复方半枝莲体外抗癌作用及其机理的实验研究*
作者：叶 健 徐锡坤 周建伟
单位：南京医科大学公共卫生学院(210009)
关键词：
江苏医药990826 复方半枝莲由清热解毒与扶正祛邪中药半枝莲、黄芪、女贞子、蜂房等组成。为研究其抗癌作用，并探讨其机理，我们进行了下列实验研究，报告如下。
材料与方法
一、肿瘤细胞及培养 人肝癌细胞SMMC-7721购自中科院上海细胞研究所，在含10%(体积分数)灭活小牛血清，10万U/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中，置37℃，含0.05%的二氧化碳的孵箱中传代培养。
二、药物 复方半枝莲乙醇提取液由江苏省中西医结合研究所制备，所得提取液含生药1.5g/ml，以上述培养液配成所需浓度，进行细胞培养。
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三、试剂及仪器 台盼蓝：英国进口分装，吖啶橙(AO)、溴乙啶(EB)：Fluco进口分装；倒置显微镜：O1ympus,Japan;荧光显微镜：O1ympus,Japan；流式细胞仪FACSCalibur：美国BD公司产品。
四、方法 1.细胞增殖抑制试验：取对数生长期细胞，配制成8×104个/ml细胞悬液，分别接种于无菌24孔培养板，每孔1ml，24小时后换成含药培养液。药物分成5个不同浓度，每浓度设三个平行孔，对照组加入同样量的培养液，药物作用第三天换新鲜培养液，药物浓度同前。分别在药物作用24，48，72，96，120小时，以台盼蓝拒染法计数活细胞数，细胞增殖抑制率=(1―实验组活细胞数/对照组活细胞数)×100%。2.形态学观察：(1)倒置显微镜观察：在作细胞增殖抑制实验的同时，倒置显微镜下观察细胞的生长情况。(2)AO/EB双染荧光法：参照汪承亚等的方法。(3)细胞周期分析(流式细胞仪)：15mW氩离子激光激发波长488nM，对样品进行单参数DNA含量分析。用Cellqust软件程序自动获取2×104个/样品，用ModFitLT软件程序分析细胞DNA含量。
, 百拇医药
结 果
一、复方半枝莲乙醇提取液对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖有明显的抑制作用，并存在剂量和时间的依赖关系。
二、形态学观察：1.倒置显微镜观察：人肝癌细胞在16mg/ml复方半枝莲乙醇提取液作用下，与对照组比较，24小时细胞分裂相减少，细胞轮廓明显等轻微改变：48小时出现胞体回缩，细胞间隙增大，细胞轮廓非常明显，胞质粗糙，内有颗粒堆积，部分细胞漂浮于培养液中；72小时大部分细胞脱壁且溶解崩溃。2.荧光显微镜观察：16mg/ml复方半枝莲乙醇提取液作用48小时后，AO/EB双染，荧光显微镜下观察，正常细胞呈黄绿色，密度均匀，呈结构样特征；坏死细胞发橙红色荧光，密度均匀，坏死率为9.5%；凋亡细胞，核偏于一侧，呈新月状分布或碎裂，荧光强，早期凋亡细胞呈绿色，晚期则呈橙红色，凋亡率为5.5%。3.流式细胞仪分析：细胞周期各相细胞百分比，对照组G0―G1期为71.76%，S期为28.24%，G2-M期为0%。复方半枝莲16mg/ml作用48小时后，G0―G1期为88.86%，S期9.98%，G2―M期为1.32%。药物作用组与对照组比较G0―G1期细胞百分比升高(卡方检验P<0.05)，S期降低(卡方检验P<0.05)。
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讨 论
本复方中主药半枝莲为我国传统的抗肿瘤中草药，有文献报道，半枝莲具有抗诱变作用。在体外实验中，半枝莲提取物对多种肿瘤细胞如S180、W256、艾氏腹水癌等具有生长抑制作用。在临床上，半枝莲可治疗肝癌、肺癌、乳腺癌、绒毛膜癌等，其中对肝癌患者的治疗效果最好。半枝莲含有大量的生物碱和黄酮，其中的抗肿瘤成分E-1-(4羟基苯基)-丁-1-烯-3-酮，体外实验对K562白血病细胞具有强细胞毒性。黄芪、女贞子均为补益类中药，有实验证明黄芪多糖具有明显的抗肿瘤效应，其机理可能与其具有增加机体免疫功能的作用有关。
本实验结果显示，复方半枝莲乙醇提取液对人肝癌SMMC-7221细胞有明显的抑制作用，且随作用剂量增高和作用时间的延长，抑制率提高。形态观察发现细胞先出现生长停滞，继而出现死亡。细胞死亡有两种方式，即凋亡和坏死。形态学是鉴别两者的最可靠方法。本试验采用吖啶橙(AO)/溴乙锭(EB)双染荧光法检测细胞凋亡，因为AO能进入胞膜完整的细胞，因此正常细胞和早期凋亡细胞均可被AO染色，核发出明亮的黄绿色荧光，但两者的形态特征迥异。EB只能渗入膜受损的细胞，与DNA结合发橙红色荧光。根据EB的染色情况可以区别膜完整的早期细胞和膜破损的晚期细胞。试验发现SMMC―7721细胞在16mg/ml复方半枝莲48小时作用下坏死与凋亡并存，分别为9.5%和5.5%。流式细胞仪检测细胞周期，对照组G0-G1期为71.76%，S期为28.24%，G2-M期为0%。复方半枝莲16mg/ml作用48小时后，G0―G1期为88.86%，S期为9.98%，G2-M期为1.32%。用药后G0-G1期细胞百分比增加，S期细胞百分比减少，推测复方半枝莲阻滞G0-G1期细胞进展。抑制S期细胞DNA的合成，影响其增殖，继而对肿瘤细胞产生毒性作用致坏死或诱导凋亡。
*本课题为江苏省自然科学基金资助项目, 百拇医药
单位：南京医科大学公共卫生学院(210009)
关键词：
江苏医药990826 复方半枝莲由清热解毒与扶正祛邪中药半枝莲、黄芪、女贞子、蜂房等组成。为研究其抗癌作用，并探讨其机理，我们进行了下列实验研究，报告如下。
材料与方法
一、肿瘤细胞及培养 人肝癌细胞SMMC-7721购自中科院上海细胞研究所，在含10%(体积分数)灭活小牛血清，10万U/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中，置37℃，含0.05%的二氧化碳的孵箱中传代培养。
二、药物 复方半枝莲乙醇提取液由江苏省中西医结合研究所制备，所得提取液含生药1.5g/ml，以上述培养液配成所需浓度，进行细胞培养。
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三、试剂及仪器 台盼蓝：英国进口分装，吖啶橙(AO)、溴乙啶(EB)：Fluco进口分装；倒置显微镜：O1ympus,Japan;荧光显微镜：O1ympus,Japan；流式细胞仪FACSCalibur：美国BD公司产品。
四、方法 1.细胞增殖抑制试验：取对数生长期细胞，配制成8×104个/ml细胞悬液，分别接种于无菌24孔培养板，每孔1ml，24小时后换成含药培养液。药物分成5个不同浓度，每浓度设三个平行孔，对照组加入同样量的培养液，药物作用第三天换新鲜培养液，药物浓度同前。分别在药物作用24，48，72，96，120小时，以台盼蓝拒染法计数活细胞数，细胞增殖抑制率=(1―实验组活细胞数/对照组活细胞数)×100%。2.形态学观察：(1)倒置显微镜观察：在作细胞增殖抑制实验的同时，倒置显微镜下观察细胞的生长情况。(2)AO/EB双染荧光法：参照汪承亚等的方法。(3)细胞周期分析(流式细胞仪)：15mW氩离子激光激发波长488nM，对样品进行单参数DNA含量分析。用Cellqust软件程序自动获取2×104个/样品，用ModFitLT软件程序分析细胞DNA含量。
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结 果
一、复方半枝莲乙醇提取液对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖有明显的抑制作用，并存在剂量和时间的依赖关系。
二、形态学观察：1.倒置显微镜观察：人肝癌细胞在16mg/ml复方半枝莲乙醇提取液作用下，与对照组比较，24小时细胞分裂相减少，细胞轮廓明显等轻微改变：48小时出现胞体回缩，细胞间隙增大，细胞轮廓非常明显，胞质粗糙，内有颗粒堆积，部分细胞漂浮于培养液中；72小时大部分细胞脱壁且溶解崩溃。2.荧光显微镜观察：16mg/ml复方半枝莲乙醇提取液作用48小时后，AO/EB双染，荧光显微镜下观察，正常细胞呈黄绿色，密度均匀，呈结构样特征；坏死细胞发橙红色荧光，密度均匀，坏死率为9.5%；凋亡细胞，核偏于一侧，呈新月状分布或碎裂，荧光强，早期凋亡细胞呈绿色，晚期则呈橙红色，凋亡率为5.5%。3.流式细胞仪分析：细胞周期各相细胞百分比，对照组G0―G1期为71.76%，S期为28.24%，G2-M期为0%。复方半枝莲16mg/ml作用48小时后，G0―G1期为88.86%，S期9.98%，G2―M期为1.32%。药物作用组与对照组比较G0―G1期细胞百分比升高(卡方检验P<0.05)，S期降低(卡方检验P<0.05)。
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讨 论
本复方中主药半枝莲为我国传统的抗肿瘤中草药，有文献报道，半枝莲具有抗诱变作用。在体外实验中，半枝莲提取物对多种肿瘤细胞如S180、W256、艾氏腹水癌等具有生长抑制作用。在临床上，半枝莲可治疗肝癌、肺癌、乳腺癌、绒毛膜癌等，其中对肝癌患者的治疗效果最好。半枝莲含有大量的生物碱和黄酮，其中的抗肿瘤成分E-1-(4羟基苯基)-丁-1-烯-3-酮，体外实验对K562白血病细胞具有强细胞毒性。黄芪、女贞子均为补益类中药，有实验证明黄芪多糖具有明显的抗肿瘤效应，其机理可能与其具有增加机体免疫功能的作用有关。
本实验结果显示，复方半枝莲乙醇提取液对人肝癌SMMC-7221细胞有明显的抑制作用，且随作用剂量增高和作用时间的延长，抑制率提高。形态观察发现细胞先出现生长停滞，继而出现死亡。细胞死亡有两种方式，即凋亡和坏死。形态学是鉴别两者的最可靠方法。本试验采用吖啶橙(AO)/溴乙锭(EB)双染荧光法检测细胞凋亡，因为AO能进入胞膜完整的细胞，因此正常细胞和早期凋亡细胞均可被AO染色，核发出明亮的黄绿色荧光，但两者的形态特征迥异。EB只能渗入膜受损的细胞，与DNA结合发橙红色荧光。根据EB的染色情况可以区别膜完整的早期细胞和膜破损的晚期细胞。试验发现SMMC―7721细胞在16mg/ml复方半枝莲48小时作用下坏死与凋亡并存，分别为9.5%和5.5%。流式细胞仪检测细胞周期，对照组G0-G1期为71.76%，S期为28.24%，G2-M期为0%。复方半枝莲16mg/ml作用48小时后，G0―G1期为88.86%，S期为9.98%，G2-M期为1.32%。用药后G0-G1期细胞百分比增加，S期细胞百分比减少，推测复方半枝莲阻滞G0-G1期细胞进展。抑制S期细胞DNA的合成，影响其增殖，继而对肿瘤细胞产生毒性作用致坏死或诱导凋亡。
*本课题为江苏省自然科学基金资助项目, 百拇医药
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