狼疮性肾炎患者雌激素受体基因多态性的分布及意义
作者：刘浩 刘志红 刘栋 陈朝红 黎磊石
单位：
关键词：雌激素受体；基因多态性；狼疮性肾炎
摘 要 目的摘 要 目的：了解雌激素受体(estrogen receptor，ER)基因多态性在女性狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)患者中的分布以及不同基因型携带者的临床病理特征。 方法：通过PCR-限制性酶切方法对187例女性LN患者及71名正常女性ER基因型进行检测，并将两组人群中ER基因多态性的分布进行了比较，同时还对3种主要的ER基因型携带者的临床和肾脏病理特征进行了比较。 结果：ER基因多态性在女性LN患者中的分布与其在正常人群中的分布差异不显著，但不同基因型的女性LN患者的临床病理特征差异显著：ppxx型患者中高血压和血液系统受损的发生率均显著高于PpXx型患者，并且肾小球袢内血栓形成、肾小球硬化、新月体形成等肾脏病理改变也最为严重，而Ppxx型患者的肾间质血管炎、间质纤维化在3种基因型携带者中最为严重。 结论：ER基因多态性作为特定的基因背景与LN临床病理表现多样性密切相关。
, 百拇医药
ESTROGEN RECEPTOR GENE POLYMORPHISM AND THE CLINICAL PATHOLOGICAL FEATURE IN FEMALE LUPUS NEPHRITIS
Liu Hao，Liu Zhihong，Liu Dong，Cheng Zhaohong，Li Leishi
Research Institute of Nephrology，Jinling Hospital，School of Medicine，Nanjing University，Nanjing，210002
OBJECTIVE Lupus nephritis (LN) is a clinically heterogeneous autoimmune disease.One of the most striking characteristics is its high prevalence among childbearing women，as well as its clinical manifestation difference between men and women，suggesting a role of the sex hormones in its pathogenesis.Previous studies have suggested that estrogen receptor(ER) gene ploymorphism might influence the expression or function of estrogen receptor，resulting in different responses to estrogen，so we here investigated the association between estrogen receptor gene polymorphism and LN in female.
, 百拇医药
METHODOLOGY The Pvell and Xbal restriction fragment length polymorphism (RFLP) of estrogen receptor gene were analyzed in 187 biopsy proven female LN patients and 71 female normal controls by PCR-RFLP.The RFPL results were reprsented as Pp(PveⅡ)and Xx(Xbal)，with capital or small letters representing the absence or the presence of restriction sites respectively.Then the clinical and pathological features of 152 female LN patients with one of the three major genotypes(PpXx，Ppxx，and ppxx)were analyzed respectively.
, 百拇医药
RESULTS It was found that PpXx and ppxx，Ppxx were the three major genotypes of ER gene in both lupus patients group and control group.No statistic difference could be found in the distribution between female LN patients and gender matched controls.Interestingly，various clinical and renal pathological features were found to be associated with different genotypes of ER gene in female patients.Skin rashes and arthritis were found more common in patients with PpXx genotype.The frequencies of hematological abnormalities and hypertension were higher in patients with ppxx genotype(P<0.05)，while capillary thrombi and glomerular sclerosis were more frequently found in patients with ppxx genotype (P<0.05)。On the other hand，the frequencies of renal vasculitic changes and interstitial injuries were higher in patients with Ppxx genotype (P<0.01).
, http://www.100md.com
CONCLUSION Female LN patients with ppxx genotype tend to have severe hypertension and hematological abnormalities，and to be more frequently complicated with severe renal glomerular injuries，while those with Ppxx genotype are more frequently complicated with extensive renal interstitial injury.ER gene polymorphism is probably one of the genetic factors contributing to the clinical heterogeneity and sexually dimorphic manifestation of LN.
Key words estrogen receptor gene polymorphism lupus nephritis
, 百拇医药
狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)是一种临床表现多样化的自身免疫性疾病，主要累及育龄期妇女，其临床病理特征及预后均具有显著的个体及性别差异性[1～5]，男女性别间不仅发病率相差悬殊，而且男女患者间在免疫学检查，肾外并发症的发生等临床特征以及肾脏病理表现方面均具有显著的差异[6～8]。虽然LN的发病机制尚未完全阐明，但不同性别中LN的发生发展所表现出的显著差异性提示雌激素等性激素与LN的发生发展密切相关[9～11]。
由于雌激素在体内的生物学效应需要通过雌激素受体(estrogen receptor，ER)介导，因此雌激素及其受体在人群中的表达和功能差异势必影响到雌激素的生物学效应[12]。分子遗传学研究表明，人类ER基因位于第6号染色体上，总共包括8个外显子和7个内含子，其基因内部第1内含子中具有2处较为常见的多态性位点[3]。近来一系列研究表明，此处多态性位点导致的不同基因型有可能导致不同个体间ER基因的转录和表达水平有所差别[14～16]，进而影响体内雌激素的生物学效应。有鉴于此，我们选择ER基因作为标记基因，分析ER基因多态性与LN的发生及临床病理特征间的联系。
, 百拇医药
本研究用PCR—限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)法对187例女性LN患者和71例正常女性中ER基因多态性的分布特点进行了观察和比较，在此基础上进一步比较了女性LN患者中3种常见ER基因型携带者的临床及病理特征，并对ER基因多态性与LN患者临床病理特征间的联系进行了探讨。
1 对象和方法
1.1 观察对象 LN患者组：随机选择1992年9月至1998年9月间在解放军肾脏病研究所住院的187例女性LN患者，均符合1982年美国风湿病学会(ARA)修订的系统性红斑狼疮(SLE)诊断标准[17]，并有肾脏受累的临床和实验室证据，经肾活检确诊为LN。平均年龄26(9～58)岁。按WHO病理分型包括Ⅱ型51人，Ⅳ型101人，Ⅴ型35人。正常对照组：71名女性汉族健康献血员，均符合卫生部制定的“供血者健康检查标准”，年龄18～55岁。
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1.2 DNA的提取 取新鲜全血(柠檬酸抗凝)2ml，用Triton X-100同时破碎红细胞和白细胞，直接得到白细胞核，然后用NaClO4，SDS解聚核蛋白，最后用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，乙醇沉淀提取基因组DNA[18]。
1.3 ER基因多态性分析 样本基因组DNA首先通过PCR扩增，PCR引物由中国科学院上海细胞生物学研究所合成，序列为5′-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3′，及5′-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3′。PCR反应条件为94℃30s，61℃40s，72℃90s，共35个循环(Perkin-EImer Cetus DNA扩增仪)，PCR扩增产物大小为1.3Kb，包括ER基因1号内含子及部分2号外显子，分别取15μl被限制性内切酶PvuⅡ和XbaI于37℃ 酶切2h，酶切产物经1.5%琼脂糖溴乙锭电泳分离，紫外灯下判断结果，并以Xx，Pp表示酶切结果，大写字母表示限制性位点的消失，小写字母表示存在该酶切位点[19]。
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1.4 临床和实验室资料 本文中临床资料主要包括患者起病年龄及多种肾外并发症的出现。文中涉及的肾外表现具体定义如下：①皮肤病变：包括盘状红斑、蝶型红斑，光敏感，皮肤溃疡及雷诺现象；②关节病变：包括关节红肿，疼痛；③血液系统病变：观察血色素、血小板、白细胞计数；④浆膜腔病变：指心包积液、胸腔积液或腹水，排除感染及漏出性积液；⑤高血压：以两次以上重复测得的血压值，收缩压≥19.3kPa(145mmHg)或(和)舒张压≥12.7kPa(95mmHg)作为高血压标准。肾组织病理检查：常规光镜及免疫病理检查均由两名医师独立进行，重点观察肾小球毛细血管袢坏死，毛细血管内血栓形成，肾小球新月体形成及肾小球硬化，间质血管纤维素样坏死及血管炎细胞浸润，同时将间质纤维化分为轻度，中度和重度。所有临床及病理资料均以患者在我院进行的检查为准。
1.5 统计学处理 计算出LN患者与正常人群中ER基因各基因型的频率和等位基因频率，再经Hardy-weinberg遗传平衡定律检验，表明各基因型频率已达遗传平衡，具有群体代表性。各组间均数比较采用t检验，率的比较采用多样本未配对资料的R×C表进行χ2检验，以P<0.05为差异显著。
2 结果
2.1 ER基因多态性在正常人群和LN患者中的分布 ER各基因型在正常女性和女性LN患者中均以ppxx型最为常见，其次为PpXx型及Ppxx型。此外女性LN患者中未发现ppXx型，而ppXX型及PpXX型在本研究人群中均未发现。女性患者中ER基因多态性的分布与其在正常女性中的分布较为接近，虽然各基因型的出现频率有所差别，但无统计学意义(表1)。
表1 ER基因多态性在正常女性与女性LN患者中的分布, 百拇医药
单位：
关键词：雌激素受体；基因多态性；狼疮性肾炎
摘 要 目的摘 要 目的：了解雌激素受体(estrogen receptor，ER)基因多态性在女性狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)患者中的分布以及不同基因型携带者的临床病理特征。 方法：通过PCR-限制性酶切方法对187例女性LN患者及71名正常女性ER基因型进行检测，并将两组人群中ER基因多态性的分布进行了比较，同时还对3种主要的ER基因型携带者的临床和肾脏病理特征进行了比较。 结果：ER基因多态性在女性LN患者中的分布与其在正常人群中的分布差异不显著，但不同基因型的女性LN患者的临床病理特征差异显著：ppxx型患者中高血压和血液系统受损的发生率均显著高于PpXx型患者，并且肾小球袢内血栓形成、肾小球硬化、新月体形成等肾脏病理改变也最为严重，而Ppxx型患者的肾间质血管炎、间质纤维化在3种基因型携带者中最为严重。 结论：ER基因多态性作为特定的基因背景与LN临床病理表现多样性密切相关。
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ESTROGEN RECEPTOR GENE POLYMORPHISM AND THE CLINICAL PATHOLOGICAL FEATURE IN FEMALE LUPUS NEPHRITIS
Liu Hao，Liu Zhihong，Liu Dong，Cheng Zhaohong，Li Leishi
Research Institute of Nephrology，Jinling Hospital，School of Medicine，Nanjing University，Nanjing，210002
OBJECTIVE Lupus nephritis (LN) is a clinically heterogeneous autoimmune disease.One of the most striking characteristics is its high prevalence among childbearing women，as well as its clinical manifestation difference between men and women，suggesting a role of the sex hormones in its pathogenesis.Previous studies have suggested that estrogen receptor(ER) gene ploymorphism might influence the expression or function of estrogen receptor，resulting in different responses to estrogen，so we here investigated the association between estrogen receptor gene polymorphism and LN in female.
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METHODOLOGY The Pvell and Xbal restriction fragment length polymorphism (RFLP) of estrogen receptor gene were analyzed in 187 biopsy proven female LN patients and 71 female normal controls by PCR-RFLP.The RFPL results were reprsented as Pp(PveⅡ)and Xx(Xbal)，with capital or small letters representing the absence or the presence of restriction sites respectively.Then the clinical and pathological features of 152 female LN patients with one of the three major genotypes(PpXx，Ppxx，and ppxx)were analyzed respectively.
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RESULTS It was found that PpXx and ppxx，Ppxx were the three major genotypes of ER gene in both lupus patients group and control group.No statistic difference could be found in the distribution between female LN patients and gender matched controls.Interestingly，various clinical and renal pathological features were found to be associated with different genotypes of ER gene in female patients.Skin rashes and arthritis were found more common in patients with PpXx genotype.The frequencies of hematological abnormalities and hypertension were higher in patients with ppxx genotype(P<0.05)，while capillary thrombi and glomerular sclerosis were more frequently found in patients with ppxx genotype (P<0.05)。On the other hand，the frequencies of renal vasculitic changes and interstitial injuries were higher in patients with Ppxx genotype (P<0.01).
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CONCLUSION Female LN patients with ppxx genotype tend to have severe hypertension and hematological abnormalities，and to be more frequently complicated with severe renal glomerular injuries，while those with Ppxx genotype are more frequently complicated with extensive renal interstitial injury.ER gene polymorphism is probably one of the genetic factors contributing to the clinical heterogeneity and sexually dimorphic manifestation of LN.
Key words estrogen receptor gene polymorphism lupus nephritis
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狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)是一种临床表现多样化的自身免疫性疾病，主要累及育龄期妇女，其临床病理特征及预后均具有显著的个体及性别差异性[1～5]，男女性别间不仅发病率相差悬殊，而且男女患者间在免疫学检查，肾外并发症的发生等临床特征以及肾脏病理表现方面均具有显著的差异[6～8]。虽然LN的发病机制尚未完全阐明，但不同性别中LN的发生发展所表现出的显著差异性提示雌激素等性激素与LN的发生发展密切相关[9～11]。
由于雌激素在体内的生物学效应需要通过雌激素受体(estrogen receptor，ER)介导，因此雌激素及其受体在人群中的表达和功能差异势必影响到雌激素的生物学效应[12]。分子遗传学研究表明，人类ER基因位于第6号染色体上，总共包括8个外显子和7个内含子，其基因内部第1内含子中具有2处较为常见的多态性位点[3]。近来一系列研究表明，此处多态性位点导致的不同基因型有可能导致不同个体间ER基因的转录和表达水平有所差别[14～16]，进而影响体内雌激素的生物学效应。有鉴于此，我们选择ER基因作为标记基因，分析ER基因多态性与LN的发生及临床病理特征间的联系。
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本研究用PCR—限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)法对187例女性LN患者和71例正常女性中ER基因多态性的分布特点进行了观察和比较，在此基础上进一步比较了女性LN患者中3种常见ER基因型携带者的临床及病理特征，并对ER基因多态性与LN患者临床病理特征间的联系进行了探讨。
1 对象和方法
1.1 观察对象 LN患者组：随机选择1992年9月至1998年9月间在解放军肾脏病研究所住院的187例女性LN患者，均符合1982年美国风湿病学会(ARA)修订的系统性红斑狼疮(SLE)诊断标准[17]，并有肾脏受累的临床和实验室证据，经肾活检确诊为LN。平均年龄26(9～58)岁。按WHO病理分型包括Ⅱ型51人，Ⅳ型101人，Ⅴ型35人。正常对照组：71名女性汉族健康献血员，均符合卫生部制定的“供血者健康检查标准”，年龄18～55岁。
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1.2 DNA的提取 取新鲜全血(柠檬酸抗凝)2ml，用Triton X-100同时破碎红细胞和白细胞，直接得到白细胞核，然后用NaClO4，SDS解聚核蛋白，最后用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，乙醇沉淀提取基因组DNA[18]。
1.3 ER基因多态性分析 样本基因组DNA首先通过PCR扩增，PCR引物由中国科学院上海细胞生物学研究所合成，序列为5′-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3′，及5′-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3′。PCR反应条件为94℃30s，61℃40s，72℃90s，共35个循环(Perkin-EImer Cetus DNA扩增仪)，PCR扩增产物大小为1.3Kb，包括ER基因1号内含子及部分2号外显子，分别取15μl被限制性内切酶PvuⅡ和XbaI于37℃ 酶切2h，酶切产物经1.5%琼脂糖溴乙锭电泳分离，紫外灯下判断结果，并以Xx，Pp表示酶切结果，大写字母表示限制性位点的消失，小写字母表示存在该酶切位点[19]。
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1.4 临床和实验室资料 本文中临床资料主要包括患者起病年龄及多种肾外并发症的出现。文中涉及的肾外表现具体定义如下：①皮肤病变：包括盘状红斑、蝶型红斑，光敏感，皮肤溃疡及雷诺现象；②关节病变：包括关节红肿，疼痛；③血液系统病变：观察血色素、血小板、白细胞计数；④浆膜腔病变：指心包积液、胸腔积液或腹水，排除感染及漏出性积液；⑤高血压：以两次以上重复测得的血压值，收缩压≥19.3kPa(145mmHg)或(和)舒张压≥12.7kPa(95mmHg)作为高血压标准。肾组织病理检查：常规光镜及免疫病理检查均由两名医师独立进行，重点观察肾小球毛细血管袢坏死，毛细血管内血栓形成，肾小球新月体形成及肾小球硬化，间质血管纤维素样坏死及血管炎细胞浸润，同时将间质纤维化分为轻度，中度和重度。所有临床及病理资料均以患者在我院进行的检查为准。
1.5 统计学处理 计算出LN患者与正常人群中ER基因各基因型的频率和等位基因频率，再经Hardy-weinberg遗传平衡定律检验，表明各基因型频率已达遗传平衡，具有群体代表性。各组间均数比较采用t检验，率的比较采用多样本未配对资料的R×C表进行χ2检验，以P<0.05为差异显著。
2 结果
2.1 ER基因多态性在正常人群和LN患者中的分布 ER各基因型在正常女性和女性LN患者中均以ppxx型最为常见，其次为PpXx型及Ppxx型。此外女性LN患者中未发现ppXx型，而ppXX型及PpXX型在本研究人群中均未发现。女性患者中ER基因多态性的分布与其在正常女性中的分布较为接近，虽然各基因型的出现频率有所差别，但无统计学意义(表1)。
表1 ER基因多态性在正常女性与女性LN患者中的分布, 百拇医药