粉防己碱对急性缺血性肾损伤细胞凋亡的影响
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《急诊医学》
作者：钱玲梅 王笑云 冷 静
单位：钱玲梅 210029南京，南京医科大学第一附属医院急诊中心；王笑云 南京医科大学第一附属医院肾脏科；冷静 南京医科大学病理教研室
关键词：粉防己碱；细胞凋亡；急性缺血性肾损伤；缺血—再灌流
急诊医学990603 【摘要】 目的：探讨粉防己碱在急性缺血性肾损伤中的作用及与细胞凋亡的关系。方法：在钳夹双侧肾蒂45min致大鼠急性缺血性肾损伤模型的基础上，采用肾组织切片HE染色、肾组织DNA片段分析及原位末端转移酶标记法等技术，定性、定量分析了急性缺血性肾损伤时肾小管上皮细胞的凋亡现象。结果：急性缺血性肾损伤时，肾小管上皮细胞的凋亡现象明显增加；粉防己碱对急性缺血性肾损伤具有保护作用，能够明显降低受损肾小管的细胞凋亡水平。结论：急性缺血性肾损伤时，中药粉防己碱能够调节肾小管上皮细胞的凋亡水平，以减轻肾组织的损伤。
, 百拇医药
Changes of apoptosis in rats of acute ischemic
renal injury under the treatment of tetrandrine
Qian Lingmei，Wang Xiaoyun，Leng Jing.
Department of Emergency，First affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029
【Abstract】 Aim：To elucidate the effect of tetrandrine on acute ischemic renal injury and the relation between tetrandrine and apoptosis.Methods：A model for bilateral post-ischemic renal injury in rats was developed by calmping renal pedicles for 45 minutes，renal tissular DNA fragmentation analysis and renal tissular HE staining were used.Also the quantative analysis of apoptosis in injuried renal tubular epithelial was carried out by using TdT-mediated dUTP nick and labeling (TUNEL).Results：Apoptosis of renal tubular epithelial increased in acute ischemic renal injury.Tetrandrine can remarkably decrease the level of apoptosis in injuried renal tubule while protecting renal tissue against the ischemic injuries.Conclusion：Tetrandrine can adjust the level of apoptosis in renal tubular epithelial and alleviate renal tissular injury.
, 百拇医药
【Key words】 Tetrandrine Apoptosis Acute ischemic renal injury Reperfusion
现已知，急性缺血性肾损伤时，肾小管上皮细胞会出现广泛的细胞凋亡现象，其机制可能与细胞微粒体内Na+，K+-ATPase活性下降、磷脂酶A2(PLA2)活化与释放、细胞内钙离子水平增加等因素有关[1]。由于细胞凋亡是一种重要的细胞受损标志和可以调节的生命现象[2]，目前国外一些学者已提出使用某些药物调节(抑制/诱导)细胞凋亡水平，减轻组织损伤，达到恢复机体正常生理状态的设想[3]。中药粉防己碱(tetrandrine)是一种传统利水渗湿药，我们在先前的研究中已经发现，该药能够明显抑制PLA2的活化与释放，对急性缺血性肾损伤具有保护作用[4]，然而该药对急性缺血性肾损伤时肾小管上皮细胞的凋亡水平是否有影响至今未见报道。为此，本文在肾组织切片HE染色观察粉防己碱对急性缺血性肾损伤保护作用的同时，采用肾组织DNA片段分析及原位末端转移酶标记(TUNEL标记法)等技术，从形态学角度定量定性分析了肾小管上皮细胞凋亡在粉防己碱干预急性缺血性肾损伤过程中的变化，以探讨粉防己碱与细胞凋亡之间的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物分组与处理
雄性SD大鼠，体重200～300g，采用钳夹大鼠双侧肾蒂45min的方法制备肾急性缺血性动物模型。模型大鼠分用药及未用药组，另设假手术组作为对照。其中，用药及未用药组按不同再灌流时间(12、24、48、72h)再分四组，并于模型制备前30min及制备后4、22、46、70h分别灌胃药液粉防己碱0.3ml/100g(以pH 7.4磷酸盐缓冲液新鲜配制，浓度为20mg/ml)或等量磷酸盐缓冲液。
1.2 标本收集
模型制备后，于缺血后再灌流12、24、48、72h时，分别留取各实验组大鼠肾脏。右肾取最大剖面，并立即放入4%多聚甲醛中固定，制成石蜡切片后，用做TUNEL标记及HE染色。左肾则储存于-80℃冰箱，用于肾组织DNA片段分析。
, 百拇医药
1.3 方 法
采用TUNEL标记法[5]定量分析肾组织细胞凋亡，按试剂盒(In Situ Cell Detection Kit，AP，BM公司产品)说明书进行，并设立阳性对照组(标记前先行DNA酶处理，模拟细胞凋亡时出现的DNA断裂点)与阴性对照组(标记液中只含dUTP-荧光素和dNTP，不加TdT酶溶液)。肾组织DNA片段分析则采用琼脂糖凝胶电泳法[2]。实验中主要试剂均为Bochringer Mannheim公司的产品。
1.4 阳性计数及统计
1.4.1 HE染色切片
光镜下全面观察肾脏病变后，在计算机图像分析系统的高倍视野(×40)下，随机观察皮髓交界处100个肾小管的组织形态，并计数其中的损伤肾小管数。
, 百拇医药
1.4.2 TUNEL法标记切片
光镜下观察、计数(个/40×物镜视野)，每片随机取10个视野，计数所有阳性显色的细胞核，取其平均数进行统计。
1.4.3 统计方法
方差齐性检验后采用t检验或t′检验进行统计分析。
2 结 果
2.1 肾组织DNA片段分析
琼脂糖凝胶电泳可见缺血再灌流后肾组织DNA电泳图，呈出180bp及其倍体的梯形条带(DNA Ladder)；正常对照组则不出现，证明缺血再灌流后，肾组织确有细胞凋亡的发生。
2.2 HE染色切片的观察结果
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2.2.1 一般情况
正常组大鼠肾组织切片未发现明显的形态学变化，而其余各组中可见肾小管上皮细胞核固缩、核碎裂、核贴膜；细胞浆浓缩，染色嗜酸性增强；结构消失并分散成数块，肾小管轮廓结构尚清晰，基底膜仍保留完好，有些管腔内可见死亡的细胞胞浆残留物质及蛋白管型形成等，但均无炎症细胞浸润现象。
2.2.2 缺血再灌流不同时相各组大鼠皮髓交界肾小管损伤程度(见表1)
表1 缺血再灌流后用药组与未用药组大鼠
皮髓交界损伤肾小管数的比较(
±s)
n
用药组
, 百拇医药
未用药组
P值
12h
6
37.67±11.02
59.33±2.94
<0.005
24h
6
33.33±6.62
49.83±9.37
<0.01
48h
, 百拇医药
6
15.17±3.49
27.67±2.88
<0.001
72h
3
4.67±1.15
11.67±2.89
<0.05
2.3 TUNEL标记法切片的观察结果
阳性对照切片的所有细胞核均被标记，呈蓝紫色，而阴性对照切片均无细胞核被标记。
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表2可见，在缺血再灌流的各时相，未用药组细胞凋亡水平均明显高于正常组，而用药组细胞凋亡水平均低于未用药组。表2 用药、未用药组、正常组大鼠肾小管
细胞凋亡水平(个/视野)的比较(±s) 再灌流时
间(h)
正常组
未用药组
用药组
3.67±0.72
(3)
12
24.45±2.81*
, 百拇医药
16.88±0.56▲▲
(6)
(6)
24
20.45±1.38*
14.32±1.78▲▲
(6)
(6)
48
13.80±1.37*
9.12±1.03▲▲
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(6)
(6)
72
9.50±0.79*
5.67±0.68▲
(3)
(3)
注：括号内为每组大鼠数：*P<0.001，未用药组与正常组比较；▲P<0.005，▲▲P<0.001，用药组与未用药组比较3 讨 论
近年来，作为一种基本的生命现象，细胞凋亡在急性缺血性肾损伤病理生理中的作用已经引起了肾脏病学术界的极大关注。它是基因控制下的一种程序性细胞死亡，常与器官的形状、组织的维持、生长与退化有关。另一方面也可以说凋亡是一个清除器官或组织中多余细胞(包括损伤细胞及癌变前细胞)的过程。因此，在各种严重疾病或自身稳定因素受到明显干扰与破坏时，会发生明显的异常。目前，细胞凋亡在各种疾病发生发展过程中的作用虽未完全得以阐明，但鉴于细胞凋亡可以调节这一特性，国外一些学者已经提出使用某些药物来调节(抑制/诱导)细胞凋亡水平，通过减轻组织损伤或促进异常细胞死亡，达到恢复机体正常生理状态的设想[3]。如生长因子依赖性的肿瘤细胞可因为去除生长因子而发生凋亡，对激素敏感的乳腺癌或前列腺癌也可因去除雌激素或雄激素而诱发凋亡。
, 百拇医药
粉防己碱，其主要成分是汉防己碱甲素和汉防己碱乙素。前期研究已经证实它对急性缺血性肾损伤有保护性作用，能够明显降低血清肌酐和尿素氮水平，改善肾小球滤过率与肾血浆流量[4]。本文则利用大鼠急性缺血性肾损伤模型，从肾组织HE染色切片中也观察到，急性缺血性肾损伤时肾小管损伤以皮髓交界处最为严重，而粉防己碱用药组肾小管损伤程度明显低于未用药组(P<0.001)，从而进一步从形态学角度证实了中药粉防己碱对于急性缺血性肾损伤的保护性作用。
肾组织DNA片段分析则发现，正常大鼠肾组织并不出现DNA梯形图，而缺血再灌注后肾组织出现了特征性的DNA梯形格局；同时，肾组织HE染色切片中观察到的受损肾小管上皮细胞形态学变化则与细胞凋亡的早期形态学特征[6]相一致，因而提示，细胞凋亡作为组织细胞受损的一个反应指标，与急性缺血性肾损伤的发生机制有关，且是缺血性肾损伤时细胞死亡的一个主要死亡方式之一。
进一步采用TUNEL标记法定量分析肾小管的细胞凋亡水平，结果表明正常大鼠肾组织切片中凋亡细胞较少，缺血再灌注12～72h各时相凋亡细胞均显著增多(P值均<0.001)，而用药组肾小管上皮细胞凋亡水平却明显低于未用药组(P值均<0.005)，因而提示粉防己碱在急性缺血性肾损伤过程中可通过降低过多的肾小管上皮细胞凋亡，达到减轻肾小管上皮细胞损伤、促进肾组织修复的作用。
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有关粉防己碱减少肾小管细胞凋亡的作用机理，目前尚不明确。其发生机制可能是：1)该药具有增加细胞微粒体内Na+，K+-ATPase活性的作用[7]，能够减少急性缺血性肾损伤状态下肾小管上皮细胞内ATP水平的下降程度而使凋亡水平减轻[8]；2)该药能够抑制Na+-Ca
交换，阻滞钙离子向细胞内发生内流[9]，而钙内流则是引起细胞凋亡的一个重要因素；3)该药可以通过抑制PLA2，降低体内花生四烯酸释放的各种代谢产物，明显抑制TXA2合成，而使用TXA2则能诱导未成熟胸腺细胞，使之出现明显的细胞凋亡现象[10]。至于粉防己碱是参与了各种凋亡相关基因的调控，还是通过减轻组织损伤使过多的肾组织细胞凋亡水平明显下降，则有待于做进一步的研究。
, 百拇医药
图1 肾小管上皮细胞核固缩、碎裂，细胞图浆浓缩，结构消失并
分解成块状，肾小管基底底膜及轮廓尚好，周围无炎症反应。
2 未用药组，肾缺血再灌流72h时，可见部分肾小管尚未修复，且有核分裂现象(
)
图3 用药组、肾缺血再灌注72h时，肾小管已基本修复正常
图4 DNA片段凝胶电泳图
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1 为marker；2、3、4 系缺血再灌流12h肾组织DNA电泳图呈梯形改变；
5、6、7 为正常肾组织DNA电泳图
图5 TUNEL标记的阳性对照片，大部分细胞核被标记成紫红色或蓝紫色，胞浆未显色
图6 TUNEL标记的阴性对照片，所有细胞核均未显色，组织背景良好。
参考文献
1 Schumer M，Colombel MC，Sawchuk IS，et al.Morphologic，biochemical，and molecular evidence of apoptosis during the reperfusion phase after brief periods of renal ischemia.Am J Pathol，1992，140：831.
, 百拇医药
2 Majno G，Joris I.Apoptosis，oncosis，and necrosis：an overview of cell death.Am J Pathol，1995，146：3.
3 Lieberthal W，Levine JS.Mechanisms of apoptosis and its potential role in renal tubular epithelial cell injury.Am J Physiol，1996，271：F477.
4 钱玲梅，王笑云.粉防己碱在急性缺血性肾损伤中的作用及与磷脂酶A2的关系.南京医科大学学报，1998，18：5.
5 Gold R，Schmied M，Giegerich G，et al.Differentiation between cellular apoptosis and necrosis by the combined use of in situ tailing and nick translation techniques.Lab Invest，1994，71：219.
, http://www.100md.com
6 Gobe G，Fung LCT，Buttyan R：Hallmarks and consequences of apoptosis and necrosis in the kidney.In： Goligorsky MS，Stein JH eds.Acute renal failure(New concepts and therapeutic strategies).Part I.New York：Churchill Livingstone Press，1995.143～144
7 陈念航，王幼林，丁建花.粉防己碱增加自发性高血压大鼠心脏微粒体Na+，K+-ATPase活性.中国药理学报，1993，14：320.
8 Lieberthal W，Triaca V，Levine J.Mitochondrial inhibitors induce apoptosis in renal tubular epithelial cells(Abstract).J Am Soc Nephrol，1995，6：983.
, 百拇医药
9 Fang DC，Jing MX.Studies on tetrandrine calcium antagonistic action.Chin Med J，1986，99：638.
10 Ushikubi F，Aiba Y，Nakamura K，et al.Thromboxane A2 receptor is highly expressed in mouse immature thymocytes and mediates DNA fragmentation and apoptosis .J Exp Med，1993，178：1825.
收稿：1999-03-25, 百拇医药
单位：钱玲梅 210029南京，南京医科大学第一附属医院急诊中心；王笑云 南京医科大学第一附属医院肾脏科；冷静 南京医科大学病理教研室
关键词：粉防己碱；细胞凋亡；急性缺血性肾损伤；缺血—再灌流
急诊医学990603 【摘要】 目的：探讨粉防己碱在急性缺血性肾损伤中的作用及与细胞凋亡的关系。方法：在钳夹双侧肾蒂45min致大鼠急性缺血性肾损伤模型的基础上，采用肾组织切片HE染色、肾组织DNA片段分析及原位末端转移酶标记法等技术，定性、定量分析了急性缺血性肾损伤时肾小管上皮细胞的凋亡现象。结果：急性缺血性肾损伤时，肾小管上皮细胞的凋亡现象明显增加；粉防己碱对急性缺血性肾损伤具有保护作用，能够明显降低受损肾小管的细胞凋亡水平。结论：急性缺血性肾损伤时，中药粉防己碱能够调节肾小管上皮细胞的凋亡水平，以减轻肾组织的损伤。
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Changes of apoptosis in rats of acute ischemic
renal injury under the treatment of tetrandrine
Qian Lingmei，Wang Xiaoyun，Leng Jing.
Department of Emergency，First affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029
【Abstract】 Aim：To elucidate the effect of tetrandrine on acute ischemic renal injury and the relation between tetrandrine and apoptosis.Methods：A model for bilateral post-ischemic renal injury in rats was developed by calmping renal pedicles for 45 minutes，renal tissular DNA fragmentation analysis and renal tissular HE staining were used.Also the quantative analysis of apoptosis in injuried renal tubular epithelial was carried out by using TdT-mediated dUTP nick and labeling (TUNEL).Results：Apoptosis of renal tubular epithelial increased in acute ischemic renal injury.Tetrandrine can remarkably decrease the level of apoptosis in injuried renal tubule while protecting renal tissue against the ischemic injuries.Conclusion：Tetrandrine can adjust the level of apoptosis in renal tubular epithelial and alleviate renal tissular injury.
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【Key words】 Tetrandrine Apoptosis Acute ischemic renal injury Reperfusion
现已知，急性缺血性肾损伤时，肾小管上皮细胞会出现广泛的细胞凋亡现象，其机制可能与细胞微粒体内Na+，K+-ATPase活性下降、磷脂酶A2(PLA2)活化与释放、细胞内钙离子水平增加等因素有关[1]。由于细胞凋亡是一种重要的细胞受损标志和可以调节的生命现象[2]，目前国外一些学者已提出使用某些药物调节(抑制/诱导)细胞凋亡水平，减轻组织损伤，达到恢复机体正常生理状态的设想[3]。中药粉防己碱(tetrandrine)是一种传统利水渗湿药，我们在先前的研究中已经发现，该药能够明显抑制PLA2的活化与释放，对急性缺血性肾损伤具有保护作用[4]，然而该药对急性缺血性肾损伤时肾小管上皮细胞的凋亡水平是否有影响至今未见报道。为此，本文在肾组织切片HE染色观察粉防己碱对急性缺血性肾损伤保护作用的同时，采用肾组织DNA片段分析及原位末端转移酶标记(TUNEL标记法)等技术，从形态学角度定量定性分析了肾小管上皮细胞凋亡在粉防己碱干预急性缺血性肾损伤过程中的变化，以探讨粉防己碱与细胞凋亡之间的关系。
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1 材料与方法
1.1 动物分组与处理
雄性SD大鼠，体重200～300g，采用钳夹大鼠双侧肾蒂45min的方法制备肾急性缺血性动物模型。模型大鼠分用药及未用药组，另设假手术组作为对照。其中，用药及未用药组按不同再灌流时间(12、24、48、72h)再分四组，并于模型制备前30min及制备后4、22、46、70h分别灌胃药液粉防己碱0.3ml/100g(以pH 7.4磷酸盐缓冲液新鲜配制，浓度为20mg/ml)或等量磷酸盐缓冲液。
1.2 标本收集
模型制备后，于缺血后再灌流12、24、48、72h时，分别留取各实验组大鼠肾脏。右肾取最大剖面，并立即放入4%多聚甲醛中固定，制成石蜡切片后，用做TUNEL标记及HE染色。左肾则储存于-80℃冰箱，用于肾组织DNA片段分析。
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1.3 方 法
采用TUNEL标记法[5]定量分析肾组织细胞凋亡，按试剂盒(In Situ Cell Detection Kit，AP，BM公司产品)说明书进行，并设立阳性对照组(标记前先行DNA酶处理，模拟细胞凋亡时出现的DNA断裂点)与阴性对照组(标记液中只含dUTP-荧光素和dNTP，不加TdT酶溶液)。肾组织DNA片段分析则采用琼脂糖凝胶电泳法[2]。实验中主要试剂均为Bochringer Mannheim公司的产品。
1.4 阳性计数及统计
1.4.1 HE染色切片
光镜下全面观察肾脏病变后，在计算机图像分析系统的高倍视野(×40)下，随机观察皮髓交界处100个肾小管的组织形态，并计数其中的损伤肾小管数。
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1.4.2 TUNEL法标记切片
光镜下观察、计数(个/40×物镜视野)，每片随机取10个视野，计数所有阳性显色的细胞核，取其平均数进行统计。
1.4.3 统计方法
方差齐性检验后采用t检验或t′检验进行统计分析。
2 结 果
2.1 肾组织DNA片段分析
琼脂糖凝胶电泳可见缺血再灌流后肾组织DNA电泳图，呈出180bp及其倍体的梯形条带(DNA Ladder)；正常对照组则不出现，证明缺血再灌流后，肾组织确有细胞凋亡的发生。
2.2 HE染色切片的观察结果
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2.2.1 一般情况
正常组大鼠肾组织切片未发现明显的形态学变化，而其余各组中可见肾小管上皮细胞核固缩、核碎裂、核贴膜；细胞浆浓缩，染色嗜酸性增强；结构消失并分散成数块，肾小管轮廓结构尚清晰，基底膜仍保留完好，有些管腔内可见死亡的细胞胞浆残留物质及蛋白管型形成等，但均无炎症细胞浸润现象。
2.2.2 缺血再灌流不同时相各组大鼠皮髓交界肾小管损伤程度(见表1)
表1 缺血再灌流后用药组与未用药组大鼠
皮髓交界损伤肾小管数的比较(
±s)n
用药组
, 百拇医药
未用药组
P值
12h
6
37.67±11.02
59.33±2.94
<0.005
24h
6
33.33±6.62
49.83±9.37
<0.01
48h
, 百拇医药
6
15.17±3.49
27.67±2.88
<0.001
72h
3
4.67±1.15
11.67±2.89
<0.05
2.3 TUNEL标记法切片的观察结果
阳性对照切片的所有细胞核均被标记，呈蓝紫色，而阴性对照切片均无细胞核被标记。
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表2可见，在缺血再灌流的各时相，未用药组细胞凋亡水平均明显高于正常组，而用药组细胞凋亡水平均低于未用药组。表2 用药、未用药组、正常组大鼠肾小管
细胞凋亡水平(个/视野)的比较(
±s) 再灌流时间(h)
正常组
未用药组
用药组
3.67±0.72
(3)
12
24.45±2.81*
, 百拇医药
16.88±0.56▲▲
(6)
(6)
24
20.45±1.38*
14.32±1.78▲▲
(6)
(6)
48
13.80±1.37*
9.12±1.03▲▲
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72
9.50±0.79*
5.67±0.68▲
(3)
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注：括号内为每组大鼠数：*P<0.001，未用药组与正常组比较；▲P<0.005，▲▲P<0.001，用药组与未用药组比较3 讨 论
近年来，作为一种基本的生命现象，细胞凋亡在急性缺血性肾损伤病理生理中的作用已经引起了肾脏病学术界的极大关注。它是基因控制下的一种程序性细胞死亡，常与器官的形状、组织的维持、生长与退化有关。另一方面也可以说凋亡是一个清除器官或组织中多余细胞(包括损伤细胞及癌变前细胞)的过程。因此，在各种严重疾病或自身稳定因素受到明显干扰与破坏时，会发生明显的异常。目前，细胞凋亡在各种疾病发生发展过程中的作用虽未完全得以阐明，但鉴于细胞凋亡可以调节这一特性，国外一些学者已经提出使用某些药物来调节(抑制/诱导)细胞凋亡水平，通过减轻组织损伤或促进异常细胞死亡，达到恢复机体正常生理状态的设想[3]。如生长因子依赖性的肿瘤细胞可因为去除生长因子而发生凋亡，对激素敏感的乳腺癌或前列腺癌也可因去除雌激素或雄激素而诱发凋亡。
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粉防己碱，其主要成分是汉防己碱甲素和汉防己碱乙素。前期研究已经证实它对急性缺血性肾损伤有保护性作用，能够明显降低血清肌酐和尿素氮水平，改善肾小球滤过率与肾血浆流量[4]。本文则利用大鼠急性缺血性肾损伤模型，从肾组织HE染色切片中也观察到，急性缺血性肾损伤时肾小管损伤以皮髓交界处最为严重，而粉防己碱用药组肾小管损伤程度明显低于未用药组(P<0.001)，从而进一步从形态学角度证实了中药粉防己碱对于急性缺血性肾损伤的保护性作用。
肾组织DNA片段分析则发现，正常大鼠肾组织并不出现DNA梯形图，而缺血再灌注后肾组织出现了特征性的DNA梯形格局；同时，肾组织HE染色切片中观察到的受损肾小管上皮细胞形态学变化则与细胞凋亡的早期形态学特征[6]相一致，因而提示，细胞凋亡作为组织细胞受损的一个反应指标，与急性缺血性肾损伤的发生机制有关，且是缺血性肾损伤时细胞死亡的一个主要死亡方式之一。
进一步采用TUNEL标记法定量分析肾小管的细胞凋亡水平，结果表明正常大鼠肾组织切片中凋亡细胞较少，缺血再灌注12～72h各时相凋亡细胞均显著增多(P值均<0.001)，而用药组肾小管上皮细胞凋亡水平却明显低于未用药组(P值均<0.005)，因而提示粉防己碱在急性缺血性肾损伤过程中可通过降低过多的肾小管上皮细胞凋亡，达到减轻肾小管上皮细胞损伤、促进肾组织修复的作用。
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有关粉防己碱减少肾小管细胞凋亡的作用机理，目前尚不明确。其发生机制可能是：1)该药具有增加细胞微粒体内Na+，K+-ATPase活性的作用[7]，能够减少急性缺血性肾损伤状态下肾小管上皮细胞内ATP水平的下降程度而使凋亡水平减轻[8]；2)该药能够抑制Na+-Ca
交换，阻滞钙离子向细胞内发生内流[9]，而钙内流则是引起细胞凋亡的一个重要因素；3)该药可以通过抑制PLA2，降低体内花生四烯酸释放的各种代谢产物，明显抑制TXA2合成，而使用TXA2则能诱导未成熟胸腺细胞，使之出现明显的细胞凋亡现象[10]。至于粉防己碱是参与了各种凋亡相关基因的调控，还是通过减轻组织损伤使过多的肾组织细胞凋亡水平明显下降，则有待于做进一步的研究。, 百拇医药
图1 肾小管上皮细胞核固缩、碎裂，细胞图浆浓缩，结构消失并
分解成块状，肾小管基底底膜及轮廓尚好，周围无炎症反应。
2 未用药组，肾缺血再灌流72h时，可见部分肾小管尚未修复，且有核分裂现象(
)图3 用药组、肾缺血再灌注72h时，肾小管已基本修复正常
图4 DNA片段凝胶电泳图
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1 为marker；2、3、4 系缺血再灌流12h肾组织DNA电泳图呈梯形改变；
5、6、7 为正常肾组织DNA电泳图
图5 TUNEL标记的阳性对照片，大部分细胞核被标记成紫红色或蓝紫色，胞浆未显色
图6 TUNEL标记的阴性对照片，所有细胞核均未显色，组织背景良好。
参考文献
1 Schumer M，Colombel MC，Sawchuk IS，et al.Morphologic，biochemical，and molecular evidence of apoptosis during the reperfusion phase after brief periods of renal ischemia.Am J Pathol，1992，140：831.
, 百拇医药
2 Majno G，Joris I.Apoptosis，oncosis，and necrosis：an overview of cell death.Am J Pathol，1995，146：3.
3 Lieberthal W，Levine JS.Mechanisms of apoptosis and its potential role in renal tubular epithelial cell injury.Am J Physiol，1996，271：F477.
4 钱玲梅，王笑云.粉防己碱在急性缺血性肾损伤中的作用及与磷脂酶A2的关系.南京医科大学学报，1998，18：5.
5 Gold R，Schmied M，Giegerich G，et al.Differentiation between cellular apoptosis and necrosis by the combined use of in situ tailing and nick translation techniques.Lab Invest，1994，71：219.
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6 Gobe G，Fung LCT，Buttyan R：Hallmarks and consequences of apoptosis and necrosis in the kidney.In： Goligorsky MS，Stein JH eds.Acute renal failure(New concepts and therapeutic strategies).Part I.New York：Churchill Livingstone Press，1995.143～144
7 陈念航，王幼林，丁建花.粉防己碱增加自发性高血压大鼠心脏微粒体Na+，K+-ATPase活性.中国药理学报，1993，14：320.
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收稿：1999-03-25, 百拇医药
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