眼及影象学方法未发现的微小转移灶，从而可望达到肿瘤根治的目的. 因此，有必要再进一步开展一系列基础及临床前研究，使该项实验更接近临床治疗.
作者简介：崔龙，男，1965-11-14生，山东省莱阳市人，汉族. 1990年上海第二军医大学军医系毕业，1990/1994年在上海第二军医大学附属长海医院普外科工作，1997年上海第二军医大学博士，目前在第二医科大学附属瑞金医院外科，上海消化外科研究所从事博士后研究工作，主要从事消化道肿瘤的基因诊断及基因治疗研究，发表论文14篇.
*国家自然科学基金资助项目，No.39600142.
通讯作者 林言箴，200025，上海市瑞金二路125号，上海第二医科大学附属瑞金医院外科，上海市消化外科研究所.
, 百拇医药
*Supported by the National Natural Science Foundation of China, No. 39600142.
Correspondence to:Dr. LIN Yan-Zhen, Department of Surgery of Ruijin Hospital, The Second Medical University of Shanghai, Shanghai Institute of Digestive Surgery, 197 Ruijin 2 Road, Shanghai 200025
Tel. +86.21.64373909, Fax. +86.21.64373909
, 百拇医药
4 参考文献
1 Kanai F, Lan KH, Shiratori Y, Tanaka T, Ohashi M, Okudaira T,Yoshida Y,wakimoso H,Hamada H,Nakabayashi H,Tamaoki T, Omata M. In vivo gene therapy for α-fetoprotein-producing hepatocellular carcinoma by adenovirus-mediated transfer of cytosine deaminase gene. Cancer Res, 1997;57:461-465
2 崔龙，曹广文，杜平，王元和，屠岳，戚中田，高军，吴宗娣，仇晓芳. 胞嘧啶脱氨酶基因体外特异性前药转换抗大肠癌作用研究. 外科杂志，1997；2：84-87
3 Mullen CA, Kilstrup M, Blease RM. Transfer of the bacterial gene for cytosine deaminase to mammalian cells confers lethal sensitivity to 5-fluouocytosine: a negative selective system. Proc Natl Acad Sci USA, 1992;89:33-37
, http://www.100md.com
4 Schrewe H, Thompson J, Bona M, Hefta LJF, Maruya A, Haussauer M, Shiverly JE,von Kleist S, Zimmermann W. Cloning of the complete gene for carcinoembryonic antigen: analysis of its Promoter indicates a region conveying cell-specific expression. Mol cell Biol, 1990;10:2738-2748
5 崔龙，曹广文，王元和，屠岳，孟荣贵，高军，仇晓芳，吴宗娣，谢苏庆. 含cd基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建. 第二军医大学学报，1996；17：289-291
6 Miller A. Retroviral vectors. Curr Top Microbiol Immunol, 158:1-24
, 百拇医药
7 Huber BE, Austin EA, Good SS, Knick V, Tibbels S, Richards CA. In vivo antitumor activity of 5-Fluorocytosine on human colorectal carcinoma cells genetically modified to express cytosine deaminase. Cancer Res, 1993;53:4619-4626
8 Osaki T, Tanio Y, Tachibana I, Hosoe S, Kumakai T, Kawase I，Oikawa S, Kishimoto T. Gene therapy for carcinoembryonic antigen-producing human lung cancer cells by cell type-specific expression of herpes simplex virus thymidine kinase gene. Cancer Res, 1994;54:5258-5261
9 Richards CA, Austin EA, Huber BE. Transcriptional regulatory sequences of carcinoembryonic antigen: idetification and use with cytosine deaminase for tumor-specific gene therapy. Hum Gen Ther, 1995;6:881-893
收稿日期 1998-08-11, 百拇医药
单位：上海第二医科大学附属瑞金医院外科，上海市消化外科研究所 上海市 200025
关键词：结直肠肿瘤；cd基因；癌胚抗原；基因治疗
摘 要 目的 研究cd基因对大肠肿瘤的特异杀伤作用摘 要
目的 研究cd基因对大肠肿瘤的特异杀伤作用，探索自杀基因靶向治疗大肠癌的有效途径.
方法 逆转录病毒感染法将G1ceacdNa及pcd2分别转导入高分泌CEA的大肠癌细胞Lovo中，再分别接种到裸鼠皮下. 成瘤后腹腔给予5-FC(500mg/kg)治疗，观察肿瘤重量的变化及病理学特点.
结果 含G1ceacdNa及pcd2 逆转录病毒载体的病毒滴度分别为：1.3×107及2.1×108 CFU/L. 所有转基因成功并接种动物均成瘤. 腹腔给予5-FC治疗后发现，转由CEA基因顺式转录调控序列(TRS)驱动cd基因的组织特异性重组逆转录病毒载体G1ceacdNa的肿瘤对5-FC的敏感性明显高于转非cea调控cd基因的肿瘤，治疗结束后肿瘤重量分别为31mg±8mg及113mg±23mg(P<0.01).
, 百拇医药
结论 本实验提示cea转录调控序列可控制cd基因在CEA阳性的大肠癌组织中高效表达，进而在前药5-FC 的作用下发挥选择性杀伤肿瘤的作用.
中国图书馆分类号 R735.34
Killing effect of 5-FC/CD system on nude mice bearing human colorectal carcinoma*
CUI Long, LIN Yan-Zhen, ZHU Zheng-Gang, CHEN Xue-Hua, GU Qin-Long, LIU Bing-Ya and YU Bao-Ming
Shanghai Institute of Digetive Surgery, Department of Surgery of Ruijin Hospital, Shanghai 200025, China
, 百拇医药
Subject headings colorectal neoplasms; cd gene; carcinoembryonic antigen; gene therapy
Abstract
AIM To study the killing effect of cytosine deaminase (cd) and targeted therapy for colorectal.
METHODS The recombinant retroviral vector G1 ceacdNa, in which carcinoembryonic antigen (CEA) promoter was employed to drive the cd gene, was constructed. After packaging in PA317 cells and havesting viral supernant, the retroviral construct and pcd2 were produced to CEA highly produced clolorectal carcinoma cell line Lovo and then 1.2×106 parental Lovo cells, Lovo cells transfected pcd2 retroviral vectors and Lovo cells transfected G1 ceacdNa retroviral vectors were injected sc into flanking nude mice respectively. 500mg/kg 5-FC were given ip daily when the tumors were palpable. All the mice were sacrificed at the end of the treatment and the pathological analysis was made.
, 百拇医药
RESULTS Virus titer of pcd2 and G1ceacdNa was 1.3×107 and 2.1×108 CFU/L respectively. All mice with implanted tumor cells developed tumors and a higher antitumor effect was observed in nude mice bearing ceacd tumors than in the mice bearing cd tumors following administration of 5-FC systemically (P<0.01).
CONCLUSION This efficient therapeutic approach involving cea/cd chimeric gene might be a potential tool for the colorectal carcinoma-specific gene therapy. Suicide gene controlled by tissue-specific promotor could result in obvious antitumor effects.
, 百拇医药
0 引言 将外源的自杀基因转导到肿瘤细胞中后，可以表达一种前药转换酶，使得本身无毒的前药转换成类似化疗作用的药物，从而使肿瘤细胞“自杀”死亡. 不仅如此，许多实验均证实，在转自杀基因肿瘤细胞“自杀”的同时，其周围也有相当一部分未转基因肿瘤细胞也一同被杀死. 即所谓的“旁观者杀伤效应”[1]. 正因为自杀基因具备以上特殊的肿瘤杀伤作用，因此近几年，其在肿瘤治疗的基础研究正日渐深入，而且部分研究已进入临床Ⅰ期实验阶段. 胞嘧啶脱氨酶(cd)基因是来源于真菌及大肠杆菌的一种自杀基因，其编码的cd酶可以将对真核细胞相对无毒的5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨基转换成肿瘤化疗药5-氟尿嘧啶(5-FU)，在前期实验中，我们构建了含CEA特异性cd基因的重组逆转录病毒载体G1ceacdNa，将其转移到CEA阳性大肠癌细胞中进行体外抑瘤实验并取得成功[2]. 在此基础上，我们再将转基因细胞接种到裸鼠皮下进行大肠癌细胞抑瘤实验，试图探索有效的大肠癌辅助治疗手段.
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 材料 含cd基因的重组逆转录病毒载体pCD2由美国Anderson癌症研究中心儿科研究所的Craig A. Mullen博士惠赠[3]. 癌胚抗原(cea)基因5’端转录调控序列pCEA424/2 CAT由德国Freiburg Albert-Ludwigs大学的Zimmermann教授惠赠[4]. 逆转录病毒载体G1Na由美国Fred Huchison癌症研究中心的Miller教授惠赠. 各种工具酶均为美国Promega公司产品；PA317细胞，Psi-2细胞及大肠癌Lovo细胞均引自ATCC；牛血清、脂质体、G418，DMEM均购于Gibco公司；5-FC，MTT，polybrene购于Sigma公司；Balb/c裸鼠购于上海计生所.
1.2 大肠癌组织特异性逆转录病毒载体的构建 构建方法见文献[5]. 将cd基因片段和CEATRS片段经过在pUC118质粒中转换后同时克隆到逆转录病毒载体G1Na的多克隆位点HindⅢ中，以SalⅠ鉴定阳性克隆.
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1.3 载体包装、病毒上清的收获及滴度测定 参照Dusty Miller[6]经典的方法对pcd2及G1ceacdNa进行包装. 先以脂质体将Pcd2及G1ceacdNa在包装细胞Psi-2细胞中进行包装. 以400mg/L G418进行筛选阳性克隆扩增后收集上清. 再以此上清感染PA317细胞，同样以G418筛选阳性克隆. 回收生长旺盛期阳性克隆细胞的培养液，以孔径为0.45μm的滤膜过滤培液以获得病毒上清. 在6cm2细胞培养瓶中接种1×103 Hella细胞，以含8mg/L polybrene的病毒上清培养24h后，Hella细胞按1∶20，1∶50，1∶100的比例稀释细胞，分别接种到24孔细胞培养板中，同时加入含600mg/L G418的1640培养基选择培养14d. 数每孔的细胞克隆数，按接种比例计算出病毒滴度.
1.4 大肠癌细胞的转染 在6cm2细胞培养瓶中接种1×105个Lovo细胞. 换成含8mg/L的polybrene的病毒上清培养24h. 以含400mg/L G418及100ml/L 胎牛血清的1640培养基传代培养转染细胞、选择培养14d，其中再传代2次，筛选抗性克隆并扩增.
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1.5 前药5-FC对转基因大肠癌组织的抑瘤作用 将1.2×106转染成功pcd2，G1ceacdNa之Lovo细胞及未转基因之Lovo细胞分别接种到4周龄之Balb/c裸鼠大腿外侧皮下，观察成瘤情况. 接种20d开始，所有裸鼠均已成瘤后，开始每天腹腔注射500mg/kg体质量的5-FC，观察肿瘤生长情况并测量肿瘤直径，估算肿瘤重量公式如下：[长(mm)×宽(mm)]2/2=肿瘤重量(mg)[7]. 在5-FC治疗40d后将动物处死，肿瘤标本制作成石蜡切片，HE染色后在显微镜下观察肿瘤病理学变化.
在Word Excel作图软件中输入接种肿瘤细胞后每5d测量的各组肿瘤重量，作线图，采用配对计量资料的t检验进行统计处理.
2 结果
2.1 逆转录病毒包装收获的病毒上清的病毒滴度 含G1ceacdNa及pcd2逆转录病毒载体的病毒滴度分别为：1.3×107及2.1×108CFU/L.
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2.2 转基因Lovo细胞的成瘤实验及前药抑瘤实验 瘤细胞皮下注射2wk后，在注射部位均可见肿瘤生长. 开始药物治疗后测量的肿瘤大小及其抑瘤效果(图1). 转由cea基因顺式转录调控序列(TRS)驱动cd基因的组织特异性重组逆转录病毒载体G1ceacdNa的肿瘤对5-FC的敏感性明显大于转非cea调控cd基因的肿瘤，治疗结束后肿瘤重量分别为31mg±8mg及113mg±23mg(P<0.01).
图1 5-FC抑瘤作用曲线.
Non-cd tumors: 5-FC治疗未转基因肿瘤组(n=5). pcd2 tumors: 转pcd2基因肿瘤组(n=5). G1ceacdNa tumors: 转G1ceacdNa基因肿瘤组(n=5). Non 5-FC tumors: 未转基因且无5-FC治疗肿瘤组(n=5).
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2.3 肿瘤病理学变化 镜下观察发现，对照组肿瘤细胞大部分生长活跃并可见核分裂相；而转基因组肿瘤标本内可见大片状空泡变性区，特别是转G1ceacdNa基因的标本内，瘤细胞几乎全部消失，仅可见散在的成纤维细胞及炎细胞(图2).
图2 经5-FC治疗后的肿瘤病理学改变. A：对照组 B：转pcd2基因组 C：转G1ceacdNa组
3 讨论
肿瘤基因治疗是目前发展比较迅速的现代生物治疗方法. 经过近几年肿瘤基因治疗的研究，自杀基因在前药的作用下直接对肿瘤发挥杀伤作用，又兼有强效的旁观者杀伤效应的作用，因此其有广泛的应用前景. cd自杀基因的前药转换抗肿瘤作用已得到肯定；人体细胞不含cd序列，因而不表达cd基因；研究者已将其改造成可在真核细胞中表达的pcd2基因.
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将治疗基因特异性地转移到肿瘤组织或在肿瘤组织中特异地表达，从而使抗肿瘤作用主要集中在肿瘤原发或转移灶内，避免影响正常组织，此即靶向基因治疗. 癌胚抗原是人类胚胎时期特异分泌的，正常成人cea基因表达关闭，因此，cea基因属于组织特异性表达基因. 许多大肠癌中晚期大肠癌细胞其cea基因又重新开放表达. 已有报道将癌胚抗原(cea)基因的转录调控序列来特异调控自杀基因在cea阳性分泌肿瘤细胞中特异表达；从而达到靶向杀伤肿瘤细胞的目的[8，9].
在本研究中，我们首先构建了cea转录调控序列驱动cd基因的大肠癌组织逆转录病毒表达载体，再以逆转录病毒感染法将其转导入Lovo细胞中；将含转cd基因的大肠癌细胞接种到裸鼠皮下成瘤，系统给予前药后观察到，转ceacd基因的大肠肿瘤的生长抑制更明显. 在镜下观察肿瘤病理学变化，与对照组肿瘤相比较，转ceacd基因的肿瘤切片中大部分肿瘤细胞消失，取而代之的为大量纤维细胞和组织，肿瘤细胞出现明显的空泡变性，而很少有坏死灶；这提示cd自杀基因引致的肿瘤杀伤效应可能是引发了肿瘤细胞的凋亡机制，这点需要进一步的实验来证实.
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本实验提示，在临床上可以利用这种5-FC/ceacd系统来定向性灭那些未切除干净的残留瘤灶或肉眼及影象学方法未发现的微小转移灶，从而可望达到肿瘤根治的目的. 因此，有必要再进一步开展一系列基础及临床前研究，使该项实验更接近临床治疗.
作者简介：崔龙，男，1965-11-14生，山东省莱阳市人，汉族. 1990年上海第二军医大学军医系毕业，1990/1994年在上海第二军医大学附属长海医院普外科工作，1997年上海第二军医大学博士，目前在第二医科大学附属瑞金医院外科，上海消化外科研究所从事博士后研究工作，主要从事消化道肿瘤的基因诊断及基因治疗研究，发表论文14篇.
*国家自然科学基金资助项目，No.39600142.
通讯作者 林言箴，200025，上海市瑞金二路125号，上海第二医科大学附属瑞金医院外科，上海市消化外科研究所.
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*Supported by the National Natural Science Foundation of China, No. 39600142.
Correspondence to:Dr. LIN Yan-Zhen, Department of Surgery of Ruijin Hospital, The Second Medical University of Shanghai, Shanghai Institute of Digestive Surgery, 197 Ruijin 2 Road, Shanghai 200025
Tel. +86.21.64373909, Fax. +86.21.64373909
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4 参考文献
1 Kanai F, Lan KH, Shiratori Y, Tanaka T, Ohashi M, Okudaira T,Yoshida Y,wakimoso H,Hamada H,Nakabayashi H,Tamaoki T, Omata M. In vivo gene therapy for α-fetoprotein-producing hepatocellular carcinoma by adenovirus-mediated transfer of cytosine deaminase gene. Cancer Res, 1997;57:461-465
2 崔龙，曹广文，杜平，王元和，屠岳，戚中田，高军，吴宗娣，仇晓芳. 胞嘧啶脱氨酶基因体外特异性前药转换抗大肠癌作用研究. 外科杂志，1997；2：84-87
3 Mullen CA, Kilstrup M, Blease RM. Transfer of the bacterial gene for cytosine deaminase to mammalian cells confers lethal sensitivity to 5-fluouocytosine: a negative selective system. Proc Natl Acad Sci USA, 1992;89:33-37
, http://www.100md.com
4 Schrewe H, Thompson J, Bona M, Hefta LJF, Maruya A, Haussauer M, Shiverly JE,von Kleist S, Zimmermann W. Cloning of the complete gene for carcinoembryonic antigen: analysis of its Promoter indicates a region conveying cell-specific expression. Mol cell Biol, 1990;10:2738-2748
5 崔龙，曹广文，王元和，屠岳，孟荣贵，高军，仇晓芳，吴宗娣，谢苏庆. 含cd基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建. 第二军医大学学报，1996；17：289-291
6 Miller A. Retroviral vectors. Curr Top Microbiol Immunol, 158:1-24
, 百拇医药
7 Huber BE, Austin EA, Good SS, Knick V, Tibbels S, Richards CA. In vivo antitumor activity of 5-Fluorocytosine on human colorectal carcinoma cells genetically modified to express cytosine deaminase. Cancer Res, 1993;53:4619-4626
8 Osaki T, Tanio Y, Tachibana I, Hosoe S, Kumakai T, Kawase I，Oikawa S, Kishimoto T. Gene therapy for carcinoembryonic antigen-producing human lung cancer cells by cell type-specific expression of herpes simplex virus thymidine kinase gene. Cancer Res, 1994;54:5258-5261
9 Richards CA, Austin EA, Huber BE. Transcriptional regulatory sequences of carcinoembryonic antigen: idetification and use with cytosine deaminase for tumor-specific gene therapy. Hum Gen Ther, 1995;6:881-893
收稿日期 1998-08-11, 百拇医药