bcl-2基因产物在EB病毒相关性T细胞淋巴瘤中的表达
作者：石群立 于 镔 孙桂勤 陈亚莉
单位：南京军区南京总医院病理科 邮政编码：210002；于 镔 南京大学医学院九三级研究生
关键词：鼻咽部 淋巴瘤 bcl-2基因产物 EB病毒 免疫组织化学 多聚酶链反应
江苏医药990804 摘要 目的：探讨抗凋亡基因产物blc-2与鼻咽部T-细胞淋巴瘤发生与EB病毒感染的关系。方法：应用双温PCR技术和免疫组化(SP法)检测18例鼻咽T-细胞淋巴瘤组织中EB病毒DNA和抗凋亡基因产物bcl-2的表达。结果：15例EB病毒DNA阳性病例中7例出现blc-2表达(46.67%)，3例EB病毒DNA阴性病例中有1例bcl-2呈阳性反应(33.33%)。两组间无显著差异(P>0.05)。结论：鼻咽T细胞淋巴瘤发病可能与EBV感染有关。bcl-2基因产物在鼻咽T-细胞淋巴瘤中异常表达与EB病毒感染无明显关系。
, http://www.100md.com
Epstein-Barr病毒(简称EBV)存在于鼻咽癌中已是不容争辩的事实。近年的研究还发现，在何杰金病及非何杰金淋巴瘤中也存在EBV-DNA[1，2]。新近发现的癌基因bcl-2是一种凋亡抑制基因，已发现bcl-2基因异常与淋巴瘤的发生有关[3，4，5]。本文就bcl-2基因产物在鼻咽部T-细胞淋巴瘤中的表达及与EBV的关系进行初步探讨。
材料与方法
一、一般资料 收集我院鼻咽T细胞淋巴瘤18例，肿瘤组织经10%中性福尔马林液固定，常规脱水石蜡包埋，4μm切片，HE及网状纤维染色，光镜观察。同时进行LCA、L26、UCHL1、CK、EMA及bcl-2蛋白免疫组织化学标记(ABC或SP法)，以上试剂购自福州迈新公司及Dako公司。鼻咽部良性淋巴组织增生12例作为对照。
二、方法 30例行双温PCR法检测EBV-DNA。1.DNA模板制备取石蜡包埋组织，5～10μm切片10～30张，置于1.5mlEppendorf管中，加200μ1二甲苯，振荡后于50℃保温5～10min使石蜡溶化，离心收集沉淀，弃二甲苯；再以200μ1无水乙醇洗涤沉淀物，离心，弃乙醇，抽干样品，加入100μ1消化缓冲液(含蛋白酶K100mg/L,50mmol/L Tris-HCl pH8.5,1mmol/L EDTANa2， 0.5%Tweer20)55℃保温3h或37℃过夜，取出离心管于95℃10min灭活蛋白酶K，离心，取消化上清液2～4μ1，直接用于检测。2.引物选择根据EBV酶谱，EBV的Bam W和Bam M等区段与同属的疱疹病毒同源性较低并且相对保留，其中Bam W区段核酸序列有10次重复，使该区段的检出较单个拷贝的序列容易。因此，我们在Bam W区段选择一对引物，长度分别为20、21个碱基。由此引物扩增的PCR产物长度为121bp可确保阳性检出率(上海细胞生物学研究所合成)。3.反应条件选择PCR扩增反应在0.2ml的薄壁Eppendorf管中进行，50μ1反应液中含10×PCR缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,pH8.3,500mmol/L KCl,15 mmol/L MgC12，0.01% W/Vgelatin)5μ1,dNTPs各200μmol/L,一对引物各1.0μmol/L,模板DNA2～4μ1混匀后于94℃保温10min以杀灭可能影响PCR的杂酶，再加入1.5U Taq酶，根据引物的GC含量及退火温度，我们选择两种温度的RCR循环，条件为94℃lmin,68℃1min，共30个循环，最后一周期完成，于68℃保温7min，以使目的DNA充分延伸。(PCR-9600型扩增仪，美国Perkin-Elmer公司)4.扩增产物的鉴定取上述条件下进PCR扩增所得的产物10～15μ1于2%～3%Nusieve琼脂糖凝胶(预先加入溴乙锭)上电泳，然后在紫外检测器上观察，见附图。
, 百拇医药
附图示：PCR产物Nusieve(3:1)
琼脂糖凝胶电泳：1～4为阳性结果，5为阴性对照，6为阳性对照，7为PBR322/HaeⅢ。
三、统计学处理，采用χ2检验。
结 果
一、经病理组织学及免疫组化标记证实之鼻咽部T细胞淋巴瘤18例，良性淋巴组织增生12例，随机分成三组，进行双温PCR检测，检测中设一管以B95-8细胞株DNA作模板的阳性对照及另一管不加模板在试剂作为阴性对照。PCR反应产物的琼脂糖凝胶(预先加入溴乙锭)上电泳，紫外检测器上观察，检测发现，15例鼻咽T细胞淋巴瘤石蜡组织中检出EBV-DNA见附图。鼻咽良性淋巴增生1例检出EBV-DNA。经统计学处理，P<0.05。
二、15例EBV-DNA阳性病例中7例出现bcl-2表达(46.67%)，阳性表达表现为瘤细胞胞浆及胞核内出现棕黄色颗粒。3例EBV-DNA阴性病例中有1例呈bcl-2阳性反应(33.33%)，两组间无明显差异(P>0.05)，见附表。
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附表 bcl-2表达与EBV感染的关系 EBV-DNA
n
+
(%)
+
15
7
46.67*
-
3
1
33.33
*P>0.05
, 百拇医药
讨 论
EBV感染有明显的组织限制性倾向，它并不是一个过路病毒(Passenger virus)或是一个部位依赖现象(site dependent phenomenon)。根据近年来的研究表明[7～9]，T-NHL的EBV(62%)阳性率高于B-NHL(24%)，结外T-NHL(60～80%)高于结内T-NHL(35～50%)，鼻腔NHL(80～83%)高于口咽环NHL(50%)。
本文应用PCR技术检测鼻咽部T-细胞淋巴瘤组织中EBV感染情况，发现18例鼻咽T-细胞淋巴瘤中EBV-DNA的检出率为15例，占83.3%。与国外报道结果相似[2]。显示EBV-DNA的存在与恶性淋巴瘤是相伴随的。本组研究结果支持鼻咽T细胞淋巴瘤的发生可能与EBV感染有关。De Bruin等[7]应用多聚合酶链反应(PCR)、原位杂交和免疫组化方法研究了不同部位结外T细胞淋巴瘤的阳性率最高。Borisch等[8]报告致死性中线肉芽肿型T细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞淋巴结型T细胞淋巴瘤中存在EBV，其EBV是亚型2，均倾向EBV感染与鼻咽T细胞淋巴瘤发生有关。EBV的检测对FNHL已显示出其临床意义，近年国外报告外周T-NHL不管其恶性程度高低，若与EBV相关，则预后不佳 。EB病毒编码的功能性RNA(EBER)阴性或EBER阳性者，其7年生存率分别为31%和20%，中位生存期分别为21个月与8个月，有显著差别。
, 百拇医药
bcl-2基因是最先发现于淋巴造血系统肿瘤的一种癌基因[3，4]。以后陆续发现淋巴造血组织肿瘤外的恶性肿瘤：鼻咽癌、肺癌、前列腺癌等上皮源性肿瘤也有bcl-2基因产物的表达。本文研究结果显示18例鼻咽T细胞淋巴瘤组织中8例bcl-2阳性(44.44%)。bcl-2基因产物在鼻咽T细胞淋巴瘤中的异常高表达是否与EBV的感染有关，我们对两者间关系进行了分析，EBV阳性的鼻咽T细胞淋巴瘤中有7例表达bcl-2蛋白，EBV阴性的3例中有1例表达bcl-2蛋白，研究结果表明两组间无明显差异(P>0.05)。说明bcl-2表达与EBV的感染没有明显相关性，EBV的致病作用可能不是通过诱导bcl-2蛋白的表达实现的。Henderson等研究EBV对B淋巴细胞的诱导作用时发现EBV潜在基因编码的产物LMP-1可上调bcl-2蛋白的表达[10]。因此，可见EBV在鼻咽T-细胞淋巴瘤发生过程中的作用及机制还需进行更为深入的研究。
参考文献
, 百拇医药
[1] Richinon AB, et al. Cancer Surv 1992;13:53.
[2] 石群立，等.南京大学学报 1995；31：134.
[3] Gauland P,et al. Am J Pathol 1991;140:1089.
[4] Reid AH, et al. Am J Pathol 1993 ;142:395.
[5] 石群立，等.中华病理学杂志 1996；25(3)：171.
[6] Jones MD, Gtiffin BE. Nucleic Acids Res 1983;11:3919.
[7] De Burin PC,et al.Blood 1994;83:1612.
[8] Borisch B,et al. Blood 1993;82:1612.
[9] Tomita Y,et al. Lab Invetigation 1995;73:190.
[10] Henderson S, et al. Cell 1991,65:1170.
(1998年9月10日收稿 1999年1月25日修回), 百拇医药
单位：南京军区南京总医院病理科 邮政编码：210002；于 镔 南京大学医学院九三级研究生
关键词：鼻咽部 淋巴瘤 bcl-2基因产物 EB病毒 免疫组织化学 多聚酶链反应
江苏医药990804 摘要 目的：探讨抗凋亡基因产物blc-2与鼻咽部T-细胞淋巴瘤发生与EB病毒感染的关系。方法：应用双温PCR技术和免疫组化(SP法)检测18例鼻咽T-细胞淋巴瘤组织中EB病毒DNA和抗凋亡基因产物bcl-2的表达。结果：15例EB病毒DNA阳性病例中7例出现blc-2表达(46.67%)，3例EB病毒DNA阴性病例中有1例bcl-2呈阳性反应(33.33%)。两组间无显著差异(P>0.05)。结论：鼻咽T细胞淋巴瘤发病可能与EBV感染有关。bcl-2基因产物在鼻咽T-细胞淋巴瘤中异常表达与EB病毒感染无明显关系。
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Epstein-Barr病毒(简称EBV)存在于鼻咽癌中已是不容争辩的事实。近年的研究还发现，在何杰金病及非何杰金淋巴瘤中也存在EBV-DNA[1，2]。新近发现的癌基因bcl-2是一种凋亡抑制基因，已发现bcl-2基因异常与淋巴瘤的发生有关[3，4，5]。本文就bcl-2基因产物在鼻咽部T-细胞淋巴瘤中的表达及与EBV的关系进行初步探讨。
材料与方法
一、一般资料 收集我院鼻咽T细胞淋巴瘤18例，肿瘤组织经10%中性福尔马林液固定，常规脱水石蜡包埋，4μm切片，HE及网状纤维染色，光镜观察。同时进行LCA、L26、UCHL1、CK、EMA及bcl-2蛋白免疫组织化学标记(ABC或SP法)，以上试剂购自福州迈新公司及Dako公司。鼻咽部良性淋巴组织增生12例作为对照。
二、方法 30例行双温PCR法检测EBV-DNA。1.DNA模板制备取石蜡包埋组织，5～10μm切片10～30张，置于1.5mlEppendorf管中，加200μ1二甲苯，振荡后于50℃保温5～10min使石蜡溶化，离心收集沉淀，弃二甲苯；再以200μ1无水乙醇洗涤沉淀物，离心，弃乙醇，抽干样品，加入100μ1消化缓冲液(含蛋白酶K100mg/L,50mmol/L Tris-HCl pH8.5,1mmol/L EDTANa2， 0.5%Tweer20)55℃保温3h或37℃过夜，取出离心管于95℃10min灭活蛋白酶K，离心，取消化上清液2～4μ1，直接用于检测。2.引物选择根据EBV酶谱，EBV的Bam W和Bam M等区段与同属的疱疹病毒同源性较低并且相对保留，其中Bam W区段核酸序列有10次重复，使该区段的检出较单个拷贝的序列容易。因此，我们在Bam W区段选择一对引物，长度分别为20、21个碱基。由此引物扩增的PCR产物长度为121bp可确保阳性检出率(上海细胞生物学研究所合成)。3.反应条件选择PCR扩增反应在0.2ml的薄壁Eppendorf管中进行，50μ1反应液中含10×PCR缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,pH8.3,500mmol/L KCl,15 mmol/L MgC12，0.01% W/Vgelatin)5μ1,dNTPs各200μmol/L,一对引物各1.0μmol/L,模板DNA2～4μ1混匀后于94℃保温10min以杀灭可能影响PCR的杂酶，再加入1.5U Taq酶，根据引物的GC含量及退火温度，我们选择两种温度的RCR循环，条件为94℃lmin,68℃1min，共30个循环，最后一周期完成，于68℃保温7min，以使目的DNA充分延伸。(PCR-9600型扩增仪，美国Perkin-Elmer公司)4.扩增产物的鉴定取上述条件下进PCR扩增所得的产物10～15μ1于2%～3%Nusieve琼脂糖凝胶(预先加入溴乙锭)上电泳，然后在紫外检测器上观察，见附图。
, 百拇医药
附图示：PCR产物Nusieve(3:1)
琼脂糖凝胶电泳：1～4为阳性结果，5为阴性对照，6为阳性对照，7为PBR322/HaeⅢ。
三、统计学处理，采用χ2检验。
结 果
一、经病理组织学及免疫组化标记证实之鼻咽部T细胞淋巴瘤18例，良性淋巴组织增生12例，随机分成三组，进行双温PCR检测，检测中设一管以B95-8细胞株DNA作模板的阳性对照及另一管不加模板在试剂作为阴性对照。PCR反应产物的琼脂糖凝胶(预先加入溴乙锭)上电泳，紫外检测器上观察，检测发现，15例鼻咽T细胞淋巴瘤石蜡组织中检出EBV-DNA见附图。鼻咽良性淋巴增生1例检出EBV-DNA。经统计学处理，P<0.05。
二、15例EBV-DNA阳性病例中7例出现bcl-2表达(46.67%)，阳性表达表现为瘤细胞胞浆及胞核内出现棕黄色颗粒。3例EBV-DNA阴性病例中有1例呈bcl-2阳性反应(33.33%)，两组间无明显差异(P>0.05)，见附表。
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附表 bcl-2表达与EBV感染的关系 EBV-DNA
n
+
(%)
+
15
7
46.67*
-
3
1
33.33
*P>0.05
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讨 论
EBV感染有明显的组织限制性倾向，它并不是一个过路病毒(Passenger virus)或是一个部位依赖现象(site dependent phenomenon)。根据近年来的研究表明[7～9]，T-NHL的EBV(62%)阳性率高于B-NHL(24%)，结外T-NHL(60～80%)高于结内T-NHL(35～50%)，鼻腔NHL(80～83%)高于口咽环NHL(50%)。
本文应用PCR技术检测鼻咽部T-细胞淋巴瘤组织中EBV感染情况，发现18例鼻咽T-细胞淋巴瘤中EBV-DNA的检出率为15例，占83.3%。与国外报道结果相似[2]。显示EBV-DNA的存在与恶性淋巴瘤是相伴随的。本组研究结果支持鼻咽T细胞淋巴瘤的发生可能与EBV感染有关。De Bruin等[7]应用多聚合酶链反应(PCR)、原位杂交和免疫组化方法研究了不同部位结外T细胞淋巴瘤的阳性率最高。Borisch等[8]报告致死性中线肉芽肿型T细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞淋巴结型T细胞淋巴瘤中存在EBV，其EBV是亚型2，均倾向EBV感染与鼻咽T细胞淋巴瘤发生有关。EBV的检测对FNHL已显示出其临床意义，近年国外报告外周T-NHL不管其恶性程度高低，若与EBV相关，则预后不佳 。EB病毒编码的功能性RNA(EBER)阴性或EBER阳性者，其7年生存率分别为31%和20%，中位生存期分别为21个月与8个月，有显著差别。
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bcl-2基因是最先发现于淋巴造血系统肿瘤的一种癌基因[3，4]。以后陆续发现淋巴造血组织肿瘤外的恶性肿瘤：鼻咽癌、肺癌、前列腺癌等上皮源性肿瘤也有bcl-2基因产物的表达。本文研究结果显示18例鼻咽T细胞淋巴瘤组织中8例bcl-2阳性(44.44%)。bcl-2基因产物在鼻咽T细胞淋巴瘤中的异常高表达是否与EBV的感染有关，我们对两者间关系进行了分析，EBV阳性的鼻咽T细胞淋巴瘤中有7例表达bcl-2蛋白，EBV阴性的3例中有1例表达bcl-2蛋白，研究结果表明两组间无明显差异(P>0.05)。说明bcl-2表达与EBV的感染没有明显相关性，EBV的致病作用可能不是通过诱导bcl-2蛋白的表达实现的。Henderson等研究EBV对B淋巴细胞的诱导作用时发现EBV潜在基因编码的产物LMP-1可上调bcl-2蛋白的表达[10]。因此，可见EBV在鼻咽T-细胞淋巴瘤发生过程中的作用及机制还需进行更为深入的研究。
参考文献
, 百拇医药
[1] Richinon AB, et al. Cancer Surv 1992;13:53.
[2] 石群立，等.南京大学学报 1995；31：134.
[3] Gauland P,et al. Am J Pathol 1991;140:1089.
[4] Reid AH, et al. Am J Pathol 1993 ;142:395.
[5] 石群立，等.中华病理学杂志 1996；25(3)：171.
[6] Jones MD, Gtiffin BE. Nucleic Acids Res 1983;11:3919.
[7] De Burin PC,et al.Blood 1994;83:1612.
[8] Borisch B,et al. Blood 1993;82:1612.
[9] Tomita Y,et al. Lab Invetigation 1995;73:190.
[10] Henderson S, et al. Cell 1991,65:1170.
(1998年9月10日收稿 1999年1月25日修回), 百拇医药