卵巢癌药物敏感基因治疗实验研究——(Ⅱ)体内实验
作者：徐丛剑 张惜阴 许秀兰 金志军 丰有吉 姚 明 顾 峻 曹斌融 顾健人
单位：徐丛剑 张惜阴 丰有吉 曹斌融 上海医科大学妇产科医院(上海200011)；许秀兰 姚 明 顾 峻 顾健人 上海市肿瘤研究所；金志军 第二军医大学长征医院妇产科
关键词：卵巢肿瘤；基因治疗；逆转录病毒载体；单纯疱疹病毒；胸腺嘧啶核苷激酶基因；羟甲基无环鸟苷；小鼠，裸
肿瘤990608 中图分类号：R73-36 文章标识码：A 文章编号：1000-7431(1999)06-0345-03
为探索将单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因/羟甲基无环鸟苷(HSV1-tk/GCV)药物敏感基因治疗系统应用于卵巢癌，本刊[1]已介绍体外实验结果，现将体内实验情况介绍如下。
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材料与方法
1.细胞来源及培养详见文献[1] GCV仍由Roch Syntex公司惠赠；4～6周龄BALB/c裸小鼠由上海市肿瘤研究所动物室提供并饲养。
2.AO皮下移植瘤治疗 本组12只裸鼠，每只裸鼠左右侧前背部皮下以5号针头分别接种5×106的AO细胞或AO/HSV1-tkc细胞。2周后选取左右两侧背部皮下触摸肿块大小较一致的9只裸鼠，每只腹腔注射GCV 100 mg/kg。w，进行治疗14日。治疗前后每5日测量瘤体最长径(a)和最短径(b)1次，计算肿瘤体积V(mm3)=1/6πab2。治疗结束后3日处死裸鼠，取瘤称重。治疗及未治疗(另3只)裸鼠均取小块瘤体作光镜及电镜检查，并以FACS检测肿瘤细胞DNA含量。
3.网膜移植 同上将体外培养的AO，AO/HSV1-tkc细胞接种于裸鼠背部皮下，6周后处死裸鼠取出瘤体，切成大小较一致的小瘤块，AO 16块，AO/HSV1-tkc 11块，再从中分别剔去较大和较小的瘤块各3块，剩余瘤块(AO 10块，AO/HSV1-tkc 5块)浸于生理盐水中备用。所提取的瘤块称重以估计所用瘤块重量(AO平均0.058 g AO/HSV1-tkc 平均0.063g)。另取10只裸鼠，腹腔注射戊巴比妥钠45 mg/kg。w，麻醉平稳后剖开腹壁，以7/0缝线将AO瘤块分别缝扎于每只裸鼠的脾区网膜，并作半包埋，关闭腹腔后随机分为两组，一组为AO对照组，另一组为体内感染组(网膜移植后RV体内感染)，每组5只。再取5只裸鼠作为体外感染组，AO/HSV1-tkc瘤块同上法移植于脾区网膜。
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4.网膜移植后RV体内感染 VPC/HSV1-tkc[1]培养液吸出后以0.22 μm微孔滤膜过滤后注入体内感染组裸鼠(移植术后48 h)腹腔内，每只1 ml/日，共14日。同时给另两组裸鼠(AO对照组，体外感染组)腹腔注射普通培养液。
5.网膜移植瘤治疗 体内感染组和体外感染组最后分别进行腹腔注射每日GCV 100 mg/kg。w，5天为1疗程，休2天，共2个疗程。同时给对照组裸鼠腹腔注射等体积生理盐水。治疗结束后2日处死全部裸鼠腹腔注射等体积生理盐水。治疗结束后2日处死全部裸鼠，取瘤称重，并作电镜检查及HE染色光镜检查。
结果
1.GCV对携有HSV1-tk的人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的生长抑制：
注射GCV前后裸鼠两侧肿瘤体积变化见图1。
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图1 注射GCV前后AO及AO/HSV1-tkc肿瘤体积变化
(经配对t检验，与对照组比较，*：P>0.05；＃P<0.01)
治疗结束后3天裸鼠左侧(AO)肿瘤重量为0.661±0.260 g，右侧(AO/HSV1-tkc)肿瘤重量为0.087±0.036 g，经配对t检验P<0.01，两组有显著性差异。
HE染色光镜检查提示，AO/HSV1-tkc肿瘤细胞形态与AO肿瘤细胞无明显差异，而经过GCV治疗后残存的AO/HSV1-tkc肿瘤细胞显著肥大，细胞内可见大量空泡，少数细胞核固缩，裂解，偶可见凋亡细胞。透射电镜下，多数残存的AO/HSV1-tkc肿瘤细胞核内染色质表现为异染色质状态，核内偶可见较大包含物，细胞浆内细胞器较为丰富，糖原颗粒显著增多，并可见许多呈坏死溶解状态的细胞，偶可见呈固缩状态的细胞及可疑的凋亡小体。FACS检测结果见表1。
, 百拇医药
表1 用GCV与未用GCV的AO及AO/HSV1-tkc肿瘤FACS检测 细胞
用药
细胞周期各期细胞比例(%)
DI*
G1
S
G2+M
AO
-
1.88
61.1
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38.5
0.4
AO
+
1.76
75.6
22.7
1.7
AO/HSV1-tkc
-
1.75
57.6
38.9
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3.3
AO/HSV1-tkc
+
2.35
49.1
46.1
4.7
*肿瘤细胞相对于正常细胞的DNA含量比值
2.HSV1-tkc/GCV基因治疗系统对人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤的作用：
三组裸鼠肿瘤(含脾区网膜及部分胰腺，表中同)重量见表2。表2 三组裸鼠网膜移植瘤重量比较 组 别
, 百拇医药
肿瘤重量(
±s,g)
抑瘤率(w/w,%)
对照组
2.16±1.49
体内感染组
1.15±0.453
46.8
体外感染组
0.166±0.079*
92.3
*与对照组比较P<0.05 三组肿瘤大多仅累及网膜及胰腺，仅对照组中1例侵及脾脏及胰腺，所有肿瘤均呈单一生长，易于分离切除。体内感染组中有一只裸鼠治疗结束后第2天夜间因严重腹腔感染死亡(死亡时间距其它裸鼠死亡少于10 h)，而体外感染组仅1只目检可见网膜上有肿瘤结节。病理组织学检查：对照组肿瘤与皮下移植瘤比较无明显差异；体内感染组大部分区域与体外感染组相似；体外感染组5只镜下均可见癌巢，显微结构变化与AO/HSV1-tkc皮下移植瘤经GCV治疗后形态相同。
, 百拇医药
讨论
1.关于实施体内基因治疗实验的基因转导方式
如何将外源目的基因转导到靶细胞中是实施体内基因治疗实验的一项关键技术，也决定了该项研究将来的应用前景和应用方式。本研究分别从ex vivo(即先在体外导入目的基因，再移植入体内进行治疗)和in vivo(即直接在体内对靶细胞进行基因转移和治疗)两种研究途径入手，观察HSV1-tk/GCV基因治疗系统对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤和网膜移植瘤的体内治疗作用。
在ex vivo的实验中，作者观察到GCV对AO/HSV1-tkc网膜移植瘤的抑瘤率达92.3%，如除去网膜本身的重量的影响则更高(事实上，在本组实验中仅有4例见镜下癌巢)。这一结果显著高于GCV对AO/HSV1-tkc皮下移植瘤的抑瘤率(86.8%)。这可能是由于GCV直接接触肿瘤细胞，且肿瘤细胞死亡后在网膜中更容易被清除所致的结果。
, 百拇医药
然而，在实际以体内肿瘤细胞为靶细胞的临床治疗中，ex vivo的方法是难以得到应用的。因此，只有应用in vivo的实验方法才能真正考察RV/HSV1-tkc/GCV系统对卵巢癌的综合治疗作用。
iv vivo的具体实验方法有多种。既往曾有作者将病毒产生细胞注射到大鼠脑肿瘤部位，再给予GCV治疗，结果导致肿瘤完全消失[1]。藉此提出的肿瘤治疗临床治疗计划，已获得美国食品与药品管理局(FDA)批准。但卵巢癌存在于腹腔，不存在血脑屏障的分隔，且由于发现时大多已发生广泛种植转移，因而肿瘤分布较为弥散。根据这一特点，国外有学者曾以培养的卵巢癌细胞注入裸鼠腹腔后再注射ADV.RSV-TK病毒液及GCV进行治疗也获得了较好的结果[2]。但作者在先期的实验中观察到裸鼠腹腔注射卵巢癌细胞其成瘤及生存期的一致性较差，不利于实验结果的观察和统计分析。鉴于人卵巢癌大网膜转移较为常见，本文作者在实践中摸索构建了裸鼠网膜移植瘤模型，具有成瘤率高，肿瘤生长一致性好，便于计量分析的特点[3]。同时，本研究设计以VPC/HSV1-tkc培养液反复进行腹腔注射，使逆转录病毒载体(RV)在体内多次感染肿瘤细胞，再给予GCV进行治疗。结果表明，以这一方法治疗人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤其抑瘤率为46.8%，说明这一方法有一定疗效。但在本实验中，肿瘤以瘤块形式存在不利于RV与肿瘤细胞的密切接触，这就影响了目的基因(HSV1-tkc)的转导。而在临床治疗中如在卵巢肿瘤减灭术后再应用这一治疗方法，则手术残留的少量肿瘤细胞可与RV充分接触，可能会进一步提高RV感染率及对肿瘤的治疗作用。
, 百拇医药
2.逆转录病毒载体(RV)的体内应用
RV的特点是能将目的基因携入处于分裂增殖状态的细胞[4]。肿瘤细胞与正常细胞相比，其增殖较为活跃，因此这一治疗系统本身就具有一定的靶向性，但在腹腔内尚有其它一些细胞如上皮细胞等增殖也较活跃，也可能被这一治疗系统损伤。本实验中一只裸鼠严重感染死亡是否与此有关有待进一步研究。
3.体内实验与体外实验结果比较
本部分体内实验进一步证实，GCV在裸鼠体内代谢后仍可高效杀伤携有HSV1-tkc基因的卵巢癌细胞，从而抑制肿瘤生长，但残余肿瘤细胞S期及G2、M期细胞比例均明显增高，提示残存细胞增殖活跃，需加用化疗药物以进一步提高远期疗效。
总之，RV/HSV1-tkc/GCV基因治疗系统在卵巢癌的治疗上大有良好的应用前景，值得进一步深入研究。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助 39800144
参考文献[1]徐丛剑，张惜阴，许秀兰，等.卵巢癌药物敏感基因治疗实验研究-(Ⅰ)体外实验〔J〕.肿瘤，1999，19(3)：177
[2]Culkver KW,Ram Z,Wallbridge S,et al.In vivo gene transfer with retroviral vector-produce cells for treatment of experimental brain tumors〔J〕,Science,1992,256:1550
[3]Tong XW,Block A,Chen SH, et al. In vivo gene therapy of ovarian cancer by adenovirus-mediated thymidine kinase gene transduction and ganciclovir administration〔J〕.Gynecol Oncol,1996,61(2):175
[4]徐丛剑，金志军，丰有吉，等.人卵巢癌裸鼠腹腔及网膜移植的研究〔J〕.现代妇产科进展，1997，6(2)：111
[5]Miller DG,Adom M,Miller AD.Gene transfer retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replieating at the time of infection〔J〕. Mol Cell Biol,1990,10(8):4239
(收稿日期：1998-11-12 修回日期：1999-02-19), 百拇医药
单位：徐丛剑 张惜阴 丰有吉 曹斌融 上海医科大学妇产科医院(上海200011)；许秀兰 姚 明 顾 峻 顾健人 上海市肿瘤研究所；金志军 第二军医大学长征医院妇产科
关键词：卵巢肿瘤；基因治疗；逆转录病毒载体；单纯疱疹病毒；胸腺嘧啶核苷激酶基因；羟甲基无环鸟苷；小鼠，裸
肿瘤990608 中图分类号：R73-36 文章标识码：A 文章编号：1000-7431(1999)06-0345-03
为探索将单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因/羟甲基无环鸟苷(HSV1-tk/GCV)药物敏感基因治疗系统应用于卵巢癌，本刊[1]已介绍体外实验结果，现将体内实验情况介绍如下。
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材料与方法
1.细胞来源及培养详见文献[1] GCV仍由Roch Syntex公司惠赠；4～6周龄BALB/c裸小鼠由上海市肿瘤研究所动物室提供并饲养。
2.AO皮下移植瘤治疗 本组12只裸鼠，每只裸鼠左右侧前背部皮下以5号针头分别接种5×106的AO细胞或AO/HSV1-tkc细胞。2周后选取左右两侧背部皮下触摸肿块大小较一致的9只裸鼠，每只腹腔注射GCV 100 mg/kg。w，进行治疗14日。治疗前后每5日测量瘤体最长径(a)和最短径(b)1次，计算肿瘤体积V(mm3)=1/6πab2。治疗结束后3日处死裸鼠，取瘤称重。治疗及未治疗(另3只)裸鼠均取小块瘤体作光镜及电镜检查，并以FACS检测肿瘤细胞DNA含量。
3.网膜移植 同上将体外培养的AO，AO/HSV1-tkc细胞接种于裸鼠背部皮下，6周后处死裸鼠取出瘤体，切成大小较一致的小瘤块，AO 16块，AO/HSV1-tkc 11块，再从中分别剔去较大和较小的瘤块各3块，剩余瘤块(AO 10块，AO/HSV1-tkc 5块)浸于生理盐水中备用。所提取的瘤块称重以估计所用瘤块重量(AO平均0.058 g AO/HSV1-tkc 平均0.063g)。另取10只裸鼠，腹腔注射戊巴比妥钠45 mg/kg。w，麻醉平稳后剖开腹壁，以7/0缝线将AO瘤块分别缝扎于每只裸鼠的脾区网膜，并作半包埋，关闭腹腔后随机分为两组，一组为AO对照组，另一组为体内感染组(网膜移植后RV体内感染)，每组5只。再取5只裸鼠作为体外感染组，AO/HSV1-tkc瘤块同上法移植于脾区网膜。
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4.网膜移植后RV体内感染 VPC/HSV1-tkc[1]培养液吸出后以0.22 μm微孔滤膜过滤后注入体内感染组裸鼠(移植术后48 h)腹腔内，每只1 ml/日，共14日。同时给另两组裸鼠(AO对照组，体外感染组)腹腔注射普通培养液。
5.网膜移植瘤治疗 体内感染组和体外感染组最后分别进行腹腔注射每日GCV 100 mg/kg。w，5天为1疗程，休2天，共2个疗程。同时给对照组裸鼠腹腔注射等体积生理盐水。治疗结束后2日处死全部裸鼠腹腔注射等体积生理盐水。治疗结束后2日处死全部裸鼠，取瘤称重，并作电镜检查及HE染色光镜检查。
结果
1.GCV对携有HSV1-tk的人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的生长抑制：
注射GCV前后裸鼠两侧肿瘤体积变化见图1。
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图1 注射GCV前后AO及AO/HSV1-tkc肿瘤体积变化
(经配对t检验，与对照组比较，*：P>0.05；＃P<0.01)
治疗结束后3天裸鼠左侧(AO)肿瘤重量为0.661±0.260 g，右侧(AO/HSV1-tkc)肿瘤重量为0.087±0.036 g，经配对t检验P<0.01，两组有显著性差异。
HE染色光镜检查提示，AO/HSV1-tkc肿瘤细胞形态与AO肿瘤细胞无明显差异，而经过GCV治疗后残存的AO/HSV1-tkc肿瘤细胞显著肥大，细胞内可见大量空泡，少数细胞核固缩，裂解，偶可见凋亡细胞。透射电镜下，多数残存的AO/HSV1-tkc肿瘤细胞核内染色质表现为异染色质状态，核内偶可见较大包含物，细胞浆内细胞器较为丰富，糖原颗粒显著增多，并可见许多呈坏死溶解状态的细胞，偶可见呈固缩状态的细胞及可疑的凋亡小体。FACS检测结果见表1。
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表1 用GCV与未用GCV的AO及AO/HSV1-tkc肿瘤FACS检测 细胞
用药
细胞周期各期细胞比例(%)
DI*
G1
S
G2+M
AO
-
1.88
61.1
, http://www.100md.com
38.5
0.4
AO
+
1.76
75.6
22.7
1.7
AO/HSV1-tkc
-
1.75
57.6
38.9
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3.3
AO/HSV1-tkc
+
2.35
49.1
46.1
4.7
*肿瘤细胞相对于正常细胞的DNA含量比值
2.HSV1-tkc/GCV基因治疗系统对人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤的作用：
三组裸鼠肿瘤(含脾区网膜及部分胰腺，表中同)重量见表2。表2 三组裸鼠网膜移植瘤重量比较 组 别
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肿瘤重量(
±s,g)抑瘤率(w/w,%)
对照组
2.16±1.49
体内感染组
1.15±0.453
46.8
体外感染组
0.166±0.079*
92.3
*与对照组比较P<0.05 三组肿瘤大多仅累及网膜及胰腺，仅对照组中1例侵及脾脏及胰腺，所有肿瘤均呈单一生长，易于分离切除。体内感染组中有一只裸鼠治疗结束后第2天夜间因严重腹腔感染死亡(死亡时间距其它裸鼠死亡少于10 h)，而体外感染组仅1只目检可见网膜上有肿瘤结节。病理组织学检查：对照组肿瘤与皮下移植瘤比较无明显差异；体内感染组大部分区域与体外感染组相似；体外感染组5只镜下均可见癌巢，显微结构变化与AO/HSV1-tkc皮下移植瘤经GCV治疗后形态相同。
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讨论
1.关于实施体内基因治疗实验的基因转导方式
如何将外源目的基因转导到靶细胞中是实施体内基因治疗实验的一项关键技术，也决定了该项研究将来的应用前景和应用方式。本研究分别从ex vivo(即先在体外导入目的基因，再移植入体内进行治疗)和in vivo(即直接在体内对靶细胞进行基因转移和治疗)两种研究途径入手，观察HSV1-tk/GCV基因治疗系统对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤和网膜移植瘤的体内治疗作用。
在ex vivo的实验中，作者观察到GCV对AO/HSV1-tkc网膜移植瘤的抑瘤率达92.3%，如除去网膜本身的重量的影响则更高(事实上，在本组实验中仅有4例见镜下癌巢)。这一结果显著高于GCV对AO/HSV1-tkc皮下移植瘤的抑瘤率(86.8%)。这可能是由于GCV直接接触肿瘤细胞，且肿瘤细胞死亡后在网膜中更容易被清除所致的结果。
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然而，在实际以体内肿瘤细胞为靶细胞的临床治疗中，ex vivo的方法是难以得到应用的。因此，只有应用in vivo的实验方法才能真正考察RV/HSV1-tkc/GCV系统对卵巢癌的综合治疗作用。
iv vivo的具体实验方法有多种。既往曾有作者将病毒产生细胞注射到大鼠脑肿瘤部位，再给予GCV治疗，结果导致肿瘤完全消失[1]。藉此提出的肿瘤治疗临床治疗计划，已获得美国食品与药品管理局(FDA)批准。但卵巢癌存在于腹腔，不存在血脑屏障的分隔，且由于发现时大多已发生广泛种植转移，因而肿瘤分布较为弥散。根据这一特点，国外有学者曾以培养的卵巢癌细胞注入裸鼠腹腔后再注射ADV.RSV-TK病毒液及GCV进行治疗也获得了较好的结果[2]。但作者在先期的实验中观察到裸鼠腹腔注射卵巢癌细胞其成瘤及生存期的一致性较差，不利于实验结果的观察和统计分析。鉴于人卵巢癌大网膜转移较为常见，本文作者在实践中摸索构建了裸鼠网膜移植瘤模型，具有成瘤率高，肿瘤生长一致性好，便于计量分析的特点[3]。同时，本研究设计以VPC/HSV1-tkc培养液反复进行腹腔注射，使逆转录病毒载体(RV)在体内多次感染肿瘤细胞，再给予GCV进行治疗。结果表明，以这一方法治疗人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤其抑瘤率为46.8%，说明这一方法有一定疗效。但在本实验中，肿瘤以瘤块形式存在不利于RV与肿瘤细胞的密切接触，这就影响了目的基因(HSV1-tkc)的转导。而在临床治疗中如在卵巢肿瘤减灭术后再应用这一治疗方法，则手术残留的少量肿瘤细胞可与RV充分接触，可能会进一步提高RV感染率及对肿瘤的治疗作用。
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2.逆转录病毒载体(RV)的体内应用
RV的特点是能将目的基因携入处于分裂增殖状态的细胞[4]。肿瘤细胞与正常细胞相比，其增殖较为活跃，因此这一治疗系统本身就具有一定的靶向性，但在腹腔内尚有其它一些细胞如上皮细胞等增殖也较活跃，也可能被这一治疗系统损伤。本实验中一只裸鼠严重感染死亡是否与此有关有待进一步研究。
3.体内实验与体外实验结果比较
本部分体内实验进一步证实，GCV在裸鼠体内代谢后仍可高效杀伤携有HSV1-tkc基因的卵巢癌细胞，从而抑制肿瘤生长，但残余肿瘤细胞S期及G2、M期细胞比例均明显增高，提示残存细胞增殖活跃，需加用化疗药物以进一步提高远期疗效。
总之，RV/HSV1-tkc/GCV基因治疗系统在卵巢癌的治疗上大有良好的应用前景，值得进一步深入研究。
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基金项目：国家自然科学基金资助 39800144
参考文献[1]徐丛剑，张惜阴，许秀兰，等.卵巢癌药物敏感基因治疗实验研究-(Ⅰ)体外实验〔J〕.肿瘤，1999，19(3)：177
[2]Culkver KW,Ram Z,Wallbridge S,et al.In vivo gene transfer with retroviral vector-produce cells for treatment of experimental brain tumors〔J〕,Science,1992,256:1550
[3]Tong XW,Block A,Chen SH, et al. In vivo gene therapy of ovarian cancer by adenovirus-mediated thymidine kinase gene transduction and ganciclovir administration〔J〕.Gynecol Oncol,1996,61(2):175
[4]徐丛剑，金志军，丰有吉，等.人卵巢癌裸鼠腹腔及网膜移植的研究〔J〕.现代妇产科进展，1997，6(2)：111
[5]Miller DG,Adom M,Miller AD.Gene transfer retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replieating at the time of infection〔J〕. Mol Cell Biol,1990,10(8):4239
(收稿日期：1998-11-12 修回日期：1999-02-19), 百拇医药