运用短期外周血超抗原反应T细胞系研究超抗原诱导的T细胞凋亡*
作者：宋建勋朱锡华 陈克敏
单位：宋建勋 朱锡华 陈克敏 第三军医大学基础医学部免疫学教研室、全军免疫学研究所 重庆，400038
关键词：超抗原；T细胞；细胞凋亡；细胞系；PBMC
第三军医大学学报990712 提 要 目的：建立短暂外周血超抗原金黄色葡萄球菌A肠毒素(SEA)反应T细胞系,研究SEA诱导的T细胞凋亡。方法：采用超抗原SEA刺激PBMC增殖, rIL-2维持细胞生长, 高速度Ficoll离心去除死细胞建立细胞系。FCM及琼脂糖凝胶电泳检测SEA诱导短期外周血SEA反应T细胞系凋亡。结果: SEA 0.5～5 μg/ml, rIL-2 200 U/ml能有效建立SEA反应T细胞系,此细胞系能在体外维持生长40 d, 对SEA的再次刺激有明显应答能力。1 μg/ml SEA诱导同样剂量建立的SEA反应T细胞凋亡,16 h能明显观察到凋亡特征。结论: SAg与rIL-2能成功建立短期SAg反应T细胞系，受到SEA再次作用后T细胞可发生凋亡。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R329.25;R392.11
Astudy of superantigen-induced T-cell apoptosis using establishment of short-term superantigen-specific T cell line from human peripheral blood*
Song Jianxun, Zhu Xihua, Cheng Keming
(Department of Immunology, Faculty of Basic Medical Sciences, Institute of Immundogy PLA,Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
, http://www.100md.com Abstract Objective: To establish the short-term superantigen-specific T cell line from human peripheral blood and study the superantigen-induced T-cell apoptosis. Methods: The short-term SEA-reactive T-cell line was established by simulation of PBMC 106 with 0.5～5 μg/ml SEA for 3 d and followed by expansion of cells in rIL-2 (200 U/ml) for 2 weeks. The apoptosis of the cell line was detected with both FCM and DNA electrophoresis analysis. Results: The short-term SEA-reactive T-cell line was established by 0.5～5 μg/ml SEA and 200 U/ml rIL-2 from PBMC and the cell line could be maintained for 40 d in vitro. Meanwhile, it was found that the apoptosis appeared after the second stimulation of the SEA-reactive T cells with SEA 1 ug/ml. Conclusion: The short-term superantigen-specific T cell line from human peripheral blood can be established by stimulation of SAg and rIL-2. T-cell apoptosis appears after the second stimulation with SEA in the anergy induced by superantigen.
, http://www.100md.com
Key words superantigen; T cell; apoptosis; cell line; PBMC
超抗原(Superantigen,SAg)是一种新型的蛋白质抗原分子，可以在MHCⅡ类分子非限制性辅助下，以T细胞抗原识别受体Vβ(T cell receptor Vβ，TCRVβ)特异性的方式激活比普通抗原多达数千倍的CD4+和CD8+ T细胞，促使它们增生及分泌细胞因子，因此，超抗原在抗肿瘤中的作用愈发受到重视[1]。然而,SAg在激活大量特异性T细胞之后，常伴随克隆缺失和免疫耐受，可能与T细胞凋亡有关[2]。由于超抗原对T细胞的作用有TCRVβ特异性，其激活的T细胞种类必须是其所针对的TCRVβ类型，这给实验工作带来了不便。金黄色葡萄球菌A型肠毒素(SEA)只能激活TCRVβ3、Vβ11等细胞，而现有的大多数T细胞株TCRVβ与之不同，故需要另外建立SEA反应T细胞系，才便于进行相关试验。我们从人外周血中建立了一短期超抗原反应T细胞系,并以此研究了SAg诱导的T细胞凋亡。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 SEA(1mg,军事医科院产品)，rIL-2(10000 U，重庆解放军分子免疫学重点实验室产品，批号971027)。淋巴细胞分离液(中国医科院血液研究所,批号970311)；Ficoll(上海试剂二厂,批号970809)。碘化丙啶(PI, Sigma)，非离子去污剂Triton X-100(Sigma)。DNA Marker: λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ(华美)。酶：蛋白酶K、RNase A(华美)。
1.1.2 白细胞成份血液标本(重庆西南医院输血科，批号971124-1538)。
1.1.3 细胞培养液 10% NCS的RPMI 1640培养液，其中含100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，10 mmol/L HEPES,2 mmol/L L-Gln。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1人外周血单核细胞(Peripheral blood monocyte cell,PBMC)的分离 按常规方法进行。
1.2.2 SEA反应T细胞的诱导 参照文献[3，4],略有修改。PBMC 106/ml,加入SEA (0.5～5)μg/ml，37°C，5% CO2的饱和温度条件下培养3 d，第4天换液，洗涤，尽可能去除SEA和单核巨噬细胞。培养液中加入200 U/ml的rIL-2，经过14 d含rIL-2的完全RPMI 1640培养液培养，短时SEA反应T细胞系即可建立。
1.2.3 SEA反应T细胞系中细胞碎渣的去除 SEA反应T细胞系经离心洗涤后，用少量Hanks液(约2 ml)悬浮，加入含5ml Ficoll液的5 ml离心管的上层，离心1000×g,15 min，取上层白雾状细胞层，RPMI 1640不全培养液洗涤2次后，继续培养。
, http://www.100md.com
1.2.4 SEA诱导SEA反应T细胞系凋亡 收集短期人外周血SEA反应T细胞,Hanks溶液洗涤离心，细胞用含10% NCS的RPMI 1640完全培养液悬浮,调整密度为5×105/ml,加入24孔平底细胞培养板(Costar),1 ml/孔，37°C,5% CO2的饱和湿度条件下培养2 h。细胞培养液中加入SEA 1 μg/ml，继续培养。
1.2.5 短期人外周血SEA反应T细胞凋亡 于培养的不同时间(0、2、4、8、16、24、32 h)收集 细胞检测 。①用PI低渗荧光染色液染色(PI 50 μg/ml,枸椽酸钠0.1%,Triton X-100 0.1%),参照文献[5],FCM检测亚G0/G1峰大小(A0),反映已固缩和降解核DNA的细胞数,即凋亡细胞比率。试验2次，取平均值。②常规方法提取细胞DNA[6],1.8%琼脂糖凝胶电泳,观察凋亡细胞DNA梯状电泳带。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 SEA反应T细胞系的特点 经SEA刺激,rIL-2作用后,PBMC的T淋巴细胞于第4天开始大量增殖,细胞数量明显增多,形成大量聚集在一起的细胞集落,细胞增大,拉长,母细胞化现象明显。而不经SEA刺激，仅由rIL-2作用的PBMC细胞，虽然T淋巴细胞也有增多现象，少量细胞拉长,分裂，但没有大的细胞集落形成，细胞总数量较SEA刺激组明显少，见图1。SEA刺激后，从第7天开始，细胞出现死亡，数量逐渐增多，死亡细胞主要是B细胞和SEA非特异T细胞，至第14天死亡细胞开始减少，细胞生长与死亡达一个平衡状态。SEA反应T细胞系可在体外连续培养40 d左右，在此过程中必须维持rIL-2的作用，否则细胞增殖后很快死亡[7]。
图1 从人外周血中建立短期SEA反应T细胞系 (×100)
, 百拇医药
A：SEA反应T细胞系(SEA 1 μg/ml,rIL-2 200 U作用第4天)；B：rIL-2作用的PBMC(仅rIL-2 200 U作用第4天)
Fig 1 Establishment of short-term SEA-specific T-cell line from human peripheral blood (×100)
A：SEA-reactive T-cell line treated with SEA 1 μg/ml,rIL-2 200 U (4th day)；B：PBMC treated with rIL-2 200 U(4th day)
2.2 SEA反应T细胞系的保存及细胞碎渣的去除 SEA反应T细胞经10% DMSO小牛血清冻存,复苏后仍然保持较强的对SEA反应性。经一次SEA刺激诱导后，可以大量冻存一批，以备以后实验使用。SEA刺激诱导过程中，有许多对SEA不反应的细胞在培养中逐步死亡,故需清除细胞死亡碎片,采用Ficoll液及较高离心速度基本可以排除。
, http://www.100md.com
2.3 SEA刺激浓度对SEA反应细胞的影响 SEA 0.5～5 μg/ml对PBMC都有较强的刺激效果,由此建立的SEA反应T细胞系对SEA的再次刺激都可产生应答。SEA刺激浓度再高(如8 μg/ml)虽也能产生强的应答增殖能力，但随后的细胞死亡也较快，SEA反应T细胞不易建立。
2.4 SEA诱导人外周血短期SEA反应T细胞凋亡
SEA 1 μg/ml诱导同样剂量刺激建立的短期SEA反应T细胞凋亡非常明显。光镜下,作用8h可观察到部分细胞死亡,作用16 h则出现比较明显的凋亡细胞特征。FCM分析亚G0-G1峰(A0)显示,随着诱导时间的延长,凋亡量逐步升高,至作用的第16小时,细胞凋亡量可达58%，见图2。SEA反应T细胞(SEA 1 μg/ml使用剂量诱导建立)凋亡量随SEA再次刺激浓度(0.5～6 μg/ml)的升高而增加。
, 百拇医药
图2 FCM分析SEA诱导SEA反应T细胞凋亡 (A0代表凋亡细胞)
Fig 2 Analysis of apoptosis induced by SEA in SEA-specific T cells by flow cytometry (The A0 peak represents apoptotic cells)
1.8%琼脂糖凝胶细胞DNA电泳显示，SEA 1 μg/ml诱导同样剂量刺激建立的短期SEA反应T细胞于作用的第16 h，DNA电泳成梯形泳带较明显。至作用的第24 h和32 h时，由于死亡细胞增多，DNA梯形渐弱，而近呈模糊的片状条带，见图3。
图3 DNA琼脂糖凝胶电泳分析SEA诱导SEA反应T细胞凋亡 1.DNA标准(λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)；2. 0 h; 3. 16 h; 4. 12 h; 5. 8 h
, http://www.100md.com
Fig 3 Analysis of apoptosis induced by SEA in SEA-specific T cells by DNA electrophoresis with 1.8% agarose gel
1.DNA Marker(λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ); 2. 0 h; 3. 16 h; 4. 12 h; 5. 8 h
3 讨论
PBMC主要由T、B淋巴细胞和单核细胞组成，SAg可以与单核细胞、B细胞表面的MHCⅡ类分子结合，通过TCRVβ激活大量T细胞。激活的T细胞随后在IL-2的作用下，继续大量扩增。经过2周左右在IL-2存在的条件下扩增生长，特异性的SAg反应T细胞系即可建立。此时，B细胞与非特异性的T细胞已大量死亡，单核细胞因贴在瓶壁在换瓶培养中可去除。因此，由此建立的短期SAg反应T细胞系主要由SAg特异的T细胞组成。用这种方法建立起来的SAg反应T细胞系在SAg基础和应用研究方面起到重要作用[4]。
, http://www.100md.com
超抗原诱导特异性T细胞发生激活诱导的细胞死亡(Activation-induced cell death,AICD)，导致T细胞克隆缺失，在某种程度上降低机体的抵抗力，其过程比较复杂，受到环境中多方面因素的作用。现已明确，Fas系统在超抗原诱导的T细胞克隆缺失中起重要的作用[8]。超抗原作用于机体后，可特异性地激活某些T细胞使之增殖，同时细胞表面标志B220、Fas、FasL等表达升高，细胞因子IL-10、IFN-γ和TNF-α等分泌增加。在超抗原继续刺激细胞生长环境中表达MHCⅡ类分子的APC时，则APC的B7分子与T细胞的CD28分子可相互作用，促进存活基因Bcl-2、Bcl-XL等表达上调，绕过Fas死亡信号的传导途径，继续促进特异性T细胞增殖。反之，若T细胞生长环境无表达MHCⅡ类分子的APC存在，或缺乏其它一些促进细胞增殖与分化的分子存在(如IL-2)，则T细胞经过Fas/FasL途径而诱导凋亡，产生特异性T细胞克隆缺失[9，10]。超抗原通过Fas/FasL途径诱导特异性T细胞克隆缺失的问题，有望通过注入IL-2加以克服，使超抗原既能激活大量的特异性T细胞使之增殖，增强机体的免疫功能，又能避免其产生的AICD[7]，这在超抗原的抗肿瘤等应用方面将起重要的作用。
, 百拇医药
*全军“九五”医药卫生重点项目，No.96Z038
*This project was supported by the "Ninth five" obligatory budget of PLA,No.96Z038
**宋建勋，男，32岁，讲师，博士
参考文献
1 Litton M I, Dohlsten M, Lando P A, et al. Antibody-targeted superantigen therapy induces tumor-infiltrating lymphocytes, excessive cytokine production,and apoptosis in human colon carcinoma. Eur J Immunol,1996，26(1):1
, 百拇医药
2 Cauley L S, Cauley K A, Shub F, et al. Transferable anergy: superantigen treatment induces CD4+ T cell tolerance that is reversible and requires CD4-CD8+ cells and interferon gamma.J Exp Med,1997，186:71
3 Alderson M R, Tough T W, Davis-Smith T, et al. Fas ligand mediates activation-induced cell death in human T lymphocytes. J Exp Med,1995,181(1):717
4 Boshell M, Mcleod J, Walker L, et al. Effects of antigen presentation on superantigen-induced apoptosis mediated by Fas/Fas ligand interaction in human T cells. Immunology, 1996， 87(4):586
, 百拇医药
5 Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci M C, et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Methods,1991，139:271
6 Ausubel F M, Brent R, Kingston R E, et al. 精编分子生物学实验指南. 北京:科学出版社,1998.35～36
7 Kuroda K, Yagi J, Imanishi K, et al. Implantation of IL-2 containing osmotic pump prolongs the survival of superantigen-reactive T cells expands in mice injected with bacterial superantigen. J Immunol, 1996，157(4):1422
, 百拇医药
8 Ettinger R, Panka D J, Wang J K M, et al. Fas ligand-mediated cytotoxicity directly responsible for apoptosis of normal CD4+ T cells responding to a bacterial superantigen. J Immunol, 1995，154(9):4302
9 Renno T, Hahne M, Tschopp J, et al. Peripheral T cells undergoing superantigen induced apoptosis in vivo express B220 and upregulate Fas and Fas ligand. J Exp Med,1996，183(2):431
10 Aroeira L S, Moreno M C, Martinez C. In vivo activation of T-cell induction into the primed phenotype and programmed cell death by staphylococcal enterotoxin B. Scand J Immunol,1996，43(5):545
收稿：1998-12-09；修回：1999-06-23, http://www.100md.com
单位：宋建勋 朱锡华 陈克敏 第三军医大学基础医学部免疫学教研室、全军免疫学研究所 重庆，400038
关键词：超抗原；T细胞；细胞凋亡；细胞系；PBMC
第三军医大学学报990712 提 要 目的：建立短暂外周血超抗原金黄色葡萄球菌A肠毒素(SEA)反应T细胞系,研究SEA诱导的T细胞凋亡。方法：采用超抗原SEA刺激PBMC增殖, rIL-2维持细胞生长, 高速度Ficoll离心去除死细胞建立细胞系。FCM及琼脂糖凝胶电泳检测SEA诱导短期外周血SEA反应T细胞系凋亡。结果: SEA 0.5～5 μg/ml, rIL-2 200 U/ml能有效建立SEA反应T细胞系,此细胞系能在体外维持生长40 d, 对SEA的再次刺激有明显应答能力。1 μg/ml SEA诱导同样剂量建立的SEA反应T细胞凋亡,16 h能明显观察到凋亡特征。结论: SAg与rIL-2能成功建立短期SAg反应T细胞系，受到SEA再次作用后T细胞可发生凋亡。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R329.25;R392.11
Astudy of superantigen-induced T-cell apoptosis using establishment of short-term superantigen-specific T cell line from human peripheral blood*
Song Jianxun, Zhu Xihua, Cheng Keming
(Department of Immunology, Faculty of Basic Medical Sciences, Institute of Immundogy PLA,Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
, http://www.100md.com Abstract Objective: To establish the short-term superantigen-specific T cell line from human peripheral blood and study the superantigen-induced T-cell apoptosis. Methods: The short-term SEA-reactive T-cell line was established by simulation of PBMC 106 with 0.5～5 μg/ml SEA for 3 d and followed by expansion of cells in rIL-2 (200 U/ml) for 2 weeks. The apoptosis of the cell line was detected with both FCM and DNA electrophoresis analysis. Results: The short-term SEA-reactive T-cell line was established by 0.5～5 μg/ml SEA and 200 U/ml rIL-2 from PBMC and the cell line could be maintained for 40 d in vitro. Meanwhile, it was found that the apoptosis appeared after the second stimulation of the SEA-reactive T cells with SEA 1 ug/ml. Conclusion: The short-term superantigen-specific T cell line from human peripheral blood can be established by stimulation of SAg and rIL-2. T-cell apoptosis appears after the second stimulation with SEA in the anergy induced by superantigen.
, http://www.100md.com
Key words superantigen; T cell; apoptosis; cell line; PBMC
超抗原(Superantigen,SAg)是一种新型的蛋白质抗原分子，可以在MHCⅡ类分子非限制性辅助下，以T细胞抗原识别受体Vβ(T cell receptor Vβ，TCRVβ)特异性的方式激活比普通抗原多达数千倍的CD4+和CD8+ T细胞，促使它们增生及分泌细胞因子，因此，超抗原在抗肿瘤中的作用愈发受到重视[1]。然而,SAg在激活大量特异性T细胞之后，常伴随克隆缺失和免疫耐受，可能与T细胞凋亡有关[2]。由于超抗原对T细胞的作用有TCRVβ特异性，其激活的T细胞种类必须是其所针对的TCRVβ类型，这给实验工作带来了不便。金黄色葡萄球菌A型肠毒素(SEA)只能激活TCRVβ3、Vβ11等细胞，而现有的大多数T细胞株TCRVβ与之不同，故需要另外建立SEA反应T细胞系，才便于进行相关试验。我们从人外周血中建立了一短期超抗原反应T细胞系,并以此研究了SAg诱导的T细胞凋亡。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 SEA(1mg,军事医科院产品)，rIL-2(10000 U，重庆解放军分子免疫学重点实验室产品，批号971027)。淋巴细胞分离液(中国医科院血液研究所,批号970311)；Ficoll(上海试剂二厂,批号970809)。碘化丙啶(PI, Sigma)，非离子去污剂Triton X-100(Sigma)。DNA Marker: λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ(华美)。酶：蛋白酶K、RNase A(华美)。
1.1.2 白细胞成份血液标本(重庆西南医院输血科，批号971124-1538)。
1.1.3 细胞培养液 10% NCS的RPMI 1640培养液，其中含100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，10 mmol/L HEPES,2 mmol/L L-Gln。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1人外周血单核细胞(Peripheral blood monocyte cell,PBMC)的分离 按常规方法进行。
1.2.2 SEA反应T细胞的诱导 参照文献[3，4],略有修改。PBMC 106/ml,加入SEA (0.5～5)μg/ml，37°C，5% CO2的饱和温度条件下培养3 d，第4天换液，洗涤，尽可能去除SEA和单核巨噬细胞。培养液中加入200 U/ml的rIL-2，经过14 d含rIL-2的完全RPMI 1640培养液培养，短时SEA反应T细胞系即可建立。
1.2.3 SEA反应T细胞系中细胞碎渣的去除 SEA反应T细胞系经离心洗涤后，用少量Hanks液(约2 ml)悬浮，加入含5ml Ficoll液的5 ml离心管的上层，离心1000×g,15 min，取上层白雾状细胞层，RPMI 1640不全培养液洗涤2次后，继续培养。
, http://www.100md.com
1.2.4 SEA诱导SEA反应T细胞系凋亡 收集短期人外周血SEA反应T细胞,Hanks溶液洗涤离心，细胞用含10% NCS的RPMI 1640完全培养液悬浮,调整密度为5×105/ml,加入24孔平底细胞培养板(Costar),1 ml/孔，37°C,5% CO2的饱和湿度条件下培养2 h。细胞培养液中加入SEA 1 μg/ml，继续培养。
1.2.5 短期人外周血SEA反应T细胞凋亡 于培养的不同时间(0、2、4、8、16、24、32 h)收集 细胞检测 。①用PI低渗荧光染色液染色(PI 50 μg/ml,枸椽酸钠0.1%,Triton X-100 0.1%),参照文献[5],FCM检测亚G0/G1峰大小(A0),反映已固缩和降解核DNA的细胞数,即凋亡细胞比率。试验2次，取平均值。②常规方法提取细胞DNA[6],1.8%琼脂糖凝胶电泳,观察凋亡细胞DNA梯状电泳带。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 SEA反应T细胞系的特点 经SEA刺激,rIL-2作用后,PBMC的T淋巴细胞于第4天开始大量增殖,细胞数量明显增多,形成大量聚集在一起的细胞集落,细胞增大,拉长,母细胞化现象明显。而不经SEA刺激，仅由rIL-2作用的PBMC细胞，虽然T淋巴细胞也有增多现象，少量细胞拉长,分裂，但没有大的细胞集落形成，细胞总数量较SEA刺激组明显少，见图1。SEA刺激后，从第7天开始，细胞出现死亡，数量逐渐增多，死亡细胞主要是B细胞和SEA非特异T细胞，至第14天死亡细胞开始减少，细胞生长与死亡达一个平衡状态。SEA反应T细胞系可在体外连续培养40 d左右，在此过程中必须维持rIL-2的作用，否则细胞增殖后很快死亡[7]。
图1 从人外周血中建立短期SEA反应T细胞系 (×100)
, 百拇医药
A：SEA反应T细胞系(SEA 1 μg/ml,rIL-2 200 U作用第4天)；B：rIL-2作用的PBMC(仅rIL-2 200 U作用第4天)
Fig 1 Establishment of short-term SEA-specific T-cell line from human peripheral blood (×100)
A：SEA-reactive T-cell line treated with SEA 1 μg/ml,rIL-2 200 U (4th day)；B：PBMC treated with rIL-2 200 U(4th day)
2.2 SEA反应T细胞系的保存及细胞碎渣的去除 SEA反应T细胞经10% DMSO小牛血清冻存,复苏后仍然保持较强的对SEA反应性。经一次SEA刺激诱导后，可以大量冻存一批，以备以后实验使用。SEA刺激诱导过程中，有许多对SEA不反应的细胞在培养中逐步死亡,故需清除细胞死亡碎片,采用Ficoll液及较高离心速度基本可以排除。
, http://www.100md.com
2.3 SEA刺激浓度对SEA反应细胞的影响 SEA 0.5～5 μg/ml对PBMC都有较强的刺激效果,由此建立的SEA反应T细胞系对SEA的再次刺激都可产生应答。SEA刺激浓度再高(如8 μg/ml)虽也能产生强的应答增殖能力，但随后的细胞死亡也较快，SEA反应T细胞不易建立。
2.4 SEA诱导人外周血短期SEA反应T细胞凋亡
SEA 1 μg/ml诱导同样剂量刺激建立的短期SEA反应T细胞凋亡非常明显。光镜下,作用8h可观察到部分细胞死亡,作用16 h则出现比较明显的凋亡细胞特征。FCM分析亚G0-G1峰(A0)显示,随着诱导时间的延长,凋亡量逐步升高,至作用的第16小时,细胞凋亡量可达58%，见图2。SEA反应T细胞(SEA 1 μg/ml使用剂量诱导建立)凋亡量随SEA再次刺激浓度(0.5～6 μg/ml)的升高而增加。
, 百拇医药
图2 FCM分析SEA诱导SEA反应T细胞凋亡 (A0代表凋亡细胞)
Fig 2 Analysis of apoptosis induced by SEA in SEA-specific T cells by flow cytometry (The A0 peak represents apoptotic cells)
1.8%琼脂糖凝胶细胞DNA电泳显示，SEA 1 μg/ml诱导同样剂量刺激建立的短期SEA反应T细胞于作用的第16 h，DNA电泳成梯形泳带较明显。至作用的第24 h和32 h时，由于死亡细胞增多，DNA梯形渐弱，而近呈模糊的片状条带，见图3。
图3 DNA琼脂糖凝胶电泳分析SEA诱导SEA反应T细胞凋亡 1.DNA标准(λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)；2. 0 h; 3. 16 h; 4. 12 h; 5. 8 h
, http://www.100md.com
Fig 3 Analysis of apoptosis induced by SEA in SEA-specific T cells by DNA electrophoresis with 1.8% agarose gel
1.DNA Marker(λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ); 2. 0 h; 3. 16 h; 4. 12 h; 5. 8 h
3 讨论
PBMC主要由T、B淋巴细胞和单核细胞组成，SAg可以与单核细胞、B细胞表面的MHCⅡ类分子结合，通过TCRVβ激活大量T细胞。激活的T细胞随后在IL-2的作用下，继续大量扩增。经过2周左右在IL-2存在的条件下扩增生长，特异性的SAg反应T细胞系即可建立。此时，B细胞与非特异性的T细胞已大量死亡，单核细胞因贴在瓶壁在换瓶培养中可去除。因此，由此建立的短期SAg反应T细胞系主要由SAg特异的T细胞组成。用这种方法建立起来的SAg反应T细胞系在SAg基础和应用研究方面起到重要作用[4]。
, http://www.100md.com
超抗原诱导特异性T细胞发生激活诱导的细胞死亡(Activation-induced cell death,AICD)，导致T细胞克隆缺失，在某种程度上降低机体的抵抗力，其过程比较复杂，受到环境中多方面因素的作用。现已明确，Fas系统在超抗原诱导的T细胞克隆缺失中起重要的作用[8]。超抗原作用于机体后，可特异性地激活某些T细胞使之增殖，同时细胞表面标志B220、Fas、FasL等表达升高，细胞因子IL-10、IFN-γ和TNF-α等分泌增加。在超抗原继续刺激细胞生长环境中表达MHCⅡ类分子的APC时，则APC的B7分子与T细胞的CD28分子可相互作用，促进存活基因Bcl-2、Bcl-XL等表达上调，绕过Fas死亡信号的传导途径，继续促进特异性T细胞增殖。反之，若T细胞生长环境无表达MHCⅡ类分子的APC存在，或缺乏其它一些促进细胞增殖与分化的分子存在(如IL-2)，则T细胞经过Fas/FasL途径而诱导凋亡，产生特异性T细胞克隆缺失[9，10]。超抗原通过Fas/FasL途径诱导特异性T细胞克隆缺失的问题，有望通过注入IL-2加以克服，使超抗原既能激活大量的特异性T细胞使之增殖，增强机体的免疫功能，又能避免其产生的AICD[7]，这在超抗原的抗肿瘤等应用方面将起重要的作用。
, 百拇医药
*全军“九五”医药卫生重点项目，No.96Z038
*This project was supported by the "Ninth five" obligatory budget of PLA,No.96Z038
**宋建勋，男，32岁，讲师，博士
参考文献
1 Litton M I, Dohlsten M, Lando P A, et al. Antibody-targeted superantigen therapy induces tumor-infiltrating lymphocytes, excessive cytokine production,and apoptosis in human colon carcinoma. Eur J Immunol,1996，26(1):1
, 百拇医药
2 Cauley L S, Cauley K A, Shub F, et al. Transferable anergy: superantigen treatment induces CD4+ T cell tolerance that is reversible and requires CD4-CD8+ cells and interferon gamma.J Exp Med,1997，186:71
3 Alderson M R, Tough T W, Davis-Smith T, et al. Fas ligand mediates activation-induced cell death in human T lymphocytes. J Exp Med,1995,181(1):717
4 Boshell M, Mcleod J, Walker L, et al. Effects of antigen presentation on superantigen-induced apoptosis mediated by Fas/Fas ligand interaction in human T cells. Immunology, 1996， 87(4):586
, 百拇医药
5 Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci M C, et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Methods,1991，139:271
6 Ausubel F M, Brent R, Kingston R E, et al. 精编分子生物学实验指南. 北京:科学出版社,1998.35～36
7 Kuroda K, Yagi J, Imanishi K, et al. Implantation of IL-2 containing osmotic pump prolongs the survival of superantigen-reactive T cells expands in mice injected with bacterial superantigen. J Immunol, 1996，157(4):1422
, 百拇医药
8 Ettinger R, Panka D J, Wang J K M, et al. Fas ligand-mediated cytotoxicity directly responsible for apoptosis of normal CD4+ T cells responding to a bacterial superantigen. J Immunol, 1995，154(9):4302
9 Renno T, Hahne M, Tschopp J, et al. Peripheral T cells undergoing superantigen induced apoptosis in vivo express B220 and upregulate Fas and Fas ligand. J Exp Med,1996，183(2):431
10 Aroeira L S, Moreno M C, Martinez C. In vivo activation of T-cell induction into the primed phenotype and programmed cell death by staphylococcal enterotoxin B. Scand J Immunol,1996，43(5):545
收稿：1998-12-09；修回：1999-06-23, http://www.100md.com