速避凝对糖尿病大鼠肾脏表皮生长因子的干预作用
作者：王尧 王照明 翟卫中
单位：南京铁道医学院附属医院内分泌科(南京：210009) 王尧；病理科 王照明核医学科 翟卫中
关键词：低分子肝素；糖尿病；表皮生长因子
近年来认为糖尿病肾病
近年来认为糖尿病肾病(DN)早期实质上是多种细胞因子、生长因子和激素对高血糖的综合反应[1]。临床和实验表明：肾小球内皮细胞及基底膜上硫酸肝素糖蛋白(HSPG)成分的耗竭也是DN主要原因之一[2]。本实验通过观察低分子肝素(速避凝)治疗前后糖尿病大鼠肾功能以及肾内表皮生长因子(EGF)表达的变化，以探讨速避凝对DN肾脏保护作用的可能机制。
1 材料和方法
, http://www.100md.com 1.1 动物模型的建立和分组 雄性SD大鼠48只，体重160～180g(购自上海实验动物中心)。在2%戊巴比妥麻醉下行左肾切除术。术后2周大鼠一般情况良好。将大鼠随机分成三组：①对照组，即单侧肾切除后。②未治组，即单侧肾切除后糖尿病鼠。③治疗组，即单侧肾切除后糖尿病鼠，予速避凝治疗。
糖尿病动物模型按60 mg/kg链脲佐菌素(STZ，Sigma公司产品)腹腔注射，2天后尾静脉血糖≥16 mmol/L入选。速避凝(法国Sanofi公司提供)，按615 U AXa/kg，每日一次皮下注射，其余二组注射等容积注射用水。
1.2 实验标本采集及测定
1.2.1 于治疗1周和4周时各取每组大鼠8只，收集24h尿，放置-20℃冰箱保存待测尿白蛋白(UA)及EGF。在2%戊巴比妥麻醉下，测肾小球滤过率(GFR)。剪开胸腹壁，心脏穿刺取血，留血清测血肌酐(SCr)、甘油三酯(TG)。经胸主动脉插管，用生理盐水灌洗肾脏后，摘除右肾，取肾皮质，10%福尔马林中固定肾组织，常规石蜡包埋，切片厚4 μm，分别作PAS染色和SP免疫组织化学染色，光镜分析检测肾小球系膜细胞外基质增生情况及EGF、EGF受体(EGF-R)表达(购自福州迈新公司)。
, 百拇医药
组织学分依据：PAS染色依细胞外基质增生程度分为：0分为正常，1分为轻度增生，2分为中度增生，3分为重度增生；免疫组化SP法染色强度判断：(-)为背景染色；(+)为轻度或散在点状染色；(++)为中度或节段性染色；(+++)重度或弥漫性染色。
1.2.2 UA测定采用放免法，药盒购自中国原子能科学研究院。EGF测定采用ELISA法，由Canad Yes Biotch Laboratories Ltd.提供药盒。GFR测定采用经典菊糖法；SCr、TG检测采用全自动生化分析仪，血糖测定采用One Touch Ⅱ血糖仪(强生公司)。
1.3 统计学分析 实验数据用(
±s)表示。组间比较采用方差分析法。
, 百拇医药
2 结果
2.1 治疗1周和4周大鼠体重及血糖变化(见表1) 糖尿病鼠与对照组鼠比较明显多饮、多食、多尿，生长减慢，体重减轻，血糖升高，治疗组与未治组间差异不明显。
2.2 治疗1周和4周时GFR、UA、SCr、TG及尿EGF的变化(见表2) 未治组试验期间，GFR、UA、TG、EGF均明显高于对照组，EGF于第一周时明显升高达到高峰，后渐渐下降。
治疗组UA及EGF、TG均明显低于未治组，但均较对照组升高。GFR、SCr在治疗组较未治组有下降趋势，但统计学上无意义。
2.3 组织学表现 PAS染色显示：对照组肾小球系膜区未见明显增生，评1分。未治组肾小球系膜区系膜细胞明显增生，系膜基质明显增多，毛细血管壁增厚，管腔变窄，肾小囊嗜伊红蛋白性液体渗出，评2.5分。治疗组肾小球改变介于上述二者之间，评1.5分。免疫组化染色示：对照组肾小管上皮细胞EGF、EGF-R表达(-)～(+)；未治组为(++)～(+++)；治疗组为(+)。
, 百拇医药
表1 治疗1周及4周大鼠体重、血糖变化(±s n＝8)
组别
体 重(g)
血 糖(mmol/L)
1周
4周
1周
4周
对照组
, 百拇医药
208.67±13.24
350.67±5.16
5.96±1.12
6.19±1.19
未治组
144.17±20.44*
240.21±10.80*
25.02±1.58*
23.31±5.83*
治疗组
173.33±9.90*
, 百拇医药
238.83±25.45*
24.10±2.91*
22.58±6.03*
与对照组比*P<0.05表2 治疗1周及4周大鼠GFR、UA、SCr、TG、EGF(±s)
GFR(ml/min)
UA(mg/24h)
SCr(μmol/L)
, 百拇医药
TG(mmol/L)
EGF(ng/L)
1周
4周
1周
4周
1周
4周
1周
4周
1周
4周
对照组
, 百拇医药
2.86±0.22
3.05±0.31
2.98±1.10
4.04±1.89
60.17±4.12
64.28±4.04
0.36±0.05
0.41±0.12
7.64±2.15
7.27±2.14
未治组
5.21±0.83*
, 百拇医药
5.50±0.43*
12.79±1.09*
20.92±4.25*
81.40±8.02*
91.83±4.79*
1.53±0.26*
2.98±0.42*
31.12±9.10*
19.01±2.14*
, 百拇医药
治疗组
4.54±0.43*
4.37±0.87*
7.12±2.34*△
12.71±1.87*△
80.03±6.49*
82.11±10.34*
1.01±0.23*△
2.03±0.51*△
, 百拇医药 12.94±2.06*△
12.89±3.17*△
与对照组比*P<0.05；与未治组比△P<0.053 讨论
肾内高血糖及其诱导的肾小球血流动力学紊乱、肾小球内各种生长因子、生物活性物质在高糖状态下的过度反应，被认为在早期DN中起重要作用。临床表现为尿白蛋白的排泄增加；组织学表现为肾脏体积增大，系膜细胞增生及细胞外基质(ECM)积聚，毛细血管及肾小球基底膜(GBM)增厚[3]。实验表明ECM及GBM成分中HSPG成分的减少是引起上述病理变化的主要原因[4]。HSPG是内皮细胞及基底膜细胞合成的、构成肾小球系膜及基底膜的主要成分，对GBM完整性有重要作用，其携带的负电荷更是对滤过膜的电荷屏障有重要意义，并可抑制细胞外基质中胶原Ⅳ、纤维连接蛋白的过度增生。然而在高糖状态下HSPG合成减少、消耗加速[2]，从而使得GBM结构及完整性受损，ECM增多、积聚，GBM增厚。临床上产生微量白蛋白尿等早期DN的表现。Jensen[4]研究表明，肝素可以促进内皮细胞培养基中HSPG的合成，并对糖尿病鼠肾小球GBM的增厚有明显的抑制作用。
, 百拇医药
本实验证实单侧肾切除后的糖尿病鼠，残留肾存在着高血糖状态及更为严重的血流动力学紊乱，出现尿蛋白的排出增加及结构、形态的异常(表2)，成为早期糖尿病肾脏病变模型。早期即给上述实验大鼠速避凝治疗，不仅显著地降低了尿蛋白的排泄，降低血中TG水平，纠正了脂代谢紊乱，改善了早期肾脏的病理组织学异常，更重要的是本实验表明：它能明显抑制肾组织中EGF的表达，且上述变化并不依赖高血糖及高滤过状态的纠正。因而表明肝素对肾脏保护作用可能与抑制细胞因子(如EGF)有关。
许多实验表明，EGF升高在早期DN中起重要作用[5，6]。因此，可以认为，肝素抑制早期DN肾组织中的EGF表达，可能是其对糖尿病肾脏保护作用的机制之一[7]。
江苏省社会发展基金资助课题(97-BS-30)
参考文献
1 林善锬.重视糖尿病肾病的诊断与治疗.中华内分泌代谢杂志，1998，14(2)：65
, 百拇医药
2 Wardle EN.How does hyperglycaemia predispose to diabetic nephropathy？QJM，1996 Dec，89(12)：943
3 Allan F.Role of growth home，IGFs and IGF-binding proteins in renal complications of diabetes.Kidney Int，1997，52，(Suppl 60)：S12
4 Jensen J.pathogensis of diaketic vascular disease：evidence for the role of reduced heparan Sulfate protoglycan.Diabetologia，1997 Sep，46 (suppl 2)：S98
5 Gilbert RE，Cox，A，McNally PG et al.Increased epidermal growth factor in experimantal diabetes related kidney growth in rats.Diabetelogia，1997 Jul，40(7)：778
6 Sayed AN，Besbas N，Mundy J et al.Upregulation of epidermal growth factor and its receptor is the kidneys of rats with STZ-induced diabetes.EXP Nephrol，1996，Nov-Dec，4(6)：330
7 刘元涛，袁申元，朱良湘等.低分子肝素对糖尿病大鼠肾脏病变的影响.中华内分泌代谢杂志，1998，4(14)：257
(1999-09-13收稿，1999-10-10修回), 百拇医药
单位：南京铁道医学院附属医院内分泌科(南京：210009) 王尧；病理科 王照明核医学科 翟卫中
关键词：低分子肝素；糖尿病；表皮生长因子
近年来认为糖尿病肾病
近年来认为糖尿病肾病(DN)早期实质上是多种细胞因子、生长因子和激素对高血糖的综合反应[1]。临床和实验表明：肾小球内皮细胞及基底膜上硫酸肝素糖蛋白(HSPG)成分的耗竭也是DN主要原因之一[2]。本实验通过观察低分子肝素(速避凝)治疗前后糖尿病大鼠肾功能以及肾内表皮生长因子(EGF)表达的变化，以探讨速避凝对DN肾脏保护作用的可能机制。
1 材料和方法
, http://www.100md.com 1.1 动物模型的建立和分组 雄性SD大鼠48只，体重160～180g(购自上海实验动物中心)。在2%戊巴比妥麻醉下行左肾切除术。术后2周大鼠一般情况良好。将大鼠随机分成三组：①对照组，即单侧肾切除后。②未治组，即单侧肾切除后糖尿病鼠。③治疗组，即单侧肾切除后糖尿病鼠，予速避凝治疗。
糖尿病动物模型按60 mg/kg链脲佐菌素(STZ，Sigma公司产品)腹腔注射，2天后尾静脉血糖≥16 mmol/L入选。速避凝(法国Sanofi公司提供)，按615 U AXa/kg，每日一次皮下注射，其余二组注射等容积注射用水。
1.2 实验标本采集及测定
1.2.1 于治疗1周和4周时各取每组大鼠8只，收集24h尿，放置-20℃冰箱保存待测尿白蛋白(UA)及EGF。在2%戊巴比妥麻醉下，测肾小球滤过率(GFR)。剪开胸腹壁，心脏穿刺取血，留血清测血肌酐(SCr)、甘油三酯(TG)。经胸主动脉插管，用生理盐水灌洗肾脏后，摘除右肾，取肾皮质，10%福尔马林中固定肾组织，常规石蜡包埋，切片厚4 μm，分别作PAS染色和SP免疫组织化学染色，光镜分析检测肾小球系膜细胞外基质增生情况及EGF、EGF受体(EGF-R)表达(购自福州迈新公司)。
, 百拇医药
组织学分依据：PAS染色依细胞外基质增生程度分为：0分为正常，1分为轻度增生，2分为中度增生，3分为重度增生；免疫组化SP法染色强度判断：(-)为背景染色；(+)为轻度或散在点状染色；(++)为中度或节段性染色；(+++)重度或弥漫性染色。
1.2.2 UA测定采用放免法，药盒购自中国原子能科学研究院。EGF测定采用ELISA法，由Canad Yes Biotch Laboratories Ltd.提供药盒。GFR测定采用经典菊糖法；SCr、TG检测采用全自动生化分析仪，血糖测定采用One Touch Ⅱ血糖仪(强生公司)。
1.3 统计学分析 实验数据用(
±s)表示。组间比较采用方差分析法。, 百拇医药
2 结果
2.1 治疗1周和4周大鼠体重及血糖变化(见表1) 糖尿病鼠与对照组鼠比较明显多饮、多食、多尿，生长减慢，体重减轻，血糖升高，治疗组与未治组间差异不明显。
2.2 治疗1周和4周时GFR、UA、SCr、TG及尿EGF的变化(见表2) 未治组试验期间，GFR、UA、TG、EGF均明显高于对照组，EGF于第一周时明显升高达到高峰，后渐渐下降。
治疗组UA及EGF、TG均明显低于未治组，但均较对照组升高。GFR、SCr在治疗组较未治组有下降趋势，但统计学上无意义。
2.3 组织学表现 PAS染色显示：对照组肾小球系膜区未见明显增生，评1分。未治组肾小球系膜区系膜细胞明显增生，系膜基质明显增多，毛细血管壁增厚，管腔变窄，肾小囊嗜伊红蛋白性液体渗出，评2.5分。治疗组肾小球改变介于上述二者之间，评1.5分。免疫组化染色示：对照组肾小管上皮细胞EGF、EGF-R表达(-)～(+)；未治组为(++)～(+++)；治疗组为(+)。
, 百拇医药
表1 治疗1周及4周大鼠体重、血糖变化(
±s n＝8)组别
体 重(g)
血 糖(mmol/L)
1周
4周
1周
4周
对照组
, 百拇医药
208.67±13.24
350.67±5.16
5.96±1.12
6.19±1.19
未治组
144.17±20.44*
240.21±10.80*
25.02±1.58*
23.31±5.83*
治疗组
173.33±9.90*
, 百拇医药
238.83±25.45*
24.10±2.91*
22.58±6.03*
与对照组比*P<0.05表2 治疗1周及4周大鼠GFR、UA、SCr、TG、EGF(
±s)GFR(ml/min)
UA(mg/24h)
SCr(μmol/L)
, 百拇医药
TG(mmol/L)
EGF(ng/L)
1周
4周
1周
4周
1周
4周
1周
4周
1周
4周
对照组
, 百拇医药
2.86±0.22
3.05±0.31
2.98±1.10
4.04±1.89
60.17±4.12
64.28±4.04
0.36±0.05
0.41±0.12
7.64±2.15
7.27±2.14
未治组
5.21±0.83*
, 百拇医药
5.50±0.43*
12.79±1.09*
20.92±4.25*
81.40±8.02*
91.83±4.79*
1.53±0.26*
2.98±0.42*
31.12±9.10*
19.01±2.14*
, 百拇医药
治疗组
4.54±0.43*
4.37±0.87*
7.12±2.34*△
12.71±1.87*△
80.03±6.49*
82.11±10.34*
1.01±0.23*△
2.03±0.51*△
, 百拇医药 12.94±2.06*△
12.89±3.17*△
与对照组比*P<0.05；与未治组比△P<0.053 讨论
肾内高血糖及其诱导的肾小球血流动力学紊乱、肾小球内各种生长因子、生物活性物质在高糖状态下的过度反应，被认为在早期DN中起重要作用。临床表现为尿白蛋白的排泄增加；组织学表现为肾脏体积增大，系膜细胞增生及细胞外基质(ECM)积聚，毛细血管及肾小球基底膜(GBM)增厚[3]。实验表明ECM及GBM成分中HSPG成分的减少是引起上述病理变化的主要原因[4]。HSPG是内皮细胞及基底膜细胞合成的、构成肾小球系膜及基底膜的主要成分，对GBM完整性有重要作用，其携带的负电荷更是对滤过膜的电荷屏障有重要意义，并可抑制细胞外基质中胶原Ⅳ、纤维连接蛋白的过度增生。然而在高糖状态下HSPG合成减少、消耗加速[2]，从而使得GBM结构及完整性受损，ECM增多、积聚，GBM增厚。临床上产生微量白蛋白尿等早期DN的表现。Jensen[4]研究表明，肝素可以促进内皮细胞培养基中HSPG的合成，并对糖尿病鼠肾小球GBM的增厚有明显的抑制作用。
, 百拇医药
本实验证实单侧肾切除后的糖尿病鼠，残留肾存在着高血糖状态及更为严重的血流动力学紊乱，出现尿蛋白的排出增加及结构、形态的异常(表2)，成为早期糖尿病肾脏病变模型。早期即给上述实验大鼠速避凝治疗，不仅显著地降低了尿蛋白的排泄，降低血中TG水平，纠正了脂代谢紊乱，改善了早期肾脏的病理组织学异常，更重要的是本实验表明：它能明显抑制肾组织中EGF的表达，且上述变化并不依赖高血糖及高滤过状态的纠正。因而表明肝素对肾脏保护作用可能与抑制细胞因子(如EGF)有关。
许多实验表明，EGF升高在早期DN中起重要作用[5，6]。因此，可以认为，肝素抑制早期DN肾组织中的EGF表达，可能是其对糖尿病肾脏保护作用的机制之一[7]。
江苏省社会发展基金资助课题(97-BS-30)
参考文献
1 林善锬.重视糖尿病肾病的诊断与治疗.中华内分泌代谢杂志，1998，14(2)：65
, 百拇医药
2 Wardle EN.How does hyperglycaemia predispose to diabetic nephropathy？QJM，1996 Dec，89(12)：943
3 Allan F.Role of growth home，IGFs and IGF-binding proteins in renal complications of diabetes.Kidney Int，1997，52，(Suppl 60)：S12
4 Jensen J.pathogensis of diaketic vascular disease：evidence for the role of reduced heparan Sulfate protoglycan.Diabetologia，1997 Sep，46 (suppl 2)：S98
5 Gilbert RE，Cox，A，McNally PG et al.Increased epidermal growth factor in experimantal diabetes related kidney growth in rats.Diabetelogia，1997 Jul，40(7)：778
6 Sayed AN，Besbas N，Mundy J et al.Upregulation of epidermal growth factor and its receptor is the kidneys of rats with STZ-induced diabetes.EXP Nephrol，1996，Nov-Dec，4(6)：330
7 刘元涛，袁申元，朱良湘等.低分子肝素对糖尿病大鼠肾脏病变的影响.中华内分泌代谢杂志，1998，4(14)：257
(1999-09-13收稿，1999-10-10修回), 百拇医药