金水宝片质量标准的研究
作者：许 妍* 梅玲华
单位：许 妍 江西省药品检验所 南昌 330046；梅玲华 江西金水宝制药有限公司
关键词：金水宝片；腺苷；反相高效液相色谱法；薄层色谱法
中草药990713 摘 要 用薄层色谱法鉴别金水宝片中氨基酸、甘露醇，用反相高效液相色谱法测定其腺苷含量；本品现行卫生部药品标准测定方法操作较繁，误差较大，采用本文方法后，定性、定量方法简便、灵敏、准确。表明建立的方法对控制本品质量更为完善。
金水宝片为发酵虫草菌粉经加工制成的片剂，临床上具有补肾保肺，秘精益气之功能。本品为单味制剂，其原料发酵虫草菌粉(Cs-4)与天然冬虫夏草有相似的化学成分。据研究，本品主要含有以下5种化学成分：①核苷类化合物和腺苷等；②甾醇类化合物；③糖及糖醇类化合物如甘露醇等；④氨基酸类化合物：游离氨基酸15种，水解氨基酸18种；⑤其它类化合物。药理实验表明[1]，腺苷为发酵虫草菌粉的活性成分之一，有明显的抗缺氧、降血脂等作用。
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1 仪器与试药
Waters 209 系列高效液相色谱仪，501泵，486紫外检测器，740积分仪。试剂均为分析纯，腺苷对照品由江西省药品检验所制备与鉴定，含量≥98%。甘露醇对照品为分析纯试剂，氨基酸对照品为生化标准制剂。金水宝片由江西金水宝制药有限公司提供。
2 鉴别试验
2.1 氨基酸：供试品溶液的制备：取本品，去薄膜衣，研细，取约1.2 g，加水10 mL，加热至沸，滤过即得。
对照品溶液的制备：取亮氨酸、丙氨酸和缬氨酸对照品，加水制成1 mL含亮氨酸和丙氨酸各1 mg、缬氨酸0.5 mg的混合溶液即得。
吸取上述供试品溶液3 μL对照品溶液2 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)为展开剂展开，取出晾干，喷以0.2%茚三酮乙醇试液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点(图1)。
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1.氨基酸对照品 2.供试品
图1 金水宝片中氨基酸的TLC图谱
2.2 甘露醇：供试品溶液的制备：取含量测定项下的供试品溶液15 mL，蒸干，加50%乙醇溶液5 mL使溶解，即得。
对照品溶液的制备：取甘露醇对照品，加50%乙醇溶液制成每1 mL含9 mg的溶液，即得。
吸取上述供试品溶液3 μL，对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异丙醇-乙酸乙酯-水(9∶6∶2)为展开剂展开，取出，晾干，喷以茴香醛试液，在130℃烘至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点(图2)。
1.甘露醇对照品 2.供试品
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图2 金水宝片中甘露醇的TLC图谱
3 金水宝片的含量测定
3.1 色谱条件与适应性实验：色谱柱：国产YWG-C18柱(4.6 mm×300 mm)；柱温：室温；流动相：2%四氢呋喃的磷酸缓冲溶液[0.066 mol/L KH2PO4-0.66 mol/L Na2HPO4(4∶6)]，流速1 mL/min，检测波长260 nm。理论板数按腺苷峰计算，应不低于3 000。
3.2 线性关系的考察：精密称取105℃减压干燥至恒重的腺苷对照品10 mg置100 mL量瓶中，用50%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。吸取2.5 mL于10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。吸取2.5、5、10、15、20 mL分别置25 mL量瓶中，分别以流动相稀释至刻度，摇匀。精密吸取各稀释液20 μL注入液相色谱仪，以峰面积Y为纵坐标，腺苷量X为横坐标，得到一近似通过原点的直线，计算得回归方程为：Y=3 394 334X-24 128，r=0.9996。结果表明，腺苷量在5×10-2～10×10-2 μg范围内与其峰面积呈现良好的线性关系。
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3.3 供试品溶液的制备：取本品10片，去薄膜衣精密称定，研细混匀，精密称取1.2 g置50 mL量瓶中，加50%乙醇溶液约30 mL，超声处理30 min，取出放冷，用50%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀。取25 mL置100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，静置，过滤，弃初滤液，取续滤液用0.45 μm的微孔滤膜过滤，收集滤液即得。
3.4 提取方法：提取溶剂及时间的考察，曾用过乙醇回流提取后再用硅胶柱和多种大孔树脂柱处理的方法、乙醇超声法、乙醇超声后再硅胶等柱除杂的方法，经液相色谱分析显示，图谱相近，因此采用乙醇超声液直接进样，方法简便，结果稳定。据文献[2，3]报道，核苷类化合物易溶于水和乙醇，难溶于其它有机溶剂；而水煎煮液杂质较多，采用50%乙醇溶液为溶剂提取效果最好。通过试验不同的超声时间，结果表明超声时间30 min最为合适。
3.5 精密度试验：精密吸取浓度为10μg/mL的腺苷对照品溶液20μL，重复进样6次，测定峰面积值，计算得到RSD=0.6%。
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3.6 重现性试验：取同一批号样品6份，分别依法提取制成供试品溶液，进样20μL测量峰面积并计算含量。结果表明，HPLC进样分析很好，RSD=0.9%。
3.7 回收率试验：取已知含量的样品6份，精密称定，分别加入腺苷对照品，依法制成供试品溶液，并测定其峰面积。结果为98.91%，RSD=1.3%。
3.8 样品的测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，照上述色谱条件测定(色谱图见图3)，按外标一点法计算腺苷含量，同时用薄层紫外分光光度测定法作对照试验，结果见表1。从表1可知，HPLC法和紫外分光光度法所测定腺苷含量比较无显著性差异。
1.腺苷对照品 2.供试品
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图3 金水宝片中腺苷的HPLC色谱图
氨基酸的TLC鉴别是对本品中含量较多的氨基酸的斑点进行了归属，使薄层鉴别的信息增加，更具鉴别意义。原部颁标准中规定不少于5个斑点，但由于有些斑点是不常见氨基酸，归属有一定困难，因此只对亮氨酸等3个斑点进行了斑点鉴别。
表1 对照试验结果(n=3) 批号
HPLC法
(毫克/片)
RSD(%)
紫外分光光
度法(毫克/片)
RSD(%)
, 百拇医药 971207
0.67
0.8
0.65
1.7
971208
0.59
0.6
0.55
1.9
971209
0.63
0.7
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0.60
2.0
原部颁标准用纸层析鉴别甘露醇，斑点易扩散，操作难以掌握，现改用薄层鉴别，斑点圆整、集中，效果更好。 参考文献
1 吕瑞绵，等.微生物学通报，1983，9(4)：166
2 章观德，等.药物分析杂志，1987，7(1)：6
3 林启寿.中草药成分化学.北京：科学出版社，1977：91
收稿日期：1998-12-28, http://www.100md.com(许 妍* 梅玲华)
单位：许 妍 江西省药品检验所 南昌 330046；梅玲华 江西金水宝制药有限公司
关键词：金水宝片；腺苷；反相高效液相色谱法；薄层色谱法
中草药990713 摘 要 用薄层色谱法鉴别金水宝片中氨基酸、甘露醇，用反相高效液相色谱法测定其腺苷含量；本品现行卫生部药品标准测定方法操作较繁，误差较大，采用本文方法后，定性、定量方法简便、灵敏、准确。表明建立的方法对控制本品质量更为完善。
金水宝片为发酵虫草菌粉经加工制成的片剂，临床上具有补肾保肺，秘精益气之功能。本品为单味制剂，其原料发酵虫草菌粉(Cs-4)与天然冬虫夏草有相似的化学成分。据研究，本品主要含有以下5种化学成分：①核苷类化合物和腺苷等；②甾醇类化合物；③糖及糖醇类化合物如甘露醇等；④氨基酸类化合物：游离氨基酸15种，水解氨基酸18种；⑤其它类化合物。药理实验表明[1]，腺苷为发酵虫草菌粉的活性成分之一，有明显的抗缺氧、降血脂等作用。
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1 仪器与试药
Waters 209 系列高效液相色谱仪，501泵，486紫外检测器，740积分仪。试剂均为分析纯，腺苷对照品由江西省药品检验所制备与鉴定，含量≥98%。甘露醇对照品为分析纯试剂，氨基酸对照品为生化标准制剂。金水宝片由江西金水宝制药有限公司提供。
2 鉴别试验
2.1 氨基酸：供试品溶液的制备：取本品，去薄膜衣，研细，取约1.2 g，加水10 mL，加热至沸，滤过即得。
对照品溶液的制备：取亮氨酸、丙氨酸和缬氨酸对照品，加水制成1 mL含亮氨酸和丙氨酸各1 mg、缬氨酸0.5 mg的混合溶液即得。
吸取上述供试品溶液3 μL对照品溶液2 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)为展开剂展开，取出晾干，喷以0.2%茚三酮乙醇试液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点(图1)。
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1.氨基酸对照品 2.供试品
图1 金水宝片中氨基酸的TLC图谱
2.2 甘露醇：供试品溶液的制备：取含量测定项下的供试品溶液15 mL，蒸干，加50%乙醇溶液5 mL使溶解，即得。
对照品溶液的制备：取甘露醇对照品，加50%乙醇溶液制成每1 mL含9 mg的溶液，即得。
吸取上述供试品溶液3 μL，对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异丙醇-乙酸乙酯-水(9∶6∶2)为展开剂展开，取出，晾干，喷以茴香醛试液，在130℃烘至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点(图2)。
1.甘露醇对照品 2.供试品
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图2 金水宝片中甘露醇的TLC图谱
3 金水宝片的含量测定
3.1 色谱条件与适应性实验：色谱柱：国产YWG-C18柱(4.6 mm×300 mm)；柱温：室温；流动相：2%四氢呋喃的磷酸缓冲溶液[0.066 mol/L KH2PO4-0.66 mol/L Na2HPO4(4∶6)]，流速1 mL/min，检测波长260 nm。理论板数按腺苷峰计算，应不低于3 000。
3.2 线性关系的考察：精密称取105℃减压干燥至恒重的腺苷对照品10 mg置100 mL量瓶中，用50%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。吸取2.5 mL于10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。吸取2.5、5、10、15、20 mL分别置25 mL量瓶中，分别以流动相稀释至刻度，摇匀。精密吸取各稀释液20 μL注入液相色谱仪，以峰面积Y为纵坐标，腺苷量X为横坐标，得到一近似通过原点的直线，计算得回归方程为：Y=3 394 334X-24 128，r=0.9996。结果表明，腺苷量在5×10-2～10×10-2 μg范围内与其峰面积呈现良好的线性关系。
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3.3 供试品溶液的制备：取本品10片，去薄膜衣精密称定，研细混匀，精密称取1.2 g置50 mL量瓶中，加50%乙醇溶液约30 mL，超声处理30 min，取出放冷，用50%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀。取25 mL置100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，静置，过滤，弃初滤液，取续滤液用0.45 μm的微孔滤膜过滤，收集滤液即得。
3.4 提取方法：提取溶剂及时间的考察，曾用过乙醇回流提取后再用硅胶柱和多种大孔树脂柱处理的方法、乙醇超声法、乙醇超声后再硅胶等柱除杂的方法，经液相色谱分析显示，图谱相近，因此采用乙醇超声液直接进样，方法简便，结果稳定。据文献[2，3]报道，核苷类化合物易溶于水和乙醇，难溶于其它有机溶剂；而水煎煮液杂质较多，采用50%乙醇溶液为溶剂提取效果最好。通过试验不同的超声时间，结果表明超声时间30 min最为合适。
3.5 精密度试验：精密吸取浓度为10μg/mL的腺苷对照品溶液20μL，重复进样6次，测定峰面积值，计算得到RSD=0.6%。
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3.6 重现性试验：取同一批号样品6份，分别依法提取制成供试品溶液，进样20μL测量峰面积并计算含量。结果表明，HPLC进样分析很好，RSD=0.9%。
3.7 回收率试验：取已知含量的样品6份，精密称定，分别加入腺苷对照品，依法制成供试品溶液，并测定其峰面积。结果为98.91%，RSD=1.3%。
3.8 样品的测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，照上述色谱条件测定(色谱图见图3)，按外标一点法计算腺苷含量，同时用薄层紫外分光光度测定法作对照试验，结果见表1。从表1可知，HPLC法和紫外分光光度法所测定腺苷含量比较无显著性差异。
1.腺苷对照品 2.供试品
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图3 金水宝片中腺苷的HPLC色谱图
氨基酸的TLC鉴别是对本品中含量较多的氨基酸的斑点进行了归属，使薄层鉴别的信息增加，更具鉴别意义。原部颁标准中规定不少于5个斑点，但由于有些斑点是不常见氨基酸，归属有一定困难，因此只对亮氨酸等3个斑点进行了斑点鉴别。
表1 对照试验结果(n=3) 批号
HPLC法
(毫克/片)
RSD(%)
紫外分光光
度法(毫克/片)
RSD(%)
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0.67
0.8
0.65
1.7
971208
0.59
0.6
0.55
1.9
971209
0.63
0.7
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0.60
2.0
原部颁标准用纸层析鉴别甘露醇，斑点易扩散，操作难以掌握，现改用薄层鉴别，斑点圆整、集中，效果更好。 参考文献
1 吕瑞绵，等.微生物学通报，1983，9(4)：166
2 章观德，等.药物分析杂志，1987，7(1)：6
3 林启寿.中草药成分化学.北京：科学出版社，1977：91
收稿日期：1998-12-28, http://www.100md.com(许 妍* 梅玲华)