Cr(Ⅵ)对细胞增殖周期和细胞内蛋白质及DNA含量的影响
作者：贾 光 刘世杰
单位：北京医科大学公共卫生学院劳动卫生教研室，北京100083
关键词：K2Cr2O7[Cr(Ⅵ)]；流式细胞技术；细胞增殖周期；蛋白质含量；DNA含量
中国工业医学杂志990608
摘要：目的 研究六价铬[Cr(Ⅵ)]对细胞增殖周期和细胞内蛋白质及DNA含量的影响。方法 应用流式细胞技术研究K2Cr2O7[Cr(Ⅵ)]对人胚肺细胞增殖周期和细胞内蛋白质及DNA含量的影响。结果 低剂量K2Cr2O7(0～1.250μmol/L)可刺激细胞增殖，2.500μmol/L及以上剂量K2Cr2O7可以抑制细胞增殖，细胞多数被阻断在S期(P<0.01)。细胞内蛋白质及DNA含量也随K2Cr2O7浓度增加而有降低趋势，在5.000μmol/L组，即有差异显著性(P<0.05)。结论 低剂量K2Cr2O7(0～1.250μmol/L)对细胞增殖的刺激作用，可能与六价铬多阶段致癌作用有关。
, http://www.100md.com
中图分类号：O614.61+1；Q253 文献标识码：A 文章编号：1002-221X(1999)06-0341-03
Effects of six-valent chromium on cell proliferation cycle and cellular contents of protein and DNA
JIA Guang，LIU Shi-jie
(Department of Occupational Health，Beijing Medical University，Beijing 100083，China)
Abstract：Objective To study the effects of six-valent chromium[Cr(Ⅵ)]on cell proliferation cycle and cellular contents of protein and DNA.Methods Effects of potassium dichromate[Cr(Ⅵ)]on cell proliferation cycle and cellular contents of protein and DNA in human embryo lung(HEL)cells were detected by flow cytometry.Results Low dose potassium dichromate (0～1.250)μmol/L) could stimulate cell proliferation，and a dose of 2.500 μmol/L or more could inhibit it and most of cell cycles were delayed at S phase(P<0.01).Cellular contents of protein and DNA showed a reducing trend with increasing doses of potassium dichromate，and there was significant difference in them with treatment of 5.000 μmol/L potassium dichromate(P<0.05).Conclusion Stimulation of cell proliferation cycle by low dose of potassium dichromate could correlate to the multistage carcinogenicity of Cr(Ⅵ).
, 百拇医药
Key words：Potassium dichromate；Flow cytometry；Cell proliferation cycle；Cellular protein；Cellular DNA
流式细胞技术(Flow cytometry，FCM)在细胞生物学领域有着广泛的应用。其中应用最频繁也最普遍的是细胞周期分析。随着荧光探针的不断开发和利用，应用FITC(异硫氰基荧光素)及PI(碘化丙定)双标记法即可同时检测细胞内蛋白质及DNA的含量。六价铬有着广泛的工业用途，同时也是一种明确的工业致癌物。为了研究六价铬的体外致癌机制，我们应用流式细胞技术观察了K2Cr2O7对人胚肺细胞(Human embryo lung cell，HEL cell)的增殖周期和蛋白质、DNA含量的影响。期望从细胞增殖角度，为六价铬致癌机制研究提供一定线索。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 细胞株
人胚肺细胞(HEL cell)由军事医学科学院毒物药物研究所赵修南同志建株并惠赠。常规培养。
1.2 细胞增殖周期[1]分析
取指数生长期的HEL细胞，加入含实验所需不同浓度K2Cr2O7的最低限度MEM型培养液，继续培养24小时，染毒结束时，用胰酶消化，PBS清洗，收集细胞，调整细胞浓度为1×106个细胞/ml，加入终浓度50μg/ml的RNase，室温放置30分钟，然后离心，将RNase洗去，再加入含0.1%Triton X-100及终浓度为50μg/ml PI的PBS，混匀，室温放置20～30分钟，上机检测，激发波长为488nm。
1.3 用PI、FITC双标记分析细胞蛋白质、DNA含量[1]
, 百拇医药
培养及染毒方法同细胞增殖周期分析。收集细胞，经台盼兰拒染实验，细胞存活率在95%以上。取1×106个细胞/ml，以pH为7.2的0.1mol/L PBS洗2遍，70%乙醇固定过夜，上机前洗去乙醇，用pH为5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液处理细胞30分钟，再以PBS洗一遍。悬浮细胞于1ml PBS，加入终浓度为50μg/ml的RNase，室温放置30分钟，再加入FITC 0.05μg/ml，置室温30分钟，最后加入PI，终浓度50μg/ml，20分钟后上机检查。FL1为FITC参数，反映蛋白质含量，激发波长495nm；FL2为PI参数，反映DNA含量，激发波长为488nm。
1.4 采用Primer软件中的χ2检验程序对数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 K2Cr2O7对HEL细胞周期的影响
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表1显示，正常细胞组G1/G0期细胞占72.93%，表1 K2Cr2O7染毒24小时对HEL细胞周期的影响(
±s，n＝3) 剂量(μmol/L)
细胞周期(%)
G1/G0
S
G2+M
0.000
72.93±2.10**
, http://www.100md.com
14.77±1.36**
12.30±3.36**
0.625
47.40±1.37**
26.63±0.47**
25.97±0.91**
1.250
30.87±0.21**
41.30±0.53**
27.83±0.67**
, http://www.100md.com
2.500
47.73±1.72**
36.93+0.42**
15.33±1.36**
5.000
55.20±1.45**
44.40±1.25**
0.40±0.26**
与对照组相比P<0.01(χ2检验)。
, 百拇医药 S期细胞占14.77%，G2+M期细胞占12.30%。染毒结束后，G1/G0期细胞明显减少，多数细胞进入S期和G2+M期。S期细胞所占比例随K2Cr2O7剂量增加而升高(P<0.01)。0.625μmol/L及1.250μmol/L K2Cr2O7组的G2+M期细胞所占比例明显高于对照组，且都有统计学意义(P<0.01)，但5.000μmol/L K2Cr2O7组，G2+M期细胞所占比例明显降低，几乎近于零，表明细胞基本被阻断在S期。
以上结果说明K2Cr2O7在0.625～1.250μmol/L组，可刺激细胞进入S期及G2+M期，表现为促进细胞增殖；当K2Cr2O7等于或大于2.500μmol/L时，细胞则被阻断在S期，因而G2+M期细胞所占比例明显递减。
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2.2 K2Cr2O7对HEL细胞蛋白质及DNA含量的影响
表2 K2Cr2O7染毒24小时对HEL细胞蛋白质及DNA含量的影响(±s，n＝3) 剂量(μmol/L)
FL1 (Protein)
FL2 (DNA)
左峰
右峰
左峰
右峰
, http://www.100md.com
0.000
3.37±0.83
96.63±0.77
3.30±0.19
96.70±0.19
0.625
5.97±0.24
94.03±0.29
5.08±0.53
94.92±0.53
1.250
7.31±0.78
, 百拇医药
92.69±0.70
7.05±0.98
92.95±0.97
2.500
8.30±0.73
91.70±0.81
8.41±0.34
91.59±0.31
5.000
13.58±3.29
86.42±3.19
, 百拇医药
12.90±4.09
87.10±4.05
与对照组相比P<0.05(χ2检验)。
表2中，FL1反映细胞内蛋白质含量的情况，FL1左峰表示低蛋白质含量的细胞所占比例，FL1右峰反映正常蛋白质含量的细胞所占比例；FL2反映的是细胞内DNA含量的情况，FL2左峰表示低DNA含量的细胞所占的比例，FL2右峰表示正常DNA含量的细胞所占的比例。随着K2Cr2O7染毒剂量的加大，低蛋白质及DNA含量的细胞所占的比例明显增加，这可能是K2Cr2O7抑制了细胞内蛋白质及DNA的合成，也可能是K2Cr2O7引起蛋白质及DNA的损伤，蛋白质分解的亚基或残体及小分子量的DNA片断从细胞漏出所致(并可能因细胞经乙醇固定，膜通透性增加)。
, 百拇医药
3 讨论
铬是动物和人体内必需的微量元素，参与糖、蛋白质、核酸、脂肪等的代谢，促进机体生长发育，也促进细胞的增殖和分裂。但同时铬又是一种确定的工业致癌物，所有的铬化合物在较高浓度都有毒性，铬的不同生物学作用取决于它的浓度。本研究的结果提示，从细胞周期分析来看，K2Cr2O7浓度在0～1.250μmol/L范围内，随剂量增加可明显地促进HEL细胞由G1期进入S期及G2+M期，即主要表现为促进增殖作用；当K2Cr2O7在2.500μmol/L及以上时，则可使多数细胞阻断于S期，分裂相明显减少，而呈现抑制细胞的增殖。同时，随K2Cr2O7剂量增加，细胞内蛋白质及DNA含量也逐渐减少。蛋白质及DNA是细胞结构的重要成分，它们的降解及结构的变化，势必会影响细胞的增殖及周期的变化。
, 百拇医药
低浓度K2Cr2O7对细胞增殖的刺激作用，可能与K2Cr2O7抑制生长负调控因子p53的表达有关[2]。另外，低浓度的K2Cr2O7也可能以细胞必需微量元素的身份部分地刺激细胞生长、增殖。而高浓度K2Cr2O7则主要表现为细胞毒性。
众所周知，增殖与分化异常是癌瘤细胞的重要生物学特征，低剂量K2Cr2O7对细胞增殖的刺激作用，有可能与六价铬多阶段致癌作用有关，但尚需与其他指标的变化相联系，全面进行分析考虑。
基金项目：卫生部科研基金资助(96-1-291)
作者简介：贾光(1968—)，女，山东人，博士，副教授，研究方向：职业肿瘤。
参考文献：
[1]杨景山，医学细胞化学与细胞生物学技术[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1990.381～410.
[2]贾光，刘世杰，吕有勇，等.Cr(Ⅵ)对人胚肺细胞p53及抑癌基因p21(WAF1)表达的影响[J].中华劳动卫生与职业病杂志，1998，16(4)：201.
收稿日期：1999-06-29, 百拇医药
单位：北京医科大学公共卫生学院劳动卫生教研室，北京100083
关键词：K2Cr2O7[Cr(Ⅵ)]；流式细胞技术；细胞增殖周期；蛋白质含量；DNA含量
中国工业医学杂志990608
摘要：目的 研究六价铬[Cr(Ⅵ)]对细胞增殖周期和细胞内蛋白质及DNA含量的影响。方法 应用流式细胞技术研究K2Cr2O7[Cr(Ⅵ)]对人胚肺细胞增殖周期和细胞内蛋白质及DNA含量的影响。结果 低剂量K2Cr2O7(0～1.250μmol/L)可刺激细胞增殖，2.500μmol/L及以上剂量K2Cr2O7可以抑制细胞增殖，细胞多数被阻断在S期(P<0.01)。细胞内蛋白质及DNA含量也随K2Cr2O7浓度增加而有降低趋势，在5.000μmol/L组，即有差异显著性(P<0.05)。结论 低剂量K2Cr2O7(0～1.250μmol/L)对细胞增殖的刺激作用，可能与六价铬多阶段致癌作用有关。
, http://www.100md.com
中图分类号：O614.61+1；Q253 文献标识码：A 文章编号：1002-221X(1999)06-0341-03
Effects of six-valent chromium on cell proliferation cycle and cellular contents of protein and DNA
JIA Guang，LIU Shi-jie
(Department of Occupational Health，Beijing Medical University，Beijing 100083，China)
Abstract：Objective To study the effects of six-valent chromium[Cr(Ⅵ)]on cell proliferation cycle and cellular contents of protein and DNA.Methods Effects of potassium dichromate[Cr(Ⅵ)]on cell proliferation cycle and cellular contents of protein and DNA in human embryo lung(HEL)cells were detected by flow cytometry.Results Low dose potassium dichromate (0～1.250)μmol/L) could stimulate cell proliferation，and a dose of 2.500 μmol/L or more could inhibit it and most of cell cycles were delayed at S phase(P<0.01).Cellular contents of protein and DNA showed a reducing trend with increasing doses of potassium dichromate，and there was significant difference in them with treatment of 5.000 μmol/L potassium dichromate(P<0.05).Conclusion Stimulation of cell proliferation cycle by low dose of potassium dichromate could correlate to the multistage carcinogenicity of Cr(Ⅵ).
, 百拇医药
Key words：Potassium dichromate；Flow cytometry；Cell proliferation cycle；Cellular protein；Cellular DNA
流式细胞技术(Flow cytometry，FCM)在细胞生物学领域有着广泛的应用。其中应用最频繁也最普遍的是细胞周期分析。随着荧光探针的不断开发和利用，应用FITC(异硫氰基荧光素)及PI(碘化丙定)双标记法即可同时检测细胞内蛋白质及DNA的含量。六价铬有着广泛的工业用途，同时也是一种明确的工业致癌物。为了研究六价铬的体外致癌机制，我们应用流式细胞技术观察了K2Cr2O7对人胚肺细胞(Human embryo lung cell，HEL cell)的增殖周期和蛋白质、DNA含量的影响。期望从细胞增殖角度，为六价铬致癌机制研究提供一定线索。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 细胞株
人胚肺细胞(HEL cell)由军事医学科学院毒物药物研究所赵修南同志建株并惠赠。常规培养。
1.2 细胞增殖周期[1]分析
取指数生长期的HEL细胞，加入含实验所需不同浓度K2Cr2O7的最低限度MEM型培养液，继续培养24小时，染毒结束时，用胰酶消化，PBS清洗，收集细胞，调整细胞浓度为1×106个细胞/ml，加入终浓度50μg/ml的RNase，室温放置30分钟，然后离心，将RNase洗去，再加入含0.1%Triton X-100及终浓度为50μg/ml PI的PBS，混匀，室温放置20～30分钟，上机检测，激发波长为488nm。
1.3 用PI、FITC双标记分析细胞蛋白质、DNA含量[1]
, 百拇医药
培养及染毒方法同细胞增殖周期分析。收集细胞，经台盼兰拒染实验，细胞存活率在95%以上。取1×106个细胞/ml，以pH为7.2的0.1mol/L PBS洗2遍，70%乙醇固定过夜，上机前洗去乙醇，用pH为5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液处理细胞30分钟，再以PBS洗一遍。悬浮细胞于1ml PBS，加入终浓度为50μg/ml的RNase，室温放置30分钟，再加入FITC 0.05μg/ml，置室温30分钟，最后加入PI，终浓度50μg/ml，20分钟后上机检查。FL1为FITC参数，反映蛋白质含量，激发波长495nm；FL2为PI参数，反映DNA含量，激发波长为488nm。
1.4 采用Primer软件中的χ2检验程序对数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 K2Cr2O7对HEL细胞周期的影响
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表1显示，正常细胞组G1/G0期细胞占72.93%，表1 K2Cr2O7染毒24小时对HEL细胞周期的影响(
±s，n＝3) 剂量(μmol/L)细胞周期(%)
G1/G0
S
G2+M
0.000
72.93±2.10**
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14.77±1.36**
12.30±3.36**
0.625
47.40±1.37**
26.63±0.47**
25.97±0.91**
1.250
30.87±0.21**
41.30±0.53**
27.83±0.67**
, http://www.100md.com
2.500
47.73±1.72**
36.93+0.42**
15.33±1.36**
5.000
55.20±1.45**
44.40±1.25**
0.40±0.26**
与对照组相比P<0.01(χ2检验)。
, 百拇医药 S期细胞占14.77%，G2+M期细胞占12.30%。染毒结束后，G1/G0期细胞明显减少，多数细胞进入S期和G2+M期。S期细胞所占比例随K2Cr2O7剂量增加而升高(P<0.01)。0.625μmol/L及1.250μmol/L K2Cr2O7组的G2+M期细胞所占比例明显高于对照组，且都有统计学意义(P<0.01)，但5.000μmol/L K2Cr2O7组，G2+M期细胞所占比例明显降低，几乎近于零，表明细胞基本被阻断在S期。
以上结果说明K2Cr2O7在0.625～1.250μmol/L组，可刺激细胞进入S期及G2+M期，表现为促进细胞增殖；当K2Cr2O7等于或大于2.500μmol/L时，细胞则被阻断在S期，因而G2+M期细胞所占比例明显递减。
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2.2 K2Cr2O7对HEL细胞蛋白质及DNA含量的影响
表2 K2Cr2O7染毒24小时对HEL细胞蛋白质及DNA含量的影响(
±s，n＝3) 剂量(μmol/L)FL1 (Protein)
FL2 (DNA)
左峰
右峰
左峰
右峰
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0.000
3.37±0.83
96.63±0.77
3.30±0.19
96.70±0.19
0.625
5.97±0.24
94.03±0.29
5.08±0.53
94.92±0.53
1.250
7.31±0.78
, 百拇医药
92.69±0.70
7.05±0.98
92.95±0.97
2.500
8.30±0.73
91.70±0.81
8.41±0.34
91.59±0.31
5.000
13.58±3.29
86.42±3.19
, 百拇医药
12.90±4.09
87.10±4.05
与对照组相比P<0.05(χ2检验)。
表2中，FL1反映细胞内蛋白质含量的情况，FL1左峰表示低蛋白质含量的细胞所占比例，FL1右峰反映正常蛋白质含量的细胞所占比例；FL2反映的是细胞内DNA含量的情况，FL2左峰表示低DNA含量的细胞所占的比例，FL2右峰表示正常DNA含量的细胞所占的比例。随着K2Cr2O7染毒剂量的加大，低蛋白质及DNA含量的细胞所占的比例明显增加，这可能是K2Cr2O7抑制了细胞内蛋白质及DNA的合成，也可能是K2Cr2O7引起蛋白质及DNA的损伤，蛋白质分解的亚基或残体及小分子量的DNA片断从细胞漏出所致(并可能因细胞经乙醇固定，膜通透性增加)。
, 百拇医药
3 讨论
铬是动物和人体内必需的微量元素，参与糖、蛋白质、核酸、脂肪等的代谢，促进机体生长发育，也促进细胞的增殖和分裂。但同时铬又是一种确定的工业致癌物，所有的铬化合物在较高浓度都有毒性，铬的不同生物学作用取决于它的浓度。本研究的结果提示，从细胞周期分析来看，K2Cr2O7浓度在0～1.250μmol/L范围内，随剂量增加可明显地促进HEL细胞由G1期进入S期及G2+M期，即主要表现为促进增殖作用；当K2Cr2O7在2.500μmol/L及以上时，则可使多数细胞阻断于S期，分裂相明显减少，而呈现抑制细胞的增殖。同时，随K2Cr2O7剂量增加，细胞内蛋白质及DNA含量也逐渐减少。蛋白质及DNA是细胞结构的重要成分，它们的降解及结构的变化，势必会影响细胞的增殖及周期的变化。
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低浓度K2Cr2O7对细胞增殖的刺激作用，可能与K2Cr2O7抑制生长负调控因子p53的表达有关[2]。另外，低浓度的K2Cr2O7也可能以细胞必需微量元素的身份部分地刺激细胞生长、增殖。而高浓度K2Cr2O7则主要表现为细胞毒性。
众所周知，增殖与分化异常是癌瘤细胞的重要生物学特征，低剂量K2Cr2O7对细胞增殖的刺激作用，有可能与六价铬多阶段致癌作用有关，但尚需与其他指标的变化相联系，全面进行分析考虑。
基金项目：卫生部科研基金资助(96-1-291)
作者简介：贾光(1968—)，女，山东人，博士，副教授，研究方向：职业肿瘤。
参考文献：
[1]杨景山，医学细胞化学与细胞生物学技术[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1990.381～410.
[2]贾光，刘世杰，吕有勇，等.Cr(Ⅵ)对人胚肺细胞p53及抑癌基因p21(WAF1)表达的影响[J].中华劳动卫生与职业病杂志，1998，16(4)：201.
收稿日期：1999-06-29, 百拇医药