PCR技术在儿科结核病诊断中存在的问题
作者：杨镒宇 李建英
单位：杨镒宇 广州市儿童医院(510120)；李建英 中山医科大学附属第三医院
关键词：结核，肺；聚合酶链反应；DNA，细菌；分枝杆菌，结核
实用医学杂志990709 摘 要 目的：观察多聚酶链反应(PCR)技术在结核病临床诊断上的应用以及存在的问题。方法：22例结核病符合临床诊断标准，50例对照组，应用PCR技术，经凝胶电泳法检测结果。结果：血样本TB-DNA-PCR的阳性率为结核组18.18%，对照组36.00%，敏感度18.18%，特异性64.00%，假阳性36.00%，假阴性81.82%。18例结核病未经抗结核治疗予复查，仅8例阳性，占44.44%。结论：应用定性PCR技术检测结核血标本的敏感度低，其较高的假阳性和假阴性结果应引起注意。PCR技术在结核病诊断上的应用尚要解决取样、操作技术、判断结果的标准化和量化问题。在诊断结核病时不能脱离流行病学，临床表现，影像学，病原学和血清学。
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选择1997年广州市儿童医院72例可疑患儿，采用多聚酶链反应(PCR)技术检测标本中的结核菌，结果与临床不符，现对其存在问题进行探讨。
1 对象与方法
1.1 对象 本组72例，男42例，女30例，年龄6月～12岁。
1.2 临床表现 发热60例(83.37%)，咳嗽51例(70.83%)，厌食20例，盗汗3例，消瘦2例。临床诊断：支气管肺炎25例，支气管炎14例，脓胸1例，结核性脑膜炎(含结核性脑膜脑炎)12例，肺结核10例，病毒性脑炎10例。50例非结核患儿仅2例有结核接触史，除1例外全部接种卡介苗(BCG)。结核病组22例中10例结核接触史明确，接种BCG 14例，另8例未接种。结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)试验结果：非结核组仅2例呈弱阳性；结核组有8例弱阳性，4例阳性到强阳性。
1.3 检查方法 用美国PE公司新一代PCR(9600)扩增仪。用干净试管采集血和/或脑脊液(CSF)标本，行TB-DNA-PCR检查，标本经扩增仪扩增后，经凝胶电泳法检测结果。用干净试管采集血清和/或CSF，用金标法，行分枝杆菌IgG检查。结核菌素实验：取PPD 5 Iu作皮内注射。结果判断以注射后48～72小时(以72小时为准)观察结果。阴性：局部无反应或仅有发红而无硬结；可疑阳性(±)：红肿及硬结最大横径小于0.5 cm；弱阳性(+)：红肿及硬结最大横径小于0.5～0.9 cm；阳性(++)：红肿及硬结最大横径1～1.9 cm；强阳性(+++)：红肿及硬结最大横径在2.0 cm以上；极强阳性(++++)：除红肿及硬结外，局部发生坏死或起疱，或伴有发热全身症状[1]。
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2 结果
72例均为发热或咳嗽1周以上患儿行血清和/或CSF的TB-DNA-PCR检查。血清的TB-DNA-PCR检测结果，见表1。结果表明，敏感度18.18%，特异度64.00%。其中22例有一项或两项阳性，占30.56%；只有4例最后符合结核的临床诊断，只占18.18%。非肺结核组18例血和/或CSF的TB-DNA-PCR阳性复查仅8例阳性。12份结核组CSF的检测结果全部阴性，16份非结核组CSF的有2份阳性。
表1 血标本TB-DNA-PCR检测结果 组 别
例数
TB-PCR
阳性例数
阴性例数
, http://www.100md.com 阳性率(%)
结核组
22
4
18
18.18
非结核组
50
18
32
36.00
u=1.818，P>0.05
2.2 72例行血的分枝杆菌IgG检查和1例行CSF的分枝杆菌IgG检查均为阴性。
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2.3 72例X线胸部平片，正常22例，支气管肺炎25例，支气管炎14例，肺结核10例，脓胸1例。
2.4 22例临床诊断结核病符合结核病的诊断标准。
3 讨论
结核病为经呼吸道传染病，因小儿非特异以及特异性免疫低下，接触病原体后发病以及隐性感染机会均较成年人高。本资料结核组大部分有明确接触史，72例中有8例未接种BCG而发病，所以，结核病接触史和BCG接种史对于结核病诊断是重要的病史和依据。而14例已经接种BCG的小儿患病，可能是注射疫苗方法不当，疫苗效价不稳定，不能产生足够的早期细胞因子以抵抗入侵的结核菌，使之建立的主动免疫不足[2]。非结核组仅有2例PPD弱阳性，进一步说明小儿普遍存在细胞免疫低下。但是PPD阳性仅见于结核组，故有诊断意义。只有定期复种BCG，并严格掌握标准的疫苗注射法，控制疫苗效价，才能达到免疫预防的目的。
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IgG在急性感染期出现，分枝杆菌IgG阳性为结核活动的标志，特异性高[3，4]。可是，在小儿结核的阳性率仍不高，是否与小儿体液免疫低下，抗体滴度过低而呈阴性有关，有待进一步证实。
PCR是近10年发展起来的临床检查技术，是通过对被检微生物DNA/RNA的扩增，使之呈几何级数增加，再通过免疫电泳以相应检测结果，其高敏感性和特异性已被公认[5]。本组资料结核组TB-DNA-PCR阳性率低，非结核组出现较高TB-DNA-PCR的阳性率，敏感性和特异性均不高，同Cegielski等[6]报道的结果相一致。但是，与实际患病不相符，造成假阳性的原因要作多方面考虑。结核组的阳性率不但不高，反而较非结核组为低，但无显著性差异。PCR扩增的对象是DNA/RNA，例如理论上只要被检样本中存在相应DNA/RNA，扩增成功便呈阳性。样本中带DNA/RNA的途径有来自活体微生物，来自死亡微生物的残留细胞器，或者取样过程中的污染。本组资料原TB-DNA-PCR阳性的病例未经抗结核治疗而复查的阳性率低于一半，提示检测系统重复性低或样本中存在一过性TB-DNA，来自血样本的称为一过性DNA血症。其阳性率偏高，可能与小儿群体普遍隐性结核接触史有关，但是由于免疫低下分枝杆菌IgG并无阳性反映，PPD试验也只有少数显示阳性。因此，TB-DNA血症远多于TB菌血症。因为前者除部分反映真性菌血症和样本污染，暨活TB菌外，不排除非活菌残留DNA，多数不发病，是高假阳性和低敏感性的主要原因；而TB菌血症是发病的直接证据。
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由此推知，新技术应用不当亦会造成临床误诊。临床上，结核病的诊断还是以发热、咳嗽、盗汗、厌食、消瘦，结核接触史，接种史，PPD试验，X线照片为依据。本组资料提示：CSF细胞及生化常规检查，静置菌膜查抗酸杆菌仍然对结核性脑膜炎有特异性。对可疑病例常规抗感染不凑效，给以试验性抗结核治疗可以助诊。
在应用PCR等新技术的时候，最好取样本时严格无菌操作，统一取样方法，尽量减少假阳性。尽管这样，因为目前广泛应用的是定性PCR技术，其试剂性能和结果检测的方法各异，样本TB-DNA-PCR检查的特异性会掺差不齐，假阳性率仍然会偏高，因此，该检查尚未法定成为结核病的诊断依据[7]。最近2年，国外已经发展成定量PCR技术，对特异性病原体DNA/RNA进行定量研究，确定样本的启始量，可鉴别基因相似的病原体，以便更特异地诊断病原，判断病人的感染程度以及临床疗效评价[8]，将会成为更特异的临床检测手段。PCR扩增技术与DNA探针相结合可以降低假阴性和假阳性率[9，10]，或者PCR技术与Southern杂交技术相结合，可以进一步提高检测的敏感性和特异性[11]。
, 百拇医药
4 参考文献
1 何广学，张力兴，屠德华，等. 测量皮内结核素试验反应两种方法的对比研究. 中国防痨，1997，19(3)：133～136.
2 Sugisaki K,Danrenbery AM,Jr Abe Y,et al. Nonspecific and immune-specific up-regulation of cytokinase in rabbit dermal tuberculosis(BCG) lesions. J Leukoc Biol,1998,63(4):440～450.
3 谭淑珍，张 鹏，刘敬忠，等. 检测血清中LAM-IgG对结核诊断的分析与探讨. 中国防痨，1997，19(3)：136.
4 熊礼宽，林振南，黄俊新，等. 血清38 KD-IgG抗体和分枝干菌IgG抗体检测对肺结核价值的探讨. 深圳医学，1996，9(5)：7～8.
, 百拇医药
5 赵新劳，欧阳杰，张成军，等. 聚合酶链反应在结核诊断上的应用. 中华结核和呼吸杂志，1995，18(4)：198.
6 Cegielski JP,Deilin BH,Morris AJ,et al. Comparison of PCR,culture,and histopathology for diagnosis of tuberculosis pericarditis. J Clin Microbiol,1997,35(12):3254.
7 潘毓萱. PCR技术在结核病临床诊断中的应用及存在问题. 中华结核和呼吸杂志，1995，18(4)：197～198.
8 Afghani B. Rapid differentiation of mycobcterium tuberculosis and mycobacterium bovis using glycerol susceptibility and quantitative polymerase chain reaction. J Investing Med,1998,46(2):73～75.
, 百拇医药
9 李小英，张 捷，寇丽筠，等. 聚合酶链反应与DNA探针检测临床标本中结核分枝杆菌的评价. 中国防痨，1997，19(1)：33～35.
10 Unghes MS,Beck LA，Skuce RA,et al. Development of mycobacterial species-specific DNA probes by subtraction hybridization. FEMS Microbiol Letl,1997,156(1)31～36.
11 张少静，翟振国，田清武，等. 不同检测手段对结核病诊断价值的比较. 康复与疗养杂志，1996，11(4)：156～158.?, 百拇医药
单位：杨镒宇 广州市儿童医院(510120)；李建英 中山医科大学附属第三医院
关键词：结核，肺；聚合酶链反应；DNA，细菌；分枝杆菌，结核
实用医学杂志990709 摘 要 目的：观察多聚酶链反应(PCR)技术在结核病临床诊断上的应用以及存在的问题。方法：22例结核病符合临床诊断标准，50例对照组，应用PCR技术，经凝胶电泳法检测结果。结果：血样本TB-DNA-PCR的阳性率为结核组18.18%，对照组36.00%，敏感度18.18%，特异性64.00%，假阳性36.00%，假阴性81.82%。18例结核病未经抗结核治疗予复查，仅8例阳性，占44.44%。结论：应用定性PCR技术检测结核血标本的敏感度低，其较高的假阳性和假阴性结果应引起注意。PCR技术在结核病诊断上的应用尚要解决取样、操作技术、判断结果的标准化和量化问题。在诊断结核病时不能脱离流行病学，临床表现，影像学，病原学和血清学。
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选择1997年广州市儿童医院72例可疑患儿，采用多聚酶链反应(PCR)技术检测标本中的结核菌，结果与临床不符，现对其存在问题进行探讨。
1 对象与方法
1.1 对象 本组72例，男42例，女30例，年龄6月～12岁。
1.2 临床表现 发热60例(83.37%)，咳嗽51例(70.83%)，厌食20例，盗汗3例，消瘦2例。临床诊断：支气管肺炎25例，支气管炎14例，脓胸1例，结核性脑膜炎(含结核性脑膜脑炎)12例，肺结核10例，病毒性脑炎10例。50例非结核患儿仅2例有结核接触史，除1例外全部接种卡介苗(BCG)。结核病组22例中10例结核接触史明确，接种BCG 14例，另8例未接种。结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)试验结果：非结核组仅2例呈弱阳性；结核组有8例弱阳性，4例阳性到强阳性。
1.3 检查方法 用美国PE公司新一代PCR(9600)扩增仪。用干净试管采集血和/或脑脊液(CSF)标本，行TB-DNA-PCR检查，标本经扩增仪扩增后，经凝胶电泳法检测结果。用干净试管采集血清和/或CSF，用金标法，行分枝杆菌IgG检查。结核菌素实验：取PPD 5 Iu作皮内注射。结果判断以注射后48～72小时(以72小时为准)观察结果。阴性：局部无反应或仅有发红而无硬结；可疑阳性(±)：红肿及硬结最大横径小于0.5 cm；弱阳性(+)：红肿及硬结最大横径小于0.5～0.9 cm；阳性(++)：红肿及硬结最大横径1～1.9 cm；强阳性(+++)：红肿及硬结最大横径在2.0 cm以上；极强阳性(++++)：除红肿及硬结外，局部发生坏死或起疱，或伴有发热全身症状[1]。
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2 结果
72例均为发热或咳嗽1周以上患儿行血清和/或CSF的TB-DNA-PCR检查。血清的TB-DNA-PCR检测结果，见表1。结果表明，敏感度18.18%，特异度64.00%。其中22例有一项或两项阳性，占30.56%；只有4例最后符合结核的临床诊断，只占18.18%。非肺结核组18例血和/或CSF的TB-DNA-PCR阳性复查仅8例阳性。12份结核组CSF的检测结果全部阴性，16份非结核组CSF的有2份阳性。
表1 血标本TB-DNA-PCR检测结果 组 别
例数
TB-PCR
阳性例数
阴性例数
, http://www.100md.com 阳性率(%)
结核组
22
4
18
18.18
非结核组
50
18
32
36.00
u=1.818，P>0.05
2.2 72例行血的分枝杆菌IgG检查和1例行CSF的分枝杆菌IgG检查均为阴性。
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2.3 72例X线胸部平片，正常22例，支气管肺炎25例，支气管炎14例，肺结核10例，脓胸1例。
2.4 22例临床诊断结核病符合结核病的诊断标准。
3 讨论
结核病为经呼吸道传染病，因小儿非特异以及特异性免疫低下，接触病原体后发病以及隐性感染机会均较成年人高。本资料结核组大部分有明确接触史，72例中有8例未接种BCG而发病，所以，结核病接触史和BCG接种史对于结核病诊断是重要的病史和依据。而14例已经接种BCG的小儿患病，可能是注射疫苗方法不当，疫苗效价不稳定，不能产生足够的早期细胞因子以抵抗入侵的结核菌，使之建立的主动免疫不足[2]。非结核组仅有2例PPD弱阳性，进一步说明小儿普遍存在细胞免疫低下。但是PPD阳性仅见于结核组，故有诊断意义。只有定期复种BCG，并严格掌握标准的疫苗注射法，控制疫苗效价，才能达到免疫预防的目的。
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IgG在急性感染期出现，分枝杆菌IgG阳性为结核活动的标志，特异性高[3，4]。可是，在小儿结核的阳性率仍不高，是否与小儿体液免疫低下，抗体滴度过低而呈阴性有关，有待进一步证实。
PCR是近10年发展起来的临床检查技术，是通过对被检微生物DNA/RNA的扩增，使之呈几何级数增加，再通过免疫电泳以相应检测结果，其高敏感性和特异性已被公认[5]。本组资料结核组TB-DNA-PCR阳性率低，非结核组出现较高TB-DNA-PCR的阳性率，敏感性和特异性均不高，同Cegielski等[6]报道的结果相一致。但是，与实际患病不相符，造成假阳性的原因要作多方面考虑。结核组的阳性率不但不高，反而较非结核组为低，但无显著性差异。PCR扩增的对象是DNA/RNA，例如理论上只要被检样本中存在相应DNA/RNA，扩增成功便呈阳性。样本中带DNA/RNA的途径有来自活体微生物，来自死亡微生物的残留细胞器，或者取样过程中的污染。本组资料原TB-DNA-PCR阳性的病例未经抗结核治疗而复查的阳性率低于一半，提示检测系统重复性低或样本中存在一过性TB-DNA，来自血样本的称为一过性DNA血症。其阳性率偏高，可能与小儿群体普遍隐性结核接触史有关，但是由于免疫低下分枝杆菌IgG并无阳性反映，PPD试验也只有少数显示阳性。因此，TB-DNA血症远多于TB菌血症。因为前者除部分反映真性菌血症和样本污染，暨活TB菌外，不排除非活菌残留DNA，多数不发病，是高假阳性和低敏感性的主要原因；而TB菌血症是发病的直接证据。
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由此推知，新技术应用不当亦会造成临床误诊。临床上，结核病的诊断还是以发热、咳嗽、盗汗、厌食、消瘦，结核接触史，接种史，PPD试验，X线照片为依据。本组资料提示：CSF细胞及生化常规检查，静置菌膜查抗酸杆菌仍然对结核性脑膜炎有特异性。对可疑病例常规抗感染不凑效，给以试验性抗结核治疗可以助诊。
在应用PCR等新技术的时候，最好取样本时严格无菌操作，统一取样方法，尽量减少假阳性。尽管这样，因为目前广泛应用的是定性PCR技术，其试剂性能和结果检测的方法各异，样本TB-DNA-PCR检查的特异性会掺差不齐，假阳性率仍然会偏高，因此，该检查尚未法定成为结核病的诊断依据[7]。最近2年，国外已经发展成定量PCR技术，对特异性病原体DNA/RNA进行定量研究，确定样本的启始量，可鉴别基因相似的病原体，以便更特异地诊断病原，判断病人的感染程度以及临床疗效评价[8]，将会成为更特异的临床检测手段。PCR扩增技术与DNA探针相结合可以降低假阴性和假阳性率[9，10]，或者PCR技术与Southern杂交技术相结合，可以进一步提高检测的敏感性和特异性[11]。
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4 参考文献
1 何广学，张力兴，屠德华，等. 测量皮内结核素试验反应两种方法的对比研究. 中国防痨，1997，19(3)：133～136.
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4 熊礼宽，林振南，黄俊新，等. 血清38 KD-IgG抗体和分枝干菌IgG抗体检测对肺结核价值的探讨. 深圳医学，1996，9(5)：7～8.
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5 赵新劳，欧阳杰，张成军，等. 聚合酶链反应在结核诊断上的应用. 中华结核和呼吸杂志，1995，18(4)：198.
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10 Unghes MS,Beck LA，Skuce RA,et al. Development of mycobacterial species-specific DNA probes by subtraction hybridization. FEMS Microbiol Letl,1997,156(1)31～36.
11 张少静，翟振国，田清武，等. 不同检测手段对结核病诊断价值的比较. 康复与疗养杂志，1996，11(4)：156～158.?, 百拇医药