阿霉素中毒大鼠心肌肌浆网钙调节功能的变化
作者：张亚臣 荣烨之 吕宝经 赵美华 黄国芳 杨谨文
单位：上海第二医科大学附属新华医院心内科(上海200092)
关键词：阿霉素/中毒；心肌；肌浆网；钙
肿瘤990610 中图分类号：R73-361 文章标识码：A 文章编号：1000-7431(1999)06-0350-03
阿霉素是一种高效抗肿瘤药物，然而它的临床应用因其心脏毒性作用受到极大限制。阿霉素的心脏毒性作用主要分为两类：1.急性毒性作用，主要表现为房性或室性心律失常[1]；2.慢性毒性作用，主要表现为阿霉素剂量依赖性心肌病；两者最终都可导致心力衰竭[2，3]，但它们发生的机理不尽相同。急性者细胞核凝集成块，近核膜分布，大部分线粒体嵴断裂消失，形成空泡[4]；而慢性者除有细胞核及线粒体变化外还存在严重的肌浆网水肿、空泡变等病理变化[5]。本研究是在上述基础上对阿霉素(Doxorubicin，DOX)急性、亚急性中毒心肌肌浆网(SR)钙调节功能进行研究，以期进一步探索DOX中毒机制，为临床合理应用DOX提供理论依据。
, 百拇医药
材料与方法
一、试剂 45Ca-CaCl2由中国原子能研究所(北京)提供，放射性比度50 mci/g Ca,比浓度6.0 mci/ml；Na2-ATP、EGTA、HEPES、NaN3等为Sigma公司产品；阿霉素为意大利生产；其它试剂均为分析纯。
二、阿霉素中毒大鼠心肌模型制备[4，5] Wistar雄性大白鼠25只，体重200 g±20 g，随机分为3组：对照组7只，尾静脉注射生理盐水；阿霉素急性中毒组(DOX1)9只，由尾静脉一次性注射阿霉素5 mg/kg，于注射DOX后1小时取心脏检测；阿霉素亚急性中毒组(DOX2)9只，阿霉素按2 mg/kg经尾静脉注射，每周1次，连续4周，末次注射后再隔1周解剖动物，取心肌检测。
三、心肌SR的制备
, 百拇医药
应用改良的Jone LR[6]法提取SR粗制膜，全部操作在4℃环境完成。快速取出心脏，去除结缔组织，称重后将心肌剪碎，加入5倍体积的A溶液(mmol/L:NaHCO3 10.0,NaN3 3.0,EGTA 0.1,蔗糖300，pH 7.0)，匀浆后3000×g离心20 min，取上清，14 000×g离心20 min，收集上清液于38 000×g离心90 min，弃上清，将沉淀悬浮于B溶液(mmol/L：蔗糖250,HEPES 20，pH 7.2)，考马斯亮蓝G-250染色法[7]测定SR膜的蛋白浓度后，置于-80℃保存。
四、心肌SR摄取45Ca2+的测定
用Millipore滤过技术测定SR的ATP依赖性45Ca2+摄取量。反应基质液为：(mmol/L)KCl 120，HEPES 20，NaN3 5.0, MgCl2 3.0,Na2-oralate 5.0，45Ca2+ 0.05，pH 7.2。将20 μg SR 蛋白质与基质液预先在37℃温育90秒，加入终浓度为3.5 mmol/L的Na2-ATP启动SR对45Ca2+的摄取反应，而后于不同时间加入4℃终止液(mmol/L：KCl 120,Tris 100,LaCl3 2.5,pH 7.2)2.5 ml，快速通过直径0.45μm的微孔滤膜，用终止液冲洗清除试管内和滤膜上未被SR囊泡摄取的残余钙。滤膜干燥后加入闪烁液，上机测定滤膜的放射活性。根据加ATP与不加ATP的滤膜放射活性之差计算特异性ATP依赖SR45Ca2+摄取量。每个样本均采用双管平行测定。
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五、心肌SR释放45Ca2+的测定
取20 μg SR蛋白质与反应基质液(同上)预先在37℃温育90秒后加入3.5 mmol/L(终浓度)Na2-ATP触发45Ca2+的摄取，待摄取达饱和后，立即向反应液中加入DOX(终浓度为1 μmol/L)诱发SR的钙释放，于不同时间点加入反应终止液并快速将SR置于直径为0.45 μm的微孔滤膜上抽滤，以后步骤同上。
六、统计方法 所有结果以
±s表示，组间差异的比较采用t检验。
结果
一、SR摄取钙功能的变化
, 百拇医药 图1为各组SR摄钙量的时间曲线。在加入ATP的最初2 min内，SR的钙摄取量与反应时间成正比，反映SR摄钙的初速率，在8 min左右，SR的摄钙量达饱和。结果表明：在急性DOX中毒动物无论是SR摄钙初速率还是总摄钙量与正常组比较均无明显差异；而亚急性DOX中毒动物SR摄钙初速率较正常对照组降低40.2%±4.2%(P<0.01)，总摄钙量降低34.6%±3%(P<0.01)。说明在亚急性中毒组SR摄钙功能明显损伤。
图1 各组SR摄取钙的时间曲线
二、SR的钙释放功能变化
图2为各组SR释放钙百分率的时间曲线。在加入ATP 8 min后，SR的摄钙量达到饱和。向反应液中加入DOX诱发SR的钙释放。在最初2 min内，SR的钙释放速度很快，钙释放百分率(即钙释放量占总饱和量百分比)与反应时间成正比，反映SR释放钙的初速率。在8 min时SR钙释放百分率达平衡。结果表明：阿霉素亚急性中毒大鼠心肌SR钙释放的初速率为41.4%±3.1%较对照组增加12.3%±1.2%(P<0.05)，8 min时释钙百分率为67.8%±3.8%较对照组增加17.1%±2.1%(P<0.01)；而急性中毒心肌SR释钙百分率与对照组比较无明显变化。提示：阿霉素亚急性中毒组心肌SR对阿霉素毒性作用的敏感性强于急性中毒组。
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图2 各组SR钙释放酚率时间曲线
讨论
阿霉素致心肌损伤的机理十分复杂，迄今无一明确的结论。近年来研究表明，细胞内钙离子超负荷损伤可能是其主要发病机理[8，9]；研究认为，(1)阿霉素可促进SR的钙释放，有证据表明阿霉素可改变SR的功能，它与终末池SR的钙释放通道部分片段结合，引起钙释放通道的脂质双层变构，通道开放，引起钙释放增加[10]；(2)阿霉素对线粒体的影响，由于线粒体在心肌细胞钙过负荷时过多地摄取钙，导致线粒体结构及功能异常，减低ATP的产生和激酶磷酸化，使心肌细胞内能量代谢发生障碍，导致细胞损伤甚至坏死[11]；(3)阿霉素的代谢产物Doxorubicinol也可促进SR的钙释放，并可阻断膜Na+-K+-ATPase，影响细胞内SR上的钙结合位点，最终导致细胞内钙离子过负荷[12]。本研究结果发现急性与亚急性阿霉素大鼠心肌SR的钙调节功能有明显差别，亚急性中毒组心肌SR摄钙功能显著下降，SR对阿霉素的钙释放效应敏感性明显增加，而急性中毒组心肌SR钙调功能无明显变化。与以往报道相符[4，5]。作者认为阿霉素慢性及亚急性中毒导致的心肌损伤与肌浆网功能损伤密切相关，而急性中毒的有关机制还有待于进一步探讨。
, 百拇医药
作者简介：张亚臣，男，博士，主治医师。
参考文献 [1]Steinberg JS,Cohen AJ,Wasserman AG, et al. Acute arrhythmogenicity of doxorubicin administration〔J〕.Cancer,1987,60:1213
[2]Schwartz RG,Mckenzie WB,Alexander J, et al. Congestive heart failure and left ventricular dysfunction complicating doxorubicin therapy〔J〕.Am J Med,1987,82:1109
[3]Lipshultz SE,Colan SD,Gellber RD, et al. Late cardiac effects of doxorubicin therapy for acute lymphoblastic leukemia in childhood〔J〕.N Engl J Med,1991,324:808
, 百拇医药
[4]荣烨之，余贤如，蔡青，等.阿霉素急性中毒大鼠心肌形态学变化〔J〕.肿瘤，1983，3：6
[5]温文虎，荣烨之，余贤如，等.阿霉素对大白鼠亚急性心肌毒性作用的动物模型观察〔J〕.肿瘤，1985，5(3)：101
[6]Jone LR.Separation of vesicles of cardiac sarcolemma from vesicles of cardiac sarcoplasmic veticulum-comparative biochemical analysis of component activities〔J〕. J Biol Chem,1979,254(2):530
[7]吴如丹.溶液中蛋白质浓度的测定〔M〕.见：鲁子贤主编，蛋白质和酶学研究方法，第1册.第1版.北京：科学出版社，1989：1
, 百拇医药
[8]Singal PK,Deally CMR,Weinberg LE.Subcellular effects of adriamycin in the heart: a concise review〔J〕.J Mol Cell Cardiol,1987,19:817
[9]Olson RD,Mushlin PS.Doxorubicin cardiotoxicity:analysis of prevailing hypotheses〔J〕.FASEB J,1990,4:3076
[10]Zorzato F,Margreth A,Volpe P, et al. Direct photoafinity labeling of junctional sarcoplasmic reticulum with [14C]doxorubicin〔J〕. J Biol Chem,1986,261:13252
, http://www.100md.com
[11]Holmberg S,Poole WPA,Williams AJ. Interactions of doxorubicin and mitoxantrone with the calcium release channel from cardiac sarcoplasmic reticulum:a possible basis for cardiotoxicity〔J〕.Circulation,1989,80(Suppl Ⅱ)：Ⅱ-141.Abstract.
[12]Olson RD,Mushlin PS,Brenner DE, et al. Doxorubicin cardiotoxicity may be caused by its metabolite,doxorubicinol〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:3585
(收稿日期：1997-05-18 修回日期：1997-09-29), 百拇医药
单位：上海第二医科大学附属新华医院心内科(上海200092)
关键词：阿霉素/中毒；心肌；肌浆网；钙
肿瘤990610 中图分类号：R73-361 文章标识码：A 文章编号：1000-7431(1999)06-0350-03
阿霉素是一种高效抗肿瘤药物，然而它的临床应用因其心脏毒性作用受到极大限制。阿霉素的心脏毒性作用主要分为两类：1.急性毒性作用，主要表现为房性或室性心律失常[1]；2.慢性毒性作用，主要表现为阿霉素剂量依赖性心肌病；两者最终都可导致心力衰竭[2，3]，但它们发生的机理不尽相同。急性者细胞核凝集成块，近核膜分布，大部分线粒体嵴断裂消失，形成空泡[4]；而慢性者除有细胞核及线粒体变化外还存在严重的肌浆网水肿、空泡变等病理变化[5]。本研究是在上述基础上对阿霉素(Doxorubicin，DOX)急性、亚急性中毒心肌肌浆网(SR)钙调节功能进行研究，以期进一步探索DOX中毒机制，为临床合理应用DOX提供理论依据。
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材料与方法
一、试剂 45Ca-CaCl2由中国原子能研究所(北京)提供，放射性比度50 mci/g Ca,比浓度6.0 mci/ml；Na2-ATP、EGTA、HEPES、NaN3等为Sigma公司产品；阿霉素为意大利生产；其它试剂均为分析纯。
二、阿霉素中毒大鼠心肌模型制备[4，5] Wistar雄性大白鼠25只，体重200 g±20 g，随机分为3组：对照组7只，尾静脉注射生理盐水；阿霉素急性中毒组(DOX1)9只，由尾静脉一次性注射阿霉素5 mg/kg，于注射DOX后1小时取心脏检测；阿霉素亚急性中毒组(DOX2)9只，阿霉素按2 mg/kg经尾静脉注射，每周1次，连续4周，末次注射后再隔1周解剖动物，取心肌检测。
三、心肌SR的制备
, 百拇医药
应用改良的Jone LR[6]法提取SR粗制膜，全部操作在4℃环境完成。快速取出心脏，去除结缔组织，称重后将心肌剪碎，加入5倍体积的A溶液(mmol/L:NaHCO3 10.0,NaN3 3.0,EGTA 0.1,蔗糖300，pH 7.0)，匀浆后3000×g离心20 min，取上清，14 000×g离心20 min，收集上清液于38 000×g离心90 min，弃上清，将沉淀悬浮于B溶液(mmol/L：蔗糖250,HEPES 20，pH 7.2)，考马斯亮蓝G-250染色法[7]测定SR膜的蛋白浓度后，置于-80℃保存。
四、心肌SR摄取45Ca2+的测定
用Millipore滤过技术测定SR的ATP依赖性45Ca2+摄取量。反应基质液为：(mmol/L)KCl 120，HEPES 20，NaN3 5.0, MgCl2 3.0,Na2-oralate 5.0，45Ca2+ 0.05，pH 7.2。将20 μg SR 蛋白质与基质液预先在37℃温育90秒，加入终浓度为3.5 mmol/L的Na2-ATP启动SR对45Ca2+的摄取反应，而后于不同时间加入4℃终止液(mmol/L：KCl 120,Tris 100,LaCl3 2.5,pH 7.2)2.5 ml，快速通过直径0.45μm的微孔滤膜，用终止液冲洗清除试管内和滤膜上未被SR囊泡摄取的残余钙。滤膜干燥后加入闪烁液，上机测定滤膜的放射活性。根据加ATP与不加ATP的滤膜放射活性之差计算特异性ATP依赖SR45Ca2+摄取量。每个样本均采用双管平行测定。
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五、心肌SR释放45Ca2+的测定
取20 μg SR蛋白质与反应基质液(同上)预先在37℃温育90秒后加入3.5 mmol/L(终浓度)Na2-ATP触发45Ca2+的摄取，待摄取达饱和后，立即向反应液中加入DOX(终浓度为1 μmol/L)诱发SR的钙释放，于不同时间点加入反应终止液并快速将SR置于直径为0.45 μm的微孔滤膜上抽滤，以后步骤同上。
六、统计方法 所有结果以
±s表示，组间差异的比较采用t检验。结果
一、SR摄取钙功能的变化
, 百拇医药 图1为各组SR摄钙量的时间曲线。在加入ATP的最初2 min内，SR的钙摄取量与反应时间成正比，反映SR摄钙的初速率，在8 min左右，SR的摄钙量达饱和。结果表明：在急性DOX中毒动物无论是SR摄钙初速率还是总摄钙量与正常组比较均无明显差异；而亚急性DOX中毒动物SR摄钙初速率较正常对照组降低40.2%±4.2%(P<0.01)，总摄钙量降低34.6%±3%(P<0.01)。说明在亚急性中毒组SR摄钙功能明显损伤。
图1 各组SR摄取钙的时间曲线
二、SR的钙释放功能变化
图2为各组SR释放钙百分率的时间曲线。在加入ATP 8 min后，SR的摄钙量达到饱和。向反应液中加入DOX诱发SR的钙释放。在最初2 min内，SR的钙释放速度很快，钙释放百分率(即钙释放量占总饱和量百分比)与反应时间成正比，反映SR释放钙的初速率。在8 min时SR钙释放百分率达平衡。结果表明：阿霉素亚急性中毒大鼠心肌SR钙释放的初速率为41.4%±3.1%较对照组增加12.3%±1.2%(P<0.05)，8 min时释钙百分率为67.8%±3.8%较对照组增加17.1%±2.1%(P<0.01)；而急性中毒心肌SR释钙百分率与对照组比较无明显变化。提示：阿霉素亚急性中毒组心肌SR对阿霉素毒性作用的敏感性强于急性中毒组。
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图2 各组SR钙释放酚率时间曲线
讨论
阿霉素致心肌损伤的机理十分复杂，迄今无一明确的结论。近年来研究表明，细胞内钙离子超负荷损伤可能是其主要发病机理[8，9]；研究认为，(1)阿霉素可促进SR的钙释放，有证据表明阿霉素可改变SR的功能，它与终末池SR的钙释放通道部分片段结合，引起钙释放通道的脂质双层变构，通道开放，引起钙释放增加[10]；(2)阿霉素对线粒体的影响，由于线粒体在心肌细胞钙过负荷时过多地摄取钙，导致线粒体结构及功能异常，减低ATP的产生和激酶磷酸化，使心肌细胞内能量代谢发生障碍，导致细胞损伤甚至坏死[11]；(3)阿霉素的代谢产物Doxorubicinol也可促进SR的钙释放，并可阻断膜Na+-K+-ATPase，影响细胞内SR上的钙结合位点，最终导致细胞内钙离子过负荷[12]。本研究结果发现急性与亚急性阿霉素大鼠心肌SR的钙调节功能有明显差别，亚急性中毒组心肌SR摄钙功能显著下降，SR对阿霉素的钙释放效应敏感性明显增加，而急性中毒组心肌SR钙调功能无明显变化。与以往报道相符[4，5]。作者认为阿霉素慢性及亚急性中毒导致的心肌损伤与肌浆网功能损伤密切相关，而急性中毒的有关机制还有待于进一步探讨。
, 百拇医药
作者简介：张亚臣，男，博士，主治医师。
参考文献 [1]Steinberg JS,Cohen AJ,Wasserman AG, et al. Acute arrhythmogenicity of doxorubicin administration〔J〕.Cancer,1987,60:1213
[2]Schwartz RG,Mckenzie WB,Alexander J, et al. Congestive heart failure and left ventricular dysfunction complicating doxorubicin therapy〔J〕.Am J Med,1987,82:1109
[3]Lipshultz SE,Colan SD,Gellber RD, et al. Late cardiac effects of doxorubicin therapy for acute lymphoblastic leukemia in childhood〔J〕.N Engl J Med,1991,324:808
, 百拇医药
[4]荣烨之，余贤如，蔡青，等.阿霉素急性中毒大鼠心肌形态学变化〔J〕.肿瘤，1983，3：6
[5]温文虎，荣烨之，余贤如，等.阿霉素对大白鼠亚急性心肌毒性作用的动物模型观察〔J〕.肿瘤，1985，5(3)：101
[6]Jone LR.Separation of vesicles of cardiac sarcolemma from vesicles of cardiac sarcoplasmic veticulum-comparative biochemical analysis of component activities〔J〕. J Biol Chem,1979,254(2):530
[7]吴如丹.溶液中蛋白质浓度的测定〔M〕.见：鲁子贤主编，蛋白质和酶学研究方法，第1册.第1版.北京：科学出版社，1989：1
, 百拇医药
[8]Singal PK,Deally CMR,Weinberg LE.Subcellular effects of adriamycin in the heart: a concise review〔J〕.J Mol Cell Cardiol,1987,19:817
[9]Olson RD,Mushlin PS.Doxorubicin cardiotoxicity:analysis of prevailing hypotheses〔J〕.FASEB J,1990,4:3076
[10]Zorzato F,Margreth A,Volpe P, et al. Direct photoafinity labeling of junctional sarcoplasmic reticulum with [14C]doxorubicin〔J〕. J Biol Chem,1986,261:13252
, http://www.100md.com
[11]Holmberg S,Poole WPA,Williams AJ. Interactions of doxorubicin and mitoxantrone with the calcium release channel from cardiac sarcoplasmic reticulum:a possible basis for cardiotoxicity〔J〕.Circulation,1989,80(Suppl Ⅱ)：Ⅱ-141.Abstract.
[12]Olson RD,Mushlin PS,Brenner DE, et al. Doxorubicin cardiotoxicity may be caused by its metabolite,doxorubicinol〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:3585
(收稿日期：1997-05-18 修回日期：1997-09-29), 百拇医药