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编号:10252520
中药复方对免疫介导小鼠再生障碍性贫血红系造血祖细胞的影响*
http://www.100md.com 《中国中医基础医学杂志》 1999年第6期
     作者:梁 毅 鲁新华 陈如泉

    单位:梁 毅 鲁新华 陈如泉(湖北中医学院 武汉 430061)

    关键词:再生障碍性贫血;免疫介导;动物模型;造血祖细胞

    中国中医基础医学杂志990606 摘 要 目的 研究中药复方地甘口服液、红霖四物口服液对免疫介导再障小鼠模型骨髓红系造血祖细胞体外增殖影响。方法 选用Balb/c小鼠为实验对象,在注射DBA/2小鼠胸腺、淋巴结混合细胞后,立即接受亚致死剂量射线照射,形成免疫介导再障小鼠模型,然后分组处理。结果 地甘口服液、红霖四物口服液在有EPO存在的条件下,能促进小鼠骨髓细胞体外培养CFU-E、BFU-E集落的形成,其中100%浓度的地甘口服液效果明显优于200%地甘口服液及红霖四物口服液。结论 中药复方地甘口服液、红霖四物口服液能促进免疫介导再障小鼠模型骨髓红系祖细胞的体外细胞培殖。

, 百拇医药     中国图书分类号 R 285.5

    关于中药复方制剂治疗再生障碍性贫血,几十年来一直是个十分活跃研究领域。我们立足于中医血虚证的病机理论,结合现代医学的发病机制,采用目前先进的制模方法,研究观察了中药复方制剂——地甘口服液、红霖四物口服液对免疫介导再障小鼠模型骨髓红系造血祖细胞CFU-E和BFU-E体外增殖能力的影响,现报告如下。

    材料与方法

    1 动物

    Balb/c小鼠60只,8~12周龄,体重16g~20g,雌雄各半,由湖北省医学科学院实验动物中心提供。DBA/2小鼠,8~10周龄,雌雄不拘,由中山医科大学实验中心提供。

    2 模型动物的建立[1]

    取DBA/2小鼠,断颈处死,95%酒精浸泡消毒5分钟后,无菌取出胸腺及颈、腋下、腹腔沟等处的淋巴结,加RPMI1640培养液,除去表面血污及粘附的结缔组织;再次清洗后,用手术刀、剪刀反复剪切组织,直至成糊状,再轻轻碾碎用200目尼龙网过滤,使之成为单细胞悬液,计数后配成1×104/mL浓度,其胸腺细胞、淋巴细胞为1:2,取1滴苔盼蓝滴入玻片上鉴定细胞活性应在95%以上。Balb/c小鼠经X射线6.0Gy/3min,亚致死剂量照射后1h—4h内,立即经尾静脉输入上述细胞悬液,每只小鼠输入0.2mL。
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    3 药剂制备

    地甘口服液由大剂量炙甘草、熟地黄为主组成,由湖北中医学院附属医院制剂室制备,经水煎、过滤、浓缩,分别配制成100%(每毫升含生药1g)及200%(每毫升含生药2g)药液,分装成100mL瓶备用。红霖四物口服液由四川新斯顿制药有限责任公司提供(批准号:ZZ-3294-川卫药准字(1996)011555号)。

    4 分组及处理

    实验动物随机分成五组,每组12只小鼠,分别为:(1)正常组:灌服蒸馏水0.5ml~0.6mL/只,每天2次连续10d;(2)模型组:制模后处理同上;(3)地甘口服液Ⅰ组及(4)地甘口服液Ⅱ组,制模后分别灌服100%及200%浓度地甘口服液,每次0.5ml~0.6mL/只,每天2次,连续10d;(5)四物口服液组;制模后灌服四物口服液0.5ml~0.6mL/只,每天2次,连续10d。

, http://www.100md.com     分组处理后第11d~14d,模型组小鼠濒死时定为取材时间。

    5 主要试剂与仪器

    RPMI-1640、20%小牛血清(Gibco Co):EPO(kslin Co.Japen);CO2培养箱(CC1.Germany);超净工作台(CC1.German);医用电子直线加速器(WDVE-6/100型,广州威达);倒置显微镜(CTM-2型,Olympuo Co.)。

    6 小鼠骨髓细胞(BMC)悬液制备

    小鼠经颈椎脱臼处死,取股骨,用剪刀剪开股骨两头,露出骨髓腔,然后用消毒过的注射器、4号针头,吸取2mL培养液,反复冲洗骨髓腔收集骨髓细胞全部置离心管内,反复吹打使细胞完全分散,然后离心10min(1000rpm),去上清,再加入适量培养液充分混匀,制成悬液、计数,并经台盼蓝鉴定细胞活性在95%以上。
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    7 培养体系制备[2]

    骨髓细胞培养于甲基纤维素中,培养体系含细胞2×105/mL、小牛血清30%、二巯基乙醇10-4mol/L,红细胞生成素(EPO)浓度在培养CFU-E时为0.2u/mL培养BFU-E时为1u/mL,甲基纤维素(4000CPS)最终浓度为0.9%,RPMI1640加至培养体系为1mL;然后取上述培养体系加样于96孔培养板上,每孔0.2mL,共5个孔,于饱和湿度下37℃培养,CFU-E3d观察、BFU-E7d观察。

    8 染色及计数

    根据细胞化学原理,采用原位联苯胺染色观察,可以准确鉴定红系细胞集落。方法为:用95%乙醇配制出3%的联苯胺溶液,避光保存,再配制出7.5%的过氧化氢,过滤,4℃保存。染色时取7.5%过氧化氢0.1mL,加蒸馏水0.9ml,混匀后再取出0.1mL加入到5mL3%联苯胺中混匀。每个孔滴2~3滴染液,37℃孵育5min~10min,在倒置显微镜下计数。染色后红系细胞集落由于含有血红蛋白而呈现桔黄至深棕色。CFU-E集落计数在培养的第3d进行,每个集落为8~50个细胞组成的细胞团;同样,第7d计数的大于50个细胞的细胞团,则为一个BFU-E。
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    9 统计方法

    数据均以均数±标准差(±s)表示,分别采用t检验及F检验。

    结果

    1 地甘口服液、红霖四物口服液对免疫介导小鼠再障模型骨髓细胞体外培养CFU—E的影响(见表1)

    表1 各组小鼠骨髓CFU—E的变化 组别

    n

    CFU-E

    正常组

    12

    29.5±5.21
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    模型组

    12

    7±3.1*

    地甘Ⅰ组(100%)

    12

    18.92±4.89*△

    地甘Ⅱ组(200%)

    12

    14.58±3.12*△

    红霖四物口服液

    12

    15.25±3.55*△
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    注:* 与正常组比较有显著差异:P<0.001;△ 与模型组比较:P<0.001。

    三治疗组进行比较,存在差异,地甘Ⅰ组的效果明显优于其他两组(P<0.05)。

    2 地甘口服液、红霖四物口服液对免疫介导小鼠再障模型骨髓细胞体外培养BFU-E的影响(见表2)

    表2 各组小鼠骨髓BFU-E变化 组别

    n

    BFU-E

    正常组

    12

    7.75±1.865

    模型组
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    12

    2.25±1.545*

    地甘Ⅰ组

    12

    4.583±2.02*△

    地甘Ⅱ组

    12

    3.167±1.642*△

    红霖四物组

    12

    3.33±1.775*△
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    注:*与正常组比较存在差异:P<0.001/0.01/0.05;△与模型组比较:P<0.01/0.05。

    三治疗组之间不存在明显差异,但单从数据来看,地甘Ⅰ组显然优于其他两组。讨论

    采用免疫介导法复制小鼠再障模型[3、4],其发病机制在于,通过辐射损害小鼠的造血干细胞,使其进一步的分化、增殖受挫;并使体内产生有造血抑制效应的细胞及血浆抑制活性。由于上述双重因素的存在,骨髓造血细胞的分化与增殖功能严重抑制,其有核细胞数极度降低,同时骨髓细胞的体外培养也表现出集落形成下降。

    中医药对再生障碍性盆血治疗的研究,近年来一直在不断发展和进步,以往实验所采用的方法大多是注射化学药物(如环磷酰胺、马利兰等)或60Co照射等,而免疫介导法制作小鼠再障模型则是90年代以来才逐渐开展,该模型在8d~14d表现了全血细胞减少,体重减轻、濒死、CFU-S相度衰竭等现象,较之其他方法复制的模型有明显区别。
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    实验的结果显示,中药复方地甘口服液、红霖四物口服液均能促进免疫介导致损小鼠骨髓细胞体外培养CFU-E、BFU-E集落的形成,表明两种口服液均能使损伤的骨髓造血干细胞继续分化与增殖(在红系方面),从而恢复骨髓的造血功能。但是,用不同浓度的复方及不同组合的配方灌服受损小鼠,其骨髓培养效果存在一定差异。实验显示100%浓度的地甘口服液其骨髓细胞体外培养CFU-E、BFU-E集落的形成明显多于200%的地甘口服液及红霖四物口服液,这可能与益气养血和单纯补血药配伍不同有关。另外增加用药量反而抑制其刺激骨髓细胞的增殖效应,这些问题有待进一步探讨。

    中药复方对免疫介导损伤小鼠骨髓细胞的体外培养有一定的促进作用,体现了中医药治疗再生障碍贫血的客观可能性,为临床辨证施治、科学组方提供了有益的指导。

    *1997年湖北省科委资助课题

    作者简介:梁毅,男,36岁,1992年以来共参与设计申报并获得资助的各级科研课题共7项,其中“血虚证红细胞膜、酶的相关性研究”获省科技进步三等奖及卫生厅科技进步二等奖。先后参加国际、国家级学术交流大会4次,在国内各级杂志发表论文十余篇。
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    参考文献

    1.姚军,等.淋巴细胞与再生障碍性贫血关系的实验研究.中华血液学杂志 1991;12(5):229

    2.唐佩弦,杨天楹.造血细胞培养技术.西安:陕西科学技术出版社,1985:119~146

    3.陈俊,等.免疫介导的小鼠再生障碍性贫血骨髓CFU-S的改变及机制探讨.中华血液学杂志 1991;12(6):286

    4.潘景轩,等.免疫介导的小鼠再生障碍性贫血粒单系祖细胞的研究.中华血液学杂志 1992;13(2):78

    (收稿日期 1998—11—19 修回日期 1999—01—22), 百拇医药