肿瘤化疗药物对胃癌细胞Bcl-2，p53和Ki-67表达的影响
作者：吴金莺 周晓峰 姜文霞 王君利 杨 凡 蔡宣松 张志刚
单位：吴金莺 周晓峰 姜文霞 王君利 杨 凡 蔡宣松 上海铁道大学医学院附属甘泉医院肿瘤实验室 上海市 200065; 张志刚 上海医科大学病理教研室 上海市 200032
关键词：胃肿瘤；肿瘤细胞，培养的；Bcl-2基因；p53基因；Ki-67基因；基因表达
世界华人消化杂志990721
中国图书馆分类号 R735.2
Subject headings stomach neoplasms; tumor cell, cultured; Bcl-2 gene; p53 gene; Ki-67 gene; gene expression
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 取本院病理诊断为胃腺癌手术切除标本10例，体外分离细胞制成细胞悬液混合培养，培液用含200mL/L正常小牛血清的RPMI-1640溶液，37℃ 50mL/LCO2培养箱培养，实验取第4～5代培养细胞. 选择阿霉素(ADM)，长春新碱(VCR)，5-氟脲嘧啶(5-FU)，顺铂(DDP)，丝裂霉素(MMC). 常规培养胃癌贴壁细胞，设实验组，对照组和空白组，每组10孔细胞(n)，实验组加药后培养24h，然后与MTT反应4h.
1.2 方法 胃癌细胞Bcl-2，p53， Ki-67测定用免疫细胞化学染色法，按免疫细胞化学S-P法操作，滴加Bcl-2，p53和Ki-67抗体，DAB显色，并设置PBS代替一抗作为阴性对照. 经S-P法染色的胃癌细胞，置MIAS-300全自动图象分析仪40倍显微镜下，分别检测Bcl-2,p53，Ki-67染色阳性面积，按公式求出免疫组化阳性指数，即[阳性面积/测定细胞数]×阳性强度.
, 百拇医药
2 结果
体外培养的胃癌细胞为贴附性生长细胞，生长呈融合状态的胃癌细胞呈不规则多角形，核浆比例增大，呈重叠性生长. 胃癌细胞经抗癌药处理后，MTT法测得的各药物吸光度不尽相同，0.1×PPC药物浓度时胃癌细胞相对抑制率依次为ADM>5-FU>MMC>DDP>VCR，药物敏感细胞伴细胞皱缩，脱落，数量减少等改变. 胃癌细胞S-P染色结果为Bcl-2癌基因产物阳性，染色呈胞质着色，p53和Ki-67呈细胞核着色. 对照组细胞染色强度达“+++”，阳性细胞数>75%，实验组细胞染色强度呈不同程度减弱“++～±”，伴形态改变，其减弱程度与肿瘤细胞药物敏感性相关. 胃癌细胞实验组和对照组经自动图象分析定量显示，胃癌细胞染色强度分布与药敏结果较一致，与肉眼观察结果相符，经t检验表明，除外VCR实验组细胞Ki-67表达差异无显著性意义，其余各实验组细胞Bcl-2,p53，Ki-67表达差异与对照组比较均有显著性意义(P<0.01).
3 讨论
, 百拇医药
肿瘤的发生与癌基因的异常活化和表达有关，抗凋亡基因Bcl-2是抑制细胞凋亡的基因，在多细胞器官发育中具有保持细胞增殖和死亡之间的平衡，维持内环境稳定的作用. 分化成熟器官发生癌前期病损时. 染色体14/18易位引起Bcl-2基因过度表达，Bcl-2mRNA水平升高，提示细胞凋亡障碍，早期肿瘤形成. 本实验在体外药物浓度为0.1×PPC时进行药物敏感性分析和Bcl-2基因表达测定，结果发现对照组细胞有Bcl-2表达，实验组细胞因药物敏感性不同Bcl-2表达各异，但与药物敏感性有较好的一致性. 胃癌细胞图象定量分析显示，Bcl-2表达强度在药物敏感细胞和对照组细胞之间形成较大差异，差异具有显著性意义，实验结果与有关报道相符[1]. 提示某些抗肿瘤药物在逆转肿瘤细胞恶性表型同时，对一些突变的癌基因可能也起到选择性抑制和调控作用[2].
参与细胞凋亡调节的癌基因，除已知的Bcl-2基因外，还有p53抑癌基因. 本实验发现胃癌细胞有p53表达，各实验组经化疗药物处理后，p53表达强度的改变与药物敏感性关系类似于Bcl-2表达变化，二者有相似之处. 胃癌细胞图象定量分析结果显示：p53表达强度与对照组比较二者有显著性差异，表明抗肿瘤药物在选择性抑制Bcl-2基因表达同时，对p53基因也起到一定的调控作用，从而抑制肿瘤细胞增殖，共同诱导细胞凋亡以达到杀灭和清除体内癌细胞的目的.
, 百拇医药
我们实验表明，一些抗肿瘤药物在干扰胃癌细胞DNA复制和蛋白质合成的同时，对体内激活和过度表达的癌基因Bcl-2，p53，Ki-67也起到一定的调控和抑制表达作用. 提示Bcl-2，p53，Ki-67改变可作为体外肿瘤化疗药敏检测的辅助指标，或临床预后判断指标，便于临床医生从多指标分析系统中得到较为客观的判断和对预后的评估，达到逐步提高肿瘤化疗效果的目的.
通讯作者 吴金莺
4 参考文献
1 David MH, Mary Z, William H, Moon H, Stanley JK. Bcl-2 protein is topographically restricted in tissues characterized by apoptotic cell death. Proc Natl Acad Sci USA, 1991;88:6961-6965
2 Yamaki H, Sanae MM, Ariga I, Ariga H. Inhibition of C-myc gene expression in murine lymphoblastoma cells by geldamycin and herbimycin, antibiotics of benzoguinoid ansamycin group. J Antibiotics, 1989;42:604-610
收稿日期 1999-01-09 修回日期 1999-03-28, 百拇医药
单位：吴金莺 周晓峰 姜文霞 王君利 杨 凡 蔡宣松 上海铁道大学医学院附属甘泉医院肿瘤实验室 上海市 200065; 张志刚 上海医科大学病理教研室 上海市 200032
关键词：胃肿瘤；肿瘤细胞，培养的；Bcl-2基因；p53基因；Ki-67基因；基因表达
世界华人消化杂志990721
中国图书馆分类号 R735.2
Subject headings stomach neoplasms; tumor cell, cultured; Bcl-2 gene; p53 gene; Ki-67 gene; gene expression
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 取本院病理诊断为胃腺癌手术切除标本10例，体外分离细胞制成细胞悬液混合培养，培液用含200mL/L正常小牛血清的RPMI-1640溶液，37℃ 50mL/LCO2培养箱培养，实验取第4～5代培养细胞. 选择阿霉素(ADM)，长春新碱(VCR)，5-氟脲嘧啶(5-FU)，顺铂(DDP)，丝裂霉素(MMC). 常规培养胃癌贴壁细胞，设实验组，对照组和空白组，每组10孔细胞(n)，实验组加药后培养24h，然后与MTT反应4h.
1.2 方法 胃癌细胞Bcl-2，p53， Ki-67测定用免疫细胞化学染色法，按免疫细胞化学S-P法操作，滴加Bcl-2，p53和Ki-67抗体，DAB显色，并设置PBS代替一抗作为阴性对照. 经S-P法染色的胃癌细胞，置MIAS-300全自动图象分析仪40倍显微镜下，分别检测Bcl-2,p53，Ki-67染色阳性面积，按公式求出免疫组化阳性指数，即[阳性面积/测定细胞数]×阳性强度.
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2 结果
体外培养的胃癌细胞为贴附性生长细胞，生长呈融合状态的胃癌细胞呈不规则多角形，核浆比例增大，呈重叠性生长. 胃癌细胞经抗癌药处理后，MTT法测得的各药物吸光度不尽相同，0.1×PPC药物浓度时胃癌细胞相对抑制率依次为ADM>5-FU>MMC>DDP>VCR，药物敏感细胞伴细胞皱缩，脱落，数量减少等改变. 胃癌细胞S-P染色结果为Bcl-2癌基因产物阳性，染色呈胞质着色，p53和Ki-67呈细胞核着色. 对照组细胞染色强度达“+++”，阳性细胞数>75%，实验组细胞染色强度呈不同程度减弱“++～±”，伴形态改变，其减弱程度与肿瘤细胞药物敏感性相关. 胃癌细胞实验组和对照组经自动图象分析定量显示，胃癌细胞染色强度分布与药敏结果较一致，与肉眼观察结果相符，经t检验表明，除外VCR实验组细胞Ki-67表达差异无显著性意义，其余各实验组细胞Bcl-2,p53，Ki-67表达差异与对照组比较均有显著性意义(P<0.01).
3 讨论
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肿瘤的发生与癌基因的异常活化和表达有关，抗凋亡基因Bcl-2是抑制细胞凋亡的基因，在多细胞器官发育中具有保持细胞增殖和死亡之间的平衡，维持内环境稳定的作用. 分化成熟器官发生癌前期病损时. 染色体14/18易位引起Bcl-2基因过度表达，Bcl-2mRNA水平升高，提示细胞凋亡障碍，早期肿瘤形成. 本实验在体外药物浓度为0.1×PPC时进行药物敏感性分析和Bcl-2基因表达测定，结果发现对照组细胞有Bcl-2表达，实验组细胞因药物敏感性不同Bcl-2表达各异，但与药物敏感性有较好的一致性. 胃癌细胞图象定量分析显示，Bcl-2表达强度在药物敏感细胞和对照组细胞之间形成较大差异，差异具有显著性意义，实验结果与有关报道相符[1]. 提示某些抗肿瘤药物在逆转肿瘤细胞恶性表型同时，对一些突变的癌基因可能也起到选择性抑制和调控作用[2].
参与细胞凋亡调节的癌基因，除已知的Bcl-2基因外，还有p53抑癌基因. 本实验发现胃癌细胞有p53表达，各实验组经化疗药物处理后，p53表达强度的改变与药物敏感性关系类似于Bcl-2表达变化，二者有相似之处. 胃癌细胞图象定量分析结果显示：p53表达强度与对照组比较二者有显著性差异，表明抗肿瘤药物在选择性抑制Bcl-2基因表达同时，对p53基因也起到一定的调控作用，从而抑制肿瘤细胞增殖，共同诱导细胞凋亡以达到杀灭和清除体内癌细胞的目的.
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我们实验表明，一些抗肿瘤药物在干扰胃癌细胞DNA复制和蛋白质合成的同时，对体内激活和过度表达的癌基因Bcl-2，p53，Ki-67也起到一定的调控和抑制表达作用. 提示Bcl-2，p53，Ki-67改变可作为体外肿瘤化疗药敏检测的辅助指标，或临床预后判断指标，便于临床医生从多指标分析系统中得到较为客观的判断和对预后的评估，达到逐步提高肿瘤化疗效果的目的.
通讯作者 吴金莺
4 参考文献
1 David MH, Mary Z, William H, Moon H, Stanley JK. Bcl-2 protein is topographically restricted in tissues characterized by apoptotic cell death. Proc Natl Acad Sci USA, 1991;88:6961-6965
2 Yamaki H, Sanae MM, Ariga I, Ariga H. Inhibition of C-myc gene expression in murine lymphoblastoma cells by geldamycin and herbimycin, antibiotics of benzoguinoid ansamycin group. J Antibiotics, 1989;42:604-610
收稿日期 1999-01-09 修回日期 1999-03-28, 百拇医药