高糖浓度对人肾小球系膜细胞的作用
作者：邱红渝 屈燧林 刘晓惠 杨立川
单位：华西医科大学第一医院肾内科(610041)
关键词：肾小球系膜细胞；纤维连结蛋白；高糖浓度；糖尿病肾病
重庆医学990606 摘要 目的 模拟临床上血糖控制不佳出现的糖浓度波动，研究波动性细胞外高糖浓度(FEHG)对肾小球系膜细胞(MsC)增殖及其纤维连接蛋白(Fn)合成的影响。方法 利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和竞争抑制ELISA法动态观察不同葡萄糖浓度及波动性高糖浓度对MsC增殖和FN合成的作用。结果 高糖浓度抑制MsC增殖，此抑制作用和糖浓度成正相关，同时刺激MsC的FN合成增加；FEHG也抑制MsC的增殖，且对FN的合成有较强的刺激作用。结论 细胞外高葡萄糖环境抑制MsC增殖，且呈浓度依赖性；波动性细胞外高葡萄糖环境抑制MsC增殖，且抗增殖作用大于持续性高葡萄糖浓度组；细胞外高葡萄糖环境和波动性细胞外高葡萄糖均增加MsC Fn的合成，其作用机制尚待进一步研究，波动性高糖浓度对MsC的Fn合成的刺激作用可能在治疗不充分的糖尿病(DM)患者出现糖尿病肾病(DN)起重要作用。
, 百拇医药
The Effects of Fluctuating Extracellular High Glucose Concentration on Glomerular Mesangial Cells
Qiu Hongyu,Qu Suilin,Liu Xiaohui,Yang Lichuan.Nephrology Division,Department of Internal Medicine,the First Affiliated Hospital,WCUMS,Chengdu,Sichuan 610041
Abstract Objective:In order to observe the effects of hyperglycemia on Mesangial cell(MsC).The effects of fluctuating extracellular high glucose(FEHG) on MsC proliferation and fibronectin (Fn) synthesis were studied. Methods:The Fn level in supernatant of cultured MsC and MsC proliferation were assessed by means of competitive inhibiting ELISA method and MTT colormetric method respectively. Results:High glucose levels inhibited the MsC proliferation and FEHG had the same inhibition effect.the Fn synthesis in FEHG was more higher than that in high glucose level. Conclusion:Fluctuating changes in extracellular glucose concentration may play an important pathological role for FN synthesis of MsC in patients with diabetes mellitus treated inadequatly.
, 百拇医药
KEY WORDS:Mesangial cells Hyperglycemia Fibronectin Diabetic nephropathy.
糖尿病肾小球硬化症是DM全身性血管病变并发症之一。Mauver等的形态学分析表明系膜扩张和DN严重程度密切有关，DN患者中，肾小球结构显著变化，以肾小球基底膜(GBM)增厚和系膜区扩张为特征，系膜的细胞外基质(ECM)成分如：纤维连接蛋白(Fn)，层粘蛋白(In)和胶原明显增加。本研究在于比较不同葡萄糖浓度对MsC的作用，以及波动性和持续性高糖环境对MsC增殖和Fn产生的影响。
1 材料和方法
1.1 实验试剂
PRMI1640培养液购自Gibco公司；无糖RPMI 1640培养基购自Sigma公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)，Serra公司；人纤维连结蛋白(Fn)，宝丽曼公司；免抗人Fn，Dako公司。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 人肾小球系膜细胞的培养和鉴定[1，2]：分离人正常肾组织的肾皮质，剁碎后经140目，80目及200目不锈钢筛过滤，在筛面上收集肾小球，用胶原酶消化，培养液孵育小球块，5～7天后80%以上肾小球贴壁，两周时MsC布满瓶底后进行转种，利用亚培养的第2、第3代细胞进行试验。
1.2.2 高糖刺激MsC：将培养的第2代MsC悬液转种至24孔培养板，另外转种至3个96孔板中，细胞密度1.95×105/孔。培养48小时，换0.5%-FCS培养液培养24小时，使细胞生长同步化。去除上清，加入含GS刺激液，分五组进行试验。组1：对照组含GS5mmol/L；组2：含GS10mmol/L；组3：含GS20mmol/L；组4：含GS30mmol/L；组5：波动性细胞外高糖组(FEHG)，用含5mmol/L GS和30mmol/L GS浓度培养液交替更换。24孔板分别于第1天、4天和6天收集上清，保留于-20℃冰箱待测。96孔板分别于第1天、3天和7天测定细胞增殖。
, 百拇医药
1.2.3 MTT比色法测定MsC增殖[3]：取出96孔板，每孔加入10μl0.05%MTT。在37℃ CO2恒温箱中孵育4～6小时，加入细胞溶解剂(20%SDS～50%DMF)，待细胞完全溶解后，放入自动酶标合成仪，选取573nm波长进行测定。
1.2.4 竞争抑制ELISA法测定Fn[4，5]，用包被缓冲液将人Fn配成一定浓度，以100μl的量包被聚苯乙烯多孔板，37℃4小时后放4℃冰箱保存。将标准品Fn稀释成不同浓度梯度。待测上清液按1∶2浓度稀释，将标准品和待测上清液分别取100μl加入另一板中，再加入100μl免抗人Fn与之反应，37℃下孵育2小时，取100μl上述预反应液加入预先包被人Fn的板中，洗板，加入羊抗免IgG联酶血清辣根过氧化酶，每孔100μl，37℃下放置1小时，加入底物液，用1%SDS终止反应。在EL213e读数器上测波长630/490nm的OD值。根据计算机优选工作曲线资料作出标准曲线；并据其所选定的方程算出Fn的含量。
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1.3 统计学处理
细胞增殖和Fn的含量均以X±S表示，组间比较用t检验。
2 结 果
2.1 高糖浓度对MsC增殖的影响
2.1.1 测定不同浓度GS对MsC增殖的OD值的影响(表1)时发现：第2天时，MsC增殖在各组间均无显著差异(P>0.05)。第3天，开始出现糖浓度增高，细胞增殖受抑，且30mmol/L GS与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。第7天，20mmol/L GS组，30mmol/L GS组，FEHG组与对照组比较，均抑制MsC增殖，后两组和对照组有显著性差异(t=2.464、5.901，P<0.05)。
2.1.2 高糖环境的抗MsC增殖呈剂量依赖关系。
, http://www.100md.com 2.1.3 持续性高糖浓度(20mmol/L GS和30mmol/L GS组)与FEHG组比较，后者抑制作用显著增强(t=3.234、3.987，P<0.05)
表1 不同浓度GS对MsC增殖的影响(OD值，X±S) 组别
d
1
n=6
2
n=6
3
n=6
4
n=6
, 百拇医药
FEHG
n=6
2
0.457±0.040
0.357±0.0015
0.473±0.051
0.467±0.0055
0.457±0.15
3
0.697±0.025
0.583±0.035
0.563±0.038
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0.550±0.017*
0.560±0.049
7
1.157±0.061
1.083±0.061
1.073±0.068△
1.050±0.068*△
0.943±0.015*
注：组1(对照组)含GS 5mmol/L，组2含GS 10mmol/L，组3含GS 20mmol/L，组4含GS 30mmol/L，*与对照组比较P<0.05；△与FEHG组比较P<0.05
, 百拇医药
2.2 高糖浓度对上清液中Fn产生的影响
测定不同浓度GS对MsC产生Fn的影响(表2)时显示：高糖环境明显刺激MsC Fn的产生。于第1天，第2天和4天高糖浓度组已经开始出现Fn含量增高，但尚无统计学意义(P>0.05)。第6天时，30mol/L GS组和FEHG组Fn的含量显著增加，且与对照组比较有统计学意义(t=2.78、3.107，P<0.05)。持续性高糖浓度组(20mol/L GS组和30mol/L GS组)与FEHG组比较，前者Fn的含量低于后者，其差异尚无统计学意义(t=1.571、2.0765，P>0.05)。
表2 不同浓度GS对MsC产生Fn(X±S)的影响 组别
d
1
n=6
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2
n=6
3
n=6
4
n=6
FEHG
n=6
1
0.259±0.221
0.183±0.134
0.346±0.256
0.369±0.264
, 百拇医药
0.510±0.389
2
0.432±0.200
0.517±0.199
0.428±0.245
0.336±0.319
0.297±0.292
4
0.233±0.163
0.258±0.253
0.25±0.187
0.367±0.239
, http://www.100md.com
0.422±0.219
6
0.124±0.054
0.144±0.025
0.193±0.060△
0.283±0.132*△
0.337±0.159*
注：分组同表1，*与对照组比较P<0.05；△与FEHG组比较P>0.05
3 讨 论
本研究比较了不同葡萄糖浓度对培养的人MsC的作用，并比较了间歇性高葡萄糖浓度和持续性高葡萄糖浓度环境对培养的MsC作用的差异。显示了高糖浓度可抑制细胞增殖，同时增加ECM的Fn含量。
, 百拇医药
既往体外培养MsC增殖测定，多采用3H-TdR掺入法，该法反映细胞DNA的合成。本研究中，采用MTT比色法测定体外培养MsC的增殖，Mosmann[3]研究表明，MTT比色法，3H-7dR渗入法对细胞增殖的测定并无多大差异，且MTT法具有迅速、简便、干扰因素少的优点。采用MTT比色法测定高糖环境对体外培养MsC增殖的效应，证实了高糖环境的抗MsC增殖作用，并且证实了糖浓度愈高，抗增殖作用愈强。高糖环境抗细胞增殖的机制可能如下[4、6]：(1)抑制MsC有丝分裂因子，如细胞自分泌的转化生长因子-β(TGF-β)，MsC在高糖环境中培养48小时和72小时后，可导致MsC TGF-β mRNA增高，此内源性TGF-β可抑制细胞增殖；(2)激活蛋白激酶C(PKC)而抑制细胞增殖；(3)细胞外基质蛋白的非酶糖基化也可能参与MsC抗增殖作用。本研究中，观察到高糖环境中MsC产生Fn的含量明显增加，这与Nahman等[11、4]的研究结果一致，他们同时证实了高糖可增加Fn的mRNA水平，且不依赖于细胞增殖状态。高糖环境刺激体外培养MsC合成Fn增加的机制何在?研究表明，某些细胞因子可上调Fn基因，这些因子包括γ-干扰素(γ-IFN)，血小板衍化生长因子(PDGF)，白介素-6(IL-6)和TGF-β[6～8]。在高糖环境中，PKC的激活对MsC Fn和积聚起重要作用。Kreisberg等[9]认为高糖浓度通过激活PKC并增加Fn基因上的从cAMP反应成分(CRE)刺激其基因表达。波动性高糖浓度对MsC增殖和Fn产生的作用机制尚不明了。持续性暴露于高糖环境的MsC可能产生某些适应性变化，而波动性高糖环境可能改变这种适应机制，其作用机制尚不清楚。然而有实验表明葡萄糖诱导Fn基因表达的上调作用可持续至周围环境糖浓度恢复正常后数日[10]。
, 百拇医药
本研究结果临床意义在于，治疗不当的DM患者其平均血糖和糖化血红蛋白浓度显著高于正常，易于出现血糖浓度的大幅度波动，有利于DN的发生。改善治疗效果宜联系到降低血糖的波动性。本研究设计出的波动性高糖模型，可能对临床设计新的治疗方案以减少DM并发症的发生有所裨益。
参考文献
1 谌贻璞，等.肾小球系膜细胞培养.北京医科大学学报，1989，21(4)：335
2 Striker GE,Striker LJ.Biology of diseases;Glomerular cell culture.Lab Invest，1985，53：122
3 Mosmann T.Tapped colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immun Meghods，1983，63：5
, http://www.100md.com
4 Nahman NS,loonhart,Cosio FG,et al.Effects of high glucose on cellular proliferation and fibronectin production by cultured human mesangial cells.Kidney Int，1992，41：396
5 Cosio GF,Bakaltz AP.Abnormal plasma fibronectin levels in patients with proteinuria.J Lab Clin Med，1984，104：867
6 Wolf G,sharmak,chen Y,et al.High glucose induced proliferation in mesangial cells is reversed by cutlcrine TGF-β.Kidney Int，1992，42：647
, 百拇医药
7 Gzaja MJ,Weiner FR,Eghbali M,et al.Differential effects of gamma-interferon on collagen and fibronectin gene expression.J Biol chem，1987，262：13348
8 Lanser ME,Brown GE.Stimulation of rat hepatocyte fibronectin production by monocyte-conditioned medium is due to interleukin-b.J Exp Med，1989，170：1781
9 Kreisbery JI,Kreisbory SH.High glucose activates protein kinase C and Stimulates fibronectin gene expression by enhancing a cAMP response esement.Kidney Int，1995，48(51)：S3
10 Roy S,Sals R,Caglivero E.Overexpression of fibronectin induced by diabetes or high glucose:phenomenon with memory.Proc Nat Acad Sci USA，1990，87：404
11 Nahman NS,leonhan K,Cosio FG.Effects of high glucose concentration on human mesangial fibronectin production(abstract) Kidney Int，1990，37：221, http://www.100md.com
单位：华西医科大学第一医院肾内科(610041)
关键词：肾小球系膜细胞；纤维连结蛋白；高糖浓度；糖尿病肾病
重庆医学990606 摘要 目的 模拟临床上血糖控制不佳出现的糖浓度波动，研究波动性细胞外高糖浓度(FEHG)对肾小球系膜细胞(MsC)增殖及其纤维连接蛋白(Fn)合成的影响。方法 利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和竞争抑制ELISA法动态观察不同葡萄糖浓度及波动性高糖浓度对MsC增殖和FN合成的作用。结果 高糖浓度抑制MsC增殖，此抑制作用和糖浓度成正相关，同时刺激MsC的FN合成增加；FEHG也抑制MsC的增殖，且对FN的合成有较强的刺激作用。结论 细胞外高葡萄糖环境抑制MsC增殖，且呈浓度依赖性；波动性细胞外高葡萄糖环境抑制MsC增殖，且抗增殖作用大于持续性高葡萄糖浓度组；细胞外高葡萄糖环境和波动性细胞外高葡萄糖均增加MsC Fn的合成，其作用机制尚待进一步研究，波动性高糖浓度对MsC的Fn合成的刺激作用可能在治疗不充分的糖尿病(DM)患者出现糖尿病肾病(DN)起重要作用。
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The Effects of Fluctuating Extracellular High Glucose Concentration on Glomerular Mesangial Cells
Qiu Hongyu,Qu Suilin,Liu Xiaohui,Yang Lichuan.Nephrology Division,Department of Internal Medicine,the First Affiliated Hospital,WCUMS,Chengdu,Sichuan 610041
Abstract Objective:In order to observe the effects of hyperglycemia on Mesangial cell(MsC).The effects of fluctuating extracellular high glucose(FEHG) on MsC proliferation and fibronectin (Fn) synthesis were studied. Methods:The Fn level in supernatant of cultured MsC and MsC proliferation were assessed by means of competitive inhibiting ELISA method and MTT colormetric method respectively. Results:High glucose levels inhibited the MsC proliferation and FEHG had the same inhibition effect.the Fn synthesis in FEHG was more higher than that in high glucose level. Conclusion:Fluctuating changes in extracellular glucose concentration may play an important pathological role for FN synthesis of MsC in patients with diabetes mellitus treated inadequatly.
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KEY WORDS:Mesangial cells Hyperglycemia Fibronectin Diabetic nephropathy.
糖尿病肾小球硬化症是DM全身性血管病变并发症之一。Mauver等的形态学分析表明系膜扩张和DN严重程度密切有关，DN患者中，肾小球结构显著变化，以肾小球基底膜(GBM)增厚和系膜区扩张为特征，系膜的细胞外基质(ECM)成分如：纤维连接蛋白(Fn)，层粘蛋白(In)和胶原明显增加。本研究在于比较不同葡萄糖浓度对MsC的作用，以及波动性和持续性高糖环境对MsC增殖和Fn产生的影响。
1 材料和方法
1.1 实验试剂
PRMI1640培养液购自Gibco公司；无糖RPMI 1640培养基购自Sigma公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)，Serra公司；人纤维连结蛋白(Fn)，宝丽曼公司；免抗人Fn，Dako公司。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 人肾小球系膜细胞的培养和鉴定[1，2]：分离人正常肾组织的肾皮质，剁碎后经140目，80目及200目不锈钢筛过滤，在筛面上收集肾小球，用胶原酶消化，培养液孵育小球块，5～7天后80%以上肾小球贴壁，两周时MsC布满瓶底后进行转种，利用亚培养的第2、第3代细胞进行试验。
1.2.2 高糖刺激MsC：将培养的第2代MsC悬液转种至24孔培养板，另外转种至3个96孔板中，细胞密度1.95×105/孔。培养48小时，换0.5%-FCS培养液培养24小时，使细胞生长同步化。去除上清，加入含GS刺激液，分五组进行试验。组1：对照组含GS5mmol/L；组2：含GS10mmol/L；组3：含GS20mmol/L；组4：含GS30mmol/L；组5：波动性细胞外高糖组(FEHG)，用含5mmol/L GS和30mmol/L GS浓度培养液交替更换。24孔板分别于第1天、4天和6天收集上清，保留于-20℃冰箱待测。96孔板分别于第1天、3天和7天测定细胞增殖。
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1.2.3 MTT比色法测定MsC增殖[3]：取出96孔板，每孔加入10μl0.05%MTT。在37℃ CO2恒温箱中孵育4～6小时，加入细胞溶解剂(20%SDS～50%DMF)，待细胞完全溶解后，放入自动酶标合成仪，选取573nm波长进行测定。
1.2.4 竞争抑制ELISA法测定Fn[4，5]，用包被缓冲液将人Fn配成一定浓度，以100μl的量包被聚苯乙烯多孔板，37℃4小时后放4℃冰箱保存。将标准品Fn稀释成不同浓度梯度。待测上清液按1∶2浓度稀释，将标准品和待测上清液分别取100μl加入另一板中，再加入100μl免抗人Fn与之反应，37℃下孵育2小时，取100μl上述预反应液加入预先包被人Fn的板中，洗板，加入羊抗免IgG联酶血清辣根过氧化酶，每孔100μl，37℃下放置1小时，加入底物液，用1%SDS终止反应。在EL213e读数器上测波长630/490nm的OD值。根据计算机优选工作曲线资料作出标准曲线；并据其所选定的方程算出Fn的含量。
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1.3 统计学处理
细胞增殖和Fn的含量均以X±S表示，组间比较用t检验。
2 结 果
2.1 高糖浓度对MsC增殖的影响
2.1.1 测定不同浓度GS对MsC增殖的OD值的影响(表1)时发现：第2天时，MsC增殖在各组间均无显著差异(P>0.05)。第3天，开始出现糖浓度增高，细胞增殖受抑，且30mmol/L GS与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。第7天，20mmol/L GS组，30mmol/L GS组，FEHG组与对照组比较，均抑制MsC增殖，后两组和对照组有显著性差异(t=2.464、5.901，P<0.05)。
2.1.2 高糖环境的抗MsC增殖呈剂量依赖关系。
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表1 不同浓度GS对MsC增殖的影响(OD值，X±S) 组别
d
1
n=6
2
n=6
3
n=6
4
n=6
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FEHG
n=6
2
0.457±0.040
0.357±0.0015
0.473±0.051
0.467±0.0055
0.457±0.15
3
0.697±0.025
0.583±0.035
0.563±0.038
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0.550±0.017*
0.560±0.049
7
1.157±0.061
1.083±0.061
1.073±0.068△
1.050±0.068*△
0.943±0.015*
注：组1(对照组)含GS 5mmol/L，组2含GS 10mmol/L，组3含GS 20mmol/L，组4含GS 30mmol/L，*与对照组比较P<0.05；△与FEHG组比较P<0.05
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2.2 高糖浓度对上清液中Fn产生的影响
测定不同浓度GS对MsC产生Fn的影响(表2)时显示：高糖环境明显刺激MsC Fn的产生。于第1天，第2天和4天高糖浓度组已经开始出现Fn含量增高，但尚无统计学意义(P>0.05)。第6天时，30mol/L GS组和FEHG组Fn的含量显著增加，且与对照组比较有统计学意义(t=2.78、3.107，P<0.05)。持续性高糖浓度组(20mol/L GS组和30mol/L GS组)与FEHG组比较，前者Fn的含量低于后者，其差异尚无统计学意义(t=1.571、2.0765，P>0.05)。
表2 不同浓度GS对MsC产生Fn(X±S)的影响 组别
d
1
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n=6
3
n=6
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n=6
FEHG
n=6
1
0.259±0.221
0.183±0.134
0.346±0.256
0.369±0.264
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0.510±0.389
2
0.432±0.200
0.517±0.199
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0.336±0.319
0.297±0.292
4
0.233±0.163
0.258±0.253
0.25±0.187
0.367±0.239
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0.422±0.219
6
0.124±0.054
0.144±0.025
0.193±0.060△
0.283±0.132*△
0.337±0.159*
注：分组同表1，*与对照组比较P<0.05；△与FEHG组比较P>0.05
3 讨 论
本研究比较了不同葡萄糖浓度对培养的人MsC的作用，并比较了间歇性高葡萄糖浓度和持续性高葡萄糖浓度环境对培养的MsC作用的差异。显示了高糖浓度可抑制细胞增殖，同时增加ECM的Fn含量。
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既往体外培养MsC增殖测定，多采用3H-TdR掺入法，该法反映细胞DNA的合成。本研究中，采用MTT比色法测定体外培养MsC的增殖，Mosmann[3]研究表明，MTT比色法，3H-7dR渗入法对细胞增殖的测定并无多大差异，且MTT法具有迅速、简便、干扰因素少的优点。采用MTT比色法测定高糖环境对体外培养MsC增殖的效应，证实了高糖环境的抗MsC增殖作用，并且证实了糖浓度愈高，抗增殖作用愈强。高糖环境抗细胞增殖的机制可能如下[4、6]：(1)抑制MsC有丝分裂因子，如细胞自分泌的转化生长因子-β(TGF-β)，MsC在高糖环境中培养48小时和72小时后，可导致MsC TGF-β mRNA增高，此内源性TGF-β可抑制细胞增殖；(2)激活蛋白激酶C(PKC)而抑制细胞增殖；(3)细胞外基质蛋白的非酶糖基化也可能参与MsC抗增殖作用。本研究中，观察到高糖环境中MsC产生Fn的含量明显增加，这与Nahman等[11、4]的研究结果一致，他们同时证实了高糖可增加Fn的mRNA水平，且不依赖于细胞增殖状态。高糖环境刺激体外培养MsC合成Fn增加的机制何在?研究表明，某些细胞因子可上调Fn基因，这些因子包括γ-干扰素(γ-IFN)，血小板衍化生长因子(PDGF)，白介素-6(IL-6)和TGF-β[6～8]。在高糖环境中，PKC的激活对MsC Fn和积聚起重要作用。Kreisberg等[9]认为高糖浓度通过激活PKC并增加Fn基因上的从cAMP反应成分(CRE)刺激其基因表达。波动性高糖浓度对MsC增殖和Fn产生的作用机制尚不明了。持续性暴露于高糖环境的MsC可能产生某些适应性变化，而波动性高糖环境可能改变这种适应机制，其作用机制尚不清楚。然而有实验表明葡萄糖诱导Fn基因表达的上调作用可持续至周围环境糖浓度恢复正常后数日[10]。
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本研究结果临床意义在于，治疗不当的DM患者其平均血糖和糖化血红蛋白浓度显著高于正常，易于出现血糖浓度的大幅度波动，有利于DN的发生。改善治疗效果宜联系到降低血糖的波动性。本研究设计出的波动性高糖模型，可能对临床设计新的治疗方案以减少DM并发症的发生有所裨益。
参考文献
1 谌贻璞，等.肾小球系膜细胞培养.北京医科大学学报，1989，21(4)：335
2 Striker GE,Striker LJ.Biology of diseases;Glomerular cell culture.Lab Invest，1985，53：122
3 Mosmann T.Tapped colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immun Meghods，1983，63：5
, http://www.100md.com
4 Nahman NS,loonhart,Cosio FG,et al.Effects of high glucose on cellular proliferation and fibronectin production by cultured human mesangial cells.Kidney Int，1992，41：396
5 Cosio GF,Bakaltz AP.Abnormal plasma fibronectin levels in patients with proteinuria.J Lab Clin Med，1984，104：867
6 Wolf G,sharmak,chen Y,et al.High glucose induced proliferation in mesangial cells is reversed by cutlcrine TGF-β.Kidney Int，1992，42：647
, 百拇医药
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