东莨菪碱对缺血性脑损伤的实验研究
作者:曹 权
单位:南京医科大学第一附属医院监护病房 邮政编码:210029
关键词:东莨菪碱 脑缺血 胞浆游离钙
江苏医药990715 摘要 为了探讨东莨菪碱在脑缺血和再灌流损伤中的保护作用,应用沙鼠建立脑缺血模型。缺血前15分钟腹腔注射药物,分别阻断双侧颈总动脉。于阻断颈动脉50分钟、再灌流10分钟、再灌流60分钟及120分钟,检测神经细胞胞浆游离钙的变化以及应用东莨菪碱后的影响。结果表明:(1)胞浆游离钙在脑缺血50分钟后大幅度升高,再灌流时再度升高,然后缓慢下降。(2)东莨菪碱可减缓胞浆游离钙升高,提示对脑缺血和再灌流损伤有治疗意义。
东莨菪碱用于脑复苏脑保护报道较少。本实验应用脑缺血动物模型,对脑缺血及再灌流期间胞浆游离钙的变化,以及东莨菪碱的影响进行了初步探讨。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、实验分组
采用蒙古沙土鼠(下称沙鼠)(由浙江省动物中心提供),月龄3个月左右。雄40只,雌32只。平均体重50g。随机将动物分为9组,每组8只。1组为正常对照组,其余8组按缺血50分钟、缺血50分钟再灌流10分钟、60分钟和120分钟分为4个时间组。每个时间组又分对照组(C),东莨菪碱组(S)。正常对照组仅做分离颈部血管手术。C,S组分别在缺血前15分钟生理盐水0.25ml、东莨菪碱0.45mg/kg腹腔注射。
东莨菪碱注射液由上海禾丰制药有限公司生产(批号940109)。
二、方法
1.动物模型选定及取材 沙鼠在氯胺酮(200mg/kg)腹腔麻醉下,暴露双侧颈总动脉。用银质GS-30血管夹,夹闭双侧颈总动脉,阻断血流50分钟,造成沙鼠前脑缺血。然后松开血管夹恢复血流,设计再灌流时间分别为10分钟、60分钟和120分钟,即制成沙鼠脑缺血及再灌流动物模型。各实验组结束后,立即将沙鼠在冰玻上断头取脑,在冰玻上分离前脑大脑皮层(厚约2mm),去除血管和硬脑膜。
, 百拇医药
2.神经细胞悬液制备 取大脑皮层组织约50mg在0℃的RPMI 1640细胞培养液中漂洗2次,再置于含0.1%胰蛋白酶的1640培养液2ml中,用眼科剪剪碎(大小约1mm3),恒温37℃,孵育过程中不断用吸管轻轻搅拌,吹打。20分钟后,加入10%小牛血清终止酶解反应。用200目(网距95μl)筛网过滤。滤出液以300转/分钟离心5分钟,去除上清液,即制得皮层细胞悬液。
3.神经细胞游离钙测定 将细胞悬液与3μmol/L(终浓度)的Fura-2/AM于25℃下孵育20分钟,同时吸管轻轻吹打,然后立即离心,以300转/分钟5分钟,去除上清。经洗涤后转移到测量皿中,立即采用AR-CM-MIC阳离子测定系统测定其荧光强度[1]。使用DM3000软件,计算细胞内〔Ca2+〕i(胞浆游离钙浓度)。
三、统计学处理 应用方差分析检查各时间组与正常对照组,以及同时间组内与基线水平各参数差异。数据输入计算机,以SAS软件统计。
, http://www.100md.com
结 果
正常对照组胞浆游离钙为131±19nmol/L。C组动物胞浆游离钙在缺血期显著增加,与正常对照组比P<0.01。而在再灌注期〔Ca2+〕i进一步增加,此后缓慢下降;各时间段东莨菪碱组与相应C组比较,〔Ca2+〕i均较低,均有显著性差异(P<0.01),见附表。 附表
脑缺血和再灌流后神经细胞胞浆游离钙的变化(±s,nmol/L) 组别
缺血50分钟
再 灌 流
10分钟
, 百拇医药
60分钟
120分钟
C组
195.2±27.5*
285.9±48.4*△
253.5±59.7*△
245.7±28.1*△
S组
166.3±28.5#
190.8±35.5
, http://www.100md.com
191.8±19.8#
191.2±20.0##
注:*与正常未缺血组比较,P<0.01;#与C组比较,P<0.01;##与C组比较,P<0.05;*△与缺血50分钟组比较,P<0.05讨 论
沙鼠作为脑缺血模型应用较多[2]。由于沙鼠脑底动脉环缺如,故阻断双侧颈总动脉后造成前脑缺血。本实验中,夹闭双侧颈总动脉后,沙鼠前肢活动消失,睫毛反射消失,眼珠固定。部分沙鼠于再灌流后出现角弓反张、抽搐,甚至呼吸停止等脑缺氧的临床表现,说明以沙鼠作为脑缺血模型较为可靠。本实验应用的结果与文献报道的情况相一致。
现在认为脑缺血和再灌流损伤可能和Ca2+超载以及迟发性血流减少有关。正常情况下,细胞膜上依赖ATP酶的钙泵向细胞外排Ca2+,以维持细胞内外浓度差。细胞缺氧时,ATP耗竭,Ca2+泵失活,Ca2+顺浓度差和电位差由细胞外流入细胞内;同时细胞内磷脂酶和脂肪酶活性增加,使线粒体和肌浆网贮存的Ca2+释放入胞浆,造成〔Ca2+〕i升高,细胞功能受损。〔Ca2+〕i增加可能通过下列途径加重脑损伤:(1)脑血管平滑肌细胞内Ca2+大量积聚,继而与肌钙蛋白不可逆结合,导致血管痉挛,从而产生复苏后延迟性低血流灌注。(2)胞浆〔Ca2+〕i增高可激活磷脂酶A2,分解膜磷脂,释放游离脂肪酸及花生四烯酸损伤细胞膜,甚至刺激脑组织生成超氧化物自由基,引起复苏后神经功能损伤。(3)细胞内Ca2+超负荷,一方面细胞依赖Ca2+的ATP酶活性增加,使ATP被分解耗竭;另一方面,线粒体内Ca2+过多,导致氧化磷酸化过程中电子传递脱偶联,影响ATP生成。此外〔Ca2+〕i升高,可致〔Mg2+〕i增高,细胞功能紊乱[3]。
, 百拇医药
东莨菪碱能扩张血管,增加低灌流期的脑血流量,从而减缓了ATP的耗竭速度[4]。此外,东莨菪碱的钙通道拮抗作用,可拮抗再灌流时的脑血管收缩及内皮肿胀,改善脑血流[5]。在缺血期,随着ATP的迅速耗竭,〔Ca2+〕i迅速升高。再灌流期,可能由于钙泵功能失活,细胞外的Ca2+顺着浓度差和电位差进入胞浆,同时细胞内磷脂酶和脂肪酶活性增加,促使线粒体和肌浆网贮存的Ca2+释放入胞浆,导致〔Ca2+〕i再度升高。东莨菪碱具有Ca2+通道阻滞作用,能阻断L型通道,抑制Ca2+跨膜慢向内流和抑制Ca2+从内质网释放,减缓胞浆〔Ca2+〕i的升高,减缓ATP的耗竭,从而预防和减轻神经细胞损伤。
参考文献
[1] Brakenhoff GJ, et al. J Microsc 1993;171:17.
[2] Araki T, et al. Br J Pharmacol 1992;107:437.
[3] Rajdev S, et al. J Neurophys 1995;74:942.
[4] 董先启.综合临床医学 1994;10(1):47.
[5] 江英,等.实用儿科临床杂志 1993;8(5):428.
(1998年5月29日收稿 同年10月14日修回), http://www.100md.com
单位:南京医科大学第一附属医院监护病房 邮政编码:210029
关键词:东莨菪碱 脑缺血 胞浆游离钙
江苏医药990715 摘要 为了探讨东莨菪碱在脑缺血和再灌流损伤中的保护作用,应用沙鼠建立脑缺血模型。缺血前15分钟腹腔注射药物,分别阻断双侧颈总动脉。于阻断颈动脉50分钟、再灌流10分钟、再灌流60分钟及120分钟,检测神经细胞胞浆游离钙的变化以及应用东莨菪碱后的影响。结果表明:(1)胞浆游离钙在脑缺血50分钟后大幅度升高,再灌流时再度升高,然后缓慢下降。(2)东莨菪碱可减缓胞浆游离钙升高,提示对脑缺血和再灌流损伤有治疗意义。
东莨菪碱用于脑复苏脑保护报道较少。本实验应用脑缺血动物模型,对脑缺血及再灌流期间胞浆游离钙的变化,以及东莨菪碱的影响进行了初步探讨。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、实验分组
采用蒙古沙土鼠(下称沙鼠)(由浙江省动物中心提供),月龄3个月左右。雄40只,雌32只。平均体重50g。随机将动物分为9组,每组8只。1组为正常对照组,其余8组按缺血50分钟、缺血50分钟再灌流10分钟、60分钟和120分钟分为4个时间组。每个时间组又分对照组(C),东莨菪碱组(S)。正常对照组仅做分离颈部血管手术。C,S组分别在缺血前15分钟生理盐水0.25ml、东莨菪碱0.45mg/kg腹腔注射。
东莨菪碱注射液由上海禾丰制药有限公司生产(批号940109)。
二、方法
1.动物模型选定及取材 沙鼠在氯胺酮(200mg/kg)腹腔麻醉下,暴露双侧颈总动脉。用银质GS-30血管夹,夹闭双侧颈总动脉,阻断血流50分钟,造成沙鼠前脑缺血。然后松开血管夹恢复血流,设计再灌流时间分别为10分钟、60分钟和120分钟,即制成沙鼠脑缺血及再灌流动物模型。各实验组结束后,立即将沙鼠在冰玻上断头取脑,在冰玻上分离前脑大脑皮层(厚约2mm),去除血管和硬脑膜。
, 百拇医药
2.神经细胞悬液制备 取大脑皮层组织约50mg在0℃的RPMI 1640细胞培养液中漂洗2次,再置于含0.1%胰蛋白酶的1640培养液2ml中,用眼科剪剪碎(大小约1mm3),恒温37℃,孵育过程中不断用吸管轻轻搅拌,吹打。20分钟后,加入10%小牛血清终止酶解反应。用200目(网距95μl)筛网过滤。滤出液以300转/分钟离心5分钟,去除上清液,即制得皮层细胞悬液。
3.神经细胞游离钙测定 将细胞悬液与3μmol/L(终浓度)的Fura-2/AM于25℃下孵育20分钟,同时吸管轻轻吹打,然后立即离心,以300转/分钟5分钟,去除上清。经洗涤后转移到测量皿中,立即采用AR-CM-MIC阳离子测定系统测定其荧光强度[1]。使用DM3000软件,计算细胞内〔Ca2+〕i(胞浆游离钙浓度)。
三、统计学处理 应用方差分析检查各时间组与正常对照组,以及同时间组内与基线水平各参数差异。数据输入计算机,以SAS软件统计。
, http://www.100md.com
结 果
正常对照组胞浆游离钙为131±19nmol/L。C组动物胞浆游离钙在缺血期显著增加,与正常对照组比P<0.01。而在再灌注期〔Ca2+〕i进一步增加,此后缓慢下降;各时间段东莨菪碱组与相应C组比较,〔Ca2+〕i均较低,均有显著性差异(P<0.01),见附表。 附表
脑缺血和再灌流后神经细胞胞浆游离钙的变化(±s,nmol/L) 组别
缺血50分钟
再 灌 流
10分钟
, 百拇医药
60分钟
120分钟
C组
195.2±27.5*
285.9±48.4*△
253.5±59.7*△
245.7±28.1*△
S组
166.3±28.5#
190.8±35.5
, http://www.100md.com
191.8±19.8#
191.2±20.0##
注:*与正常未缺血组比较,P<0.01;#与C组比较,P<0.01;##与C组比较,P<0.05;*△与缺血50分钟组比较,P<0.05讨 论
沙鼠作为脑缺血模型应用较多[2]。由于沙鼠脑底动脉环缺如,故阻断双侧颈总动脉后造成前脑缺血。本实验中,夹闭双侧颈总动脉后,沙鼠前肢活动消失,睫毛反射消失,眼珠固定。部分沙鼠于再灌流后出现角弓反张、抽搐,甚至呼吸停止等脑缺氧的临床表现,说明以沙鼠作为脑缺血模型较为可靠。本实验应用的结果与文献报道的情况相一致。
现在认为脑缺血和再灌流损伤可能和Ca2+超载以及迟发性血流减少有关。正常情况下,细胞膜上依赖ATP酶的钙泵向细胞外排Ca2+,以维持细胞内外浓度差。细胞缺氧时,ATP耗竭,Ca2+泵失活,Ca2+顺浓度差和电位差由细胞外流入细胞内;同时细胞内磷脂酶和脂肪酶活性增加,使线粒体和肌浆网贮存的Ca2+释放入胞浆,造成〔Ca2+〕i升高,细胞功能受损。〔Ca2+〕i增加可能通过下列途径加重脑损伤:(1)脑血管平滑肌细胞内Ca2+大量积聚,继而与肌钙蛋白不可逆结合,导致血管痉挛,从而产生复苏后延迟性低血流灌注。(2)胞浆〔Ca2+〕i增高可激活磷脂酶A2,分解膜磷脂,释放游离脂肪酸及花生四烯酸损伤细胞膜,甚至刺激脑组织生成超氧化物自由基,引起复苏后神经功能损伤。(3)细胞内Ca2+超负荷,一方面细胞依赖Ca2+的ATP酶活性增加,使ATP被分解耗竭;另一方面,线粒体内Ca2+过多,导致氧化磷酸化过程中电子传递脱偶联,影响ATP生成。此外〔Ca2+〕i升高,可致〔Mg2+〕i增高,细胞功能紊乱[3]。
, 百拇医药
东莨菪碱能扩张血管,增加低灌流期的脑血流量,从而减缓了ATP的耗竭速度[4]。此外,东莨菪碱的钙通道拮抗作用,可拮抗再灌流时的脑血管收缩及内皮肿胀,改善脑血流[5]。在缺血期,随着ATP的迅速耗竭,〔Ca2+〕i迅速升高。再灌流期,可能由于钙泵功能失活,细胞外的Ca2+顺着浓度差和电位差进入胞浆,同时细胞内磷脂酶和脂肪酶活性增加,促使线粒体和肌浆网贮存的Ca2+释放入胞浆,导致〔Ca2+〕i再度升高。东莨菪碱具有Ca2+通道阻滞作用,能阻断L型通道,抑制Ca2+跨膜慢向内流和抑制Ca2+从内质网释放,减缓胞浆〔Ca2+〕i的升高,减缓ATP的耗竭,从而预防和减轻神经细胞损伤。
参考文献
[1] Brakenhoff GJ, et al. J Microsc 1993;171:17.
[2] Araki T, et al. Br J Pharmacol 1992;107:437.
[3] Rajdev S, et al. J Neurophys 1995;74:942.
[4] 董先启.综合临床医学 1994;10(1):47.
[5] 江英,等.实用儿科临床杂志 1993;8(5):428.
(1998年5月29日收稿 同年10月14日修回), http://www.100md.com