磨损颗粒对滑膜细胞系胞间通讯的影响及其在人工关节无菌性松动中的意义
作者：蔡 王继芳 胡永成 卢世璧 李楠 黄靖香
单位：100853 北京，解放军总医院骨科(蔡、王继芳、胡永成、卢世璧)；中心仪器室(李楠)；病理科(黄靖香)
关键词：人工关节；滑膜
中华外科杂志990707 【摘要】 目的 通过观察磨损颗粒作用下滑膜细胞系胞间通讯的改变，探讨无菌性松动人工关节假体-骨界面纤维组织异常增生的生物学原因。 方法 体外培养获得正常髋关节滑膜细胞系，借助荧光光淬灭恢复技术(FRAP)及激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)监测加入1.5 mg/ml(W/V)Ti合金、CoCr合金或UHMWPE 颗粒悬液后滑膜细胞胞间通讯的改变。 结果 经三种颗粒刺激后滑膜细胞胞间通讯均显著下降(P<0.01)，下降程度以UHMWPE颗粒组最明显，Ti合金颗粒组最小(P<0.01)，而且胞间通讯程度以FCs低于MCs(P<0.05)。 结论 除促成纤维性细胞因子的作用外，与松动有关的人工关节假体-骨界面纤维组织大量增生可能与磨损颗粒直接刺激下界面成纤维细胞胞间通讯减弱引起的活跃增殖有关。
, http://www.100md.com
Effect of wear particles on cell-to-cell communication of synoviocyte system in vitro and its significance in aseptic loosening of prosthesis
CAI Xu,WANG Jifang,HU Yongcheng,et al.
General Hospital of Chinese People′s Liberation Army,Beijing 100853.
【Abstract】 Objective To study the biological reason of abnormal fiber proliferation at bone-implant interface of aseptically loosened prosthesis by observing cell-to-cell communication of synoviocyte system in vitro under the stimulation of wear particles. Methods The synoviocyte system of normal human hip joint was established in vitro and the change of cell-to-cell communication was monitored by fluorescence redistribution after photobleaching technique(FRAP) and confocal laser scanning microscope(CLSM) after Ti alloy,CoCr alloy or UHMWPE particles suspension(1.5 mg/ml, W/V) was added into the system. Results Cell-to-cell communication of synoviocyte system significantly decreased under the stimulation of three kinds of particles(P<0.01).he decreased degree was maximal in UHMWPE group and minimal in Ti alloy group(P<0.01).The cell-to-cell communication level of fibroblast-like-cells (FCs) was significantly lower than that of macrophage-like-cells (MCs) (P<0.05). Conclusions Besides the effect of cytokines promoting fiber proliferation,the great amount of fiberous granuloma at bone-implant interface which has relations with aseptic loosening may be caused by the decrease of cell-to-cell communication of fibroblast under direct stimulation of wear particles.
, 百拇医药
【Key words】 Joint prosthesis Synovial membrane
缝隙连接介导的胞间通讯在细胞增殖和分化中起重要作用，通讯程度的减弱有可能使细胞获得一定的自立性而表现为活跃增殖[1]。由于无菌性松动人工关节骨-假体界面除存在以磨损颗粒和巨噬细胞(MΦ)为基础的慢性异物炎症反应外，还伴有大量纤维组织增生，该现象可由MΦ分泌的一些细胞因子(如PDGF )作用造成[2]，也可能与磨损颗粒直接刺激界面成纤维细胞有关[3]。本研究借助于荧光光淬灭恢复技术(fluorescence redistribution after photobleaching, FRAP)和激光扫描共聚焦显微镜(Confocal Laser scanning microscopy,CLSM)对人工关节材料颗粒刺激下体外培养滑膜细胞胞间通讯的情况进行了观察。
材料和方法
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一、细胞准备及实验分组
将传代滑膜细胞[4]种至96孔板中，于5%CO2孵箱中37℃培养24小时，细胞呈单层网格状贴壁生长后，按空白对照及分别滴加浓度为1.5mg/ml(W/V)的Ti合金(Ti-6Al-4 V，平均直径3.21 μm，美国Zimmer公司提供)、CoCr合金(平均直径5.38 μm，美国Zimmer公司提供)及UHMWPE(镜下测量直径12～200 μm，德国Hoechst公司提供)颗粒悬液10 μl，分为4组进行实验。
二、荧光负载
弃培养孔内培养液，HANK′s液清洗2次，加入10 μM CFDA(美国分子探针公司)工作液50 μl，置5% CO2孵箱37 ℃孵育10分钟。弃染色液，用HANK′s液洗去多余CFDA，然后加入培养液50 μl，于ACAS Ultima型CLSM(美国Meridian公司)上进行检测。
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三、实验步骤
1.CLSM参数设置：激光功率500 MW，光电倍增管强度24%，扫描强度30%，淬灭强度60%，淬灭脉冲时间200 ms，扫描次数5次，扫描时间2分钟，扫描步进1.0 μm，载物台移动速度20.00 mm/s，物镜10倍。
2.监测方法：CLSM监视器上选择荧光度强，细胞轮廓清晰，疏密分布适当，不同细胞形态并存的区域作为监测对象，按分组施加处理。在所选区域内根据荧光着色细胞的大小和形状分别选择小型细胞(macrophage-like cells,MCs)和大型细胞(fibroblast-like cells,FCs)，要求它们与周围其它细胞紧密连接，另选细胞蔟作为背景校正。加入颗粒悬液10 μl，10分钟后经过预扫描，用激光对所选细胞进行荧光淬灭，完成后监测4分钟，观察其荧光恢复情况，计算机自动采集数据。
四、数据处理
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获得的荧光恢复速率经校正后，在两类细胞及各处理组间进行比较，用方差分析法作显著性检验。
结 果
代表胞间通讯程度的CFDA光淬灭恢复速率，经不同颗粒刺激后发生的改变有所不同(表1)。
表1 不同处理滑膜细胞内CFDA光淬灭恢复速率(
±s) 组 别
MCs
FCs
合计
空白
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4.85±0.19
3.92±0.22
4.41±0.15
Ti合金颗粒
3.45±0.29
2.57±0.21
2.94±0.18
CoCr合金颗粒
3.05±0.35
1.61±0.17
2.19±0.21
, 百拇医药
UHMWPE颗粒
1.12±0.22
1.39±0.27△
1.28±0.20
注:与其它各组比较P<0.01；△与空白和Ti合金颗粒组比较,P<0.01；**与同组MCs比较P<0.01
总体上，经三种人工关节材料颗粒刺激后滑膜细胞胞间通讯与正常细胞相比均显著下降(P<0.01)，下降程度由大到小依次为UHMWPE颗粒刺激组、CoCr合金颗粒刺激组和Ti合金颗粒刺激组(P<0.01)。
MCs胞间通讯各刺激组也均明显低于空白对照组(P<0.01)，其中UHMWPE 颗粒刺激组下降最明显(P<0.01)，而Ti和CoCr合金颗粒刺激组之间差异无显著性意义(P>0.05)。
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FCs胞间通讯各刺激组同样均显著低于空白对照组(P<0.01)，其中以Ti 合金颗粒刺激组通讯程度较高(P<0.01)，UHMWPE和CoCr合金颗粒刺激组之间差异无显著性意义(P>0.05)。
除UHMWPE颗粒刺激组内MCs与FCs胞间通讯程度无显著性差异(P>0.05)外，其它各组胞间通讯均以FCs低于MCs(P<0.05)。
讨 论
接触细胞间胞膜形成的通道结构-缝隙连接可通透Ca2+等许多离子及cAMP等小分子信号物质，从而能将一个细胞胞质内的信息传递到另一个细胞胞质中，这是目前普遍认为的组织或细胞群体内信号传播的主要通道，其介导的胞间通讯与细胞增殖调控密切相关[1]。另外，有学者发现许多肿瘤细胞缺少或无缝隙连接通讯，因而表现为无限制的生长[5]；创伤边缘细胞缝隙连接通讯明显下降，并且细胞与创伤距离的远近和缝隙连接通讯的强弱呈正相关[6]。提示生长活跃细胞缝隙连接的低功能状态可能有利于保持生长刺激信号分子在细胞内的浓度，从而促进细胞增殖。然而磨损颗粒对缝隙连接介导的胞间通讯的影响，目前国内外均未见报道。本实验以体外培养的正常髋关节滑膜细胞系为模型，对此进行了初步研究。
, 百拇医药
本实验结果表明，体外培养的滑膜细胞受人工关节材料颗粒刺激后，其缝隙连接介导的胞间通讯水平均明显降低，并且因UHMWPE颗粒悬浮于细胞外液的液面，故该反应过程似乎不需要颗粒物质与细胞的直接接触而诱发。三种颗粒中以UHMWPE颗粒引起的胞间通讯水平下降最为显著，CoCr合金颗粒次之，Ti合金颗粒的作用虽相对较小但与CoCr合金颗粒的作用水平接近。而CoCr合金颗粒虽然在短时间内可能引起胞间通讯的减弱，有促进细胞增殖的趋势，但随着时间的延长，起主要作用的可能是Co离子的毒性作用[7]，因而导致细胞死亡；Ti 合金颗粒对缝隙连接的抑制作用虽相对较弱，但受其刺激的胞间通讯仍显著低于正常细胞(P<0.01)，因此滑膜细胞也表现出活跃生长的倾向。另外，虽然UHMWPE颗粒刺激组内MCs与FCs各自的胞间通讯能力下降水平差异无显著性意义(P>0.05)，但另两组内FCs胞间通讯程度均低于MCs(P<0.05)，提示磨损颗粒刺激下胞间通讯的抑制对成纤维细胞的增殖具有更为重要的意义。
缝隙连接是一个动态结构，其连接孔径受细胞膜电位和细胞内pH值调节，而且在调控细胞生长和分化中起重要作用的胞内第二信使Ca2+和cAMP水平的波动均可影响细胞的连接通讯功能。因此，可以认为，人工关节材料颗粒刺激滑膜细胞内[Ca2+]i的升高[4]是造成其缝隙连接胞间通讯功能抑制的原因之一。类似的情况是否存在于体内无菌性松动人工关节界面组织中，并成为磨损颗粒刺激下界膜中PDGF等细胞因子作用持久而有效以及界面炎性细胞丰富、纤维组织大量增生的更深层次原因尚待进一步研究证实。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助
参 考 文 献
1 孙大业. 胞间信号.见:孙大业,郭艳林，主编.细胞信号系统.北京:科学出版社,1993.16-43.
2 Jiranek WA,Machado M,Jasty M,et al.Production of cytokinesaround loosened cemented acetabular components:analysis with immunohistochemical techniques and insitu hydridization.J Bone Joint Surg(Am),1993,75:863-879.
3 Maloney WJ,Smith RL,Castro F,et al.Fibroblast response to metallic debris in vitro:enzyme induction,cell proliferation,and toxicity.J Bone Joint Surg(Am),1993,75:835-844.
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4 蔡,王继芳,胡永成,等.人工关节磨损颗粒激活骨-假体界面巨噬细胞生物学机制探讨.中华外科杂志,1999,37:53-56.
5 Mehta PP,Bertram JS,Loewenstein WR.Growth inhibition of transformed cells correlates with their junctional communication withnormal cells.Cell,1986,44:187-196.
6 林仲翔.间隙连接通讯-生长调控-癌变三者之间的关系.细胞生物学杂志,1988,10:111-115.
7 Rae T.A study on the effects of particulate metals of orthopaedic interest on murine macrophages in vitro.J Bone Joint Surg(Br),1975, 57:444-450.
(收稿：1998-04-07 修回：1999-03-31), 百拇医药
单位：100853 北京，解放军总医院骨科(蔡、王继芳、胡永成、卢世璧)；中心仪器室(李楠)；病理科(黄靖香)
关键词：人工关节；滑膜
中华外科杂志990707 【摘要】 目的 通过观察磨损颗粒作用下滑膜细胞系胞间通讯的改变，探讨无菌性松动人工关节假体-骨界面纤维组织异常增生的生物学原因。 方法 体外培养获得正常髋关节滑膜细胞系，借助荧光光淬灭恢复技术(FRAP)及激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)监测加入1.5 mg/ml(W/V)Ti合金、CoCr合金或UHMWPE 颗粒悬液后滑膜细胞胞间通讯的改变。 结果 经三种颗粒刺激后滑膜细胞胞间通讯均显著下降(P<0.01)，下降程度以UHMWPE颗粒组最明显，Ti合金颗粒组最小(P<0.01)，而且胞间通讯程度以FCs低于MCs(P<0.05)。 结论 除促成纤维性细胞因子的作用外，与松动有关的人工关节假体-骨界面纤维组织大量增生可能与磨损颗粒直接刺激下界面成纤维细胞胞间通讯减弱引起的活跃增殖有关。
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Effect of wear particles on cell-to-cell communication of synoviocyte system in vitro and its significance in aseptic loosening of prosthesis
CAI Xu,WANG Jifang,HU Yongcheng,et al.
General Hospital of Chinese People′s Liberation Army,Beijing 100853.
【Abstract】 Objective To study the biological reason of abnormal fiber proliferation at bone-implant interface of aseptically loosened prosthesis by observing cell-to-cell communication of synoviocyte system in vitro under the stimulation of wear particles. Methods The synoviocyte system of normal human hip joint was established in vitro and the change of cell-to-cell communication was monitored by fluorescence redistribution after photobleaching technique(FRAP) and confocal laser scanning microscope(CLSM) after Ti alloy,CoCr alloy or UHMWPE particles suspension(1.5 mg/ml, W/V) was added into the system. Results Cell-to-cell communication of synoviocyte system significantly decreased under the stimulation of three kinds of particles(P<0.01).he decreased degree was maximal in UHMWPE group and minimal in Ti alloy group(P<0.01).The cell-to-cell communication level of fibroblast-like-cells (FCs) was significantly lower than that of macrophage-like-cells (MCs) (P<0.05). Conclusions Besides the effect of cytokines promoting fiber proliferation,the great amount of fiberous granuloma at bone-implant interface which has relations with aseptic loosening may be caused by the decrease of cell-to-cell communication of fibroblast under direct stimulation of wear particles.
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【Key words】 Joint prosthesis Synovial membrane
缝隙连接介导的胞间通讯在细胞增殖和分化中起重要作用，通讯程度的减弱有可能使细胞获得一定的自立性而表现为活跃增殖[1]。由于无菌性松动人工关节骨-假体界面除存在以磨损颗粒和巨噬细胞(MΦ)为基础的慢性异物炎症反应外，还伴有大量纤维组织增生，该现象可由MΦ分泌的一些细胞因子(如PDGF )作用造成[2]，也可能与磨损颗粒直接刺激界面成纤维细胞有关[3]。本研究借助于荧光光淬灭恢复技术(fluorescence redistribution after photobleaching, FRAP)和激光扫描共聚焦显微镜(Confocal Laser scanning microscopy,CLSM)对人工关节材料颗粒刺激下体外培养滑膜细胞胞间通讯的情况进行了观察。
材料和方法
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一、细胞准备及实验分组
将传代滑膜细胞[4]种至96孔板中，于5%CO2孵箱中37℃培养24小时，细胞呈单层网格状贴壁生长后，按空白对照及分别滴加浓度为1.5mg/ml(W/V)的Ti合金(Ti-6Al-4 V，平均直径3.21 μm，美国Zimmer公司提供)、CoCr合金(平均直径5.38 μm，美国Zimmer公司提供)及UHMWPE(镜下测量直径12～200 μm，德国Hoechst公司提供)颗粒悬液10 μl，分为4组进行实验。
二、荧光负载
弃培养孔内培养液，HANK′s液清洗2次，加入10 μM CFDA(美国分子探针公司)工作液50 μl，置5% CO2孵箱37 ℃孵育10分钟。弃染色液，用HANK′s液洗去多余CFDA，然后加入培养液50 μl，于ACAS Ultima型CLSM(美国Meridian公司)上进行检测。
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三、实验步骤
1.CLSM参数设置：激光功率500 MW，光电倍增管强度24%，扫描强度30%，淬灭强度60%，淬灭脉冲时间200 ms，扫描次数5次，扫描时间2分钟，扫描步进1.0 μm，载物台移动速度20.00 mm/s，物镜10倍。
2.监测方法：CLSM监视器上选择荧光度强，细胞轮廓清晰，疏密分布适当，不同细胞形态并存的区域作为监测对象，按分组施加处理。在所选区域内根据荧光着色细胞的大小和形状分别选择小型细胞(macrophage-like cells,MCs)和大型细胞(fibroblast-like cells,FCs)，要求它们与周围其它细胞紧密连接，另选细胞蔟作为背景校正。加入颗粒悬液10 μl，10分钟后经过预扫描，用激光对所选细胞进行荧光淬灭，完成后监测4分钟，观察其荧光恢复情况，计算机自动采集数据。
四、数据处理
, http://www.100md.com
获得的荧光恢复速率经校正后，在两类细胞及各处理组间进行比较，用方差分析法作显著性检验。
结 果
代表胞间通讯程度的CFDA光淬灭恢复速率，经不同颗粒刺激后发生的改变有所不同(表1)。
表1 不同处理滑膜细胞内CFDA光淬灭恢复速率(
±s) 组 别MCs
FCs
合计
空白
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4.85±0.19
3.92±0.22
4.41±0.15
Ti合金颗粒
3.45±0.29
2.57±0.21
2.94±0.18
CoCr合金颗粒
3.05±0.35
1.61±0.17
2.19±0.21
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UHMWPE颗粒
1.12±0.22
1.39±0.27△
1.28±0.20
注:与其它各组比较P<0.01；△与空白和Ti合金颗粒组比较,P<0.01；**与同组MCs比较P<0.01
总体上，经三种人工关节材料颗粒刺激后滑膜细胞胞间通讯与正常细胞相比均显著下降(P<0.01)，下降程度由大到小依次为UHMWPE颗粒刺激组、CoCr合金颗粒刺激组和Ti合金颗粒刺激组(P<0.01)。
MCs胞间通讯各刺激组也均明显低于空白对照组(P<0.01)，其中UHMWPE 颗粒刺激组下降最明显(P<0.01)，而Ti和CoCr合金颗粒刺激组之间差异无显著性意义(P>0.05)。
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FCs胞间通讯各刺激组同样均显著低于空白对照组(P<0.01)，其中以Ti 合金颗粒刺激组通讯程度较高(P<0.01)，UHMWPE和CoCr合金颗粒刺激组之间差异无显著性意义(P>0.05)。
除UHMWPE颗粒刺激组内MCs与FCs胞间通讯程度无显著性差异(P>0.05)外，其它各组胞间通讯均以FCs低于MCs(P<0.05)。
讨 论
接触细胞间胞膜形成的通道结构-缝隙连接可通透Ca2+等许多离子及cAMP等小分子信号物质，从而能将一个细胞胞质内的信息传递到另一个细胞胞质中，这是目前普遍认为的组织或细胞群体内信号传播的主要通道，其介导的胞间通讯与细胞增殖调控密切相关[1]。另外，有学者发现许多肿瘤细胞缺少或无缝隙连接通讯，因而表现为无限制的生长[5]；创伤边缘细胞缝隙连接通讯明显下降，并且细胞与创伤距离的远近和缝隙连接通讯的强弱呈正相关[6]。提示生长活跃细胞缝隙连接的低功能状态可能有利于保持生长刺激信号分子在细胞内的浓度，从而促进细胞增殖。然而磨损颗粒对缝隙连接介导的胞间通讯的影响，目前国内外均未见报道。本实验以体外培养的正常髋关节滑膜细胞系为模型，对此进行了初步研究。
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本实验结果表明，体外培养的滑膜细胞受人工关节材料颗粒刺激后，其缝隙连接介导的胞间通讯水平均明显降低，并且因UHMWPE颗粒悬浮于细胞外液的液面，故该反应过程似乎不需要颗粒物质与细胞的直接接触而诱发。三种颗粒中以UHMWPE颗粒引起的胞间通讯水平下降最为显著，CoCr合金颗粒次之，Ti合金颗粒的作用虽相对较小但与CoCr合金颗粒的作用水平接近。而CoCr合金颗粒虽然在短时间内可能引起胞间通讯的减弱，有促进细胞增殖的趋势，但随着时间的延长，起主要作用的可能是Co离子的毒性作用[7]，因而导致细胞死亡；Ti 合金颗粒对缝隙连接的抑制作用虽相对较弱，但受其刺激的胞间通讯仍显著低于正常细胞(P<0.01)，因此滑膜细胞也表现出活跃生长的倾向。另外，虽然UHMWPE颗粒刺激组内MCs与FCs各自的胞间通讯能力下降水平差异无显著性意义(P>0.05)，但另两组内FCs胞间通讯程度均低于MCs(P<0.05)，提示磨损颗粒刺激下胞间通讯的抑制对成纤维细胞的增殖具有更为重要的意义。
缝隙连接是一个动态结构，其连接孔径受细胞膜电位和细胞内pH值调节，而且在调控细胞生长和分化中起重要作用的胞内第二信使Ca2+和cAMP水平的波动均可影响细胞的连接通讯功能。因此，可以认为，人工关节材料颗粒刺激滑膜细胞内[Ca2+]i的升高[4]是造成其缝隙连接胞间通讯功能抑制的原因之一。类似的情况是否存在于体内无菌性松动人工关节界面组织中，并成为磨损颗粒刺激下界膜中PDGF等细胞因子作用持久而有效以及界面炎性细胞丰富、纤维组织大量增生的更深层次原因尚待进一步研究证实。
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本课题受国家自然科学基金资助
参 考 文 献
1 孙大业. 胞间信号.见:孙大业,郭艳林，主编.细胞信号系统.北京:科学出版社,1993.16-43.
2 Jiranek WA,Machado M,Jasty M,et al.Production of cytokinesaround loosened cemented acetabular components:analysis with immunohistochemical techniques and insitu hydridization.J Bone Joint Surg(Am),1993,75:863-879.
3 Maloney WJ,Smith RL,Castro F,et al.Fibroblast response to metallic debris in vitro:enzyme induction,cell proliferation,and toxicity.J Bone Joint Surg(Am),1993,75:835-844.
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4 蔡,王继芳,胡永成,等.人工关节磨损颗粒激活骨-假体界面巨噬细胞生物学机制探讨.中华外科杂志,1999,37:53-56.
5 Mehta PP,Bertram JS,Loewenstein WR.Growth inhibition of transformed cells correlates with their junctional communication withnormal cells.Cell,1986,44:187-196.
6 林仲翔.间隙连接通讯-生长调控-癌变三者之间的关系.细胞生物学杂志,1988,10:111-115.
7 Rae T.A study on the effects of particulate metals of orthopaedic interest on murine macrophages in vitro.J Bone Joint Surg(Br),1975, 57:444-450.
(收稿：1998-04-07 修回：1999-03-31), 百拇医药