哮喘对豚鼠肺表面活性物质的影响
作者：毋永正 方凤 方超平
单位：200433上海，第二军医大学长海医院儿科实验室
关键词：
中华医学杂志990828 肺表面活性物质(pulmonary surfactant，PS)对于肺发挥正常呼吸功能有着重要的生理作用。已证实哮喘发作可能也与PS相对不足有关[1]，为此，我们从动物支气管肺灌洗液(BAL)等方面论证了PS与哮喘的关系，以探讨PS在哮喘发病机制中的作用。
一、材料和方法
1.动物分组：雄性豚鼠60只(250～500 g)，用随机数字表法将其随机分为对照组和哮喘组，每组30只。每组再分肺病理形态观察组、BAL中磷脂和蛋白定量测定组、BAL表面活性测定组及支气管肺灌流组，每个亚组6只豚鼠。
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2.模型建立：以质量浓度为1 kg/L卵蛋白溶液按100 mg/kg腹腔注射致敏，3周后以质量浓度为0.1 kg/L卵蛋白溶液雾化吸入，豚鼠出现气促、口唇紫绀、呼吸困难甚至抽搐等症状。
3.BAL中磷脂、蛋白的分离和测定：麻醉后豚鼠，行气管插管，再以致死剂量戊巴比妥钠颈动脉注射处死，然后按10 ml/g湿肺生理盐水以20 cm H2O压力缓慢流入肺部，保留3分钟后使其尽可能流出，反复5次，收集灌洗液，离心(2500 r/min，5分钟)，吸取上清液作为BAL。按文献[2]的方法提取出BAL中的磷脂，按文献[3]方法提取饱和卵磷脂，定量测定按Bartlett[4]的方法；BAL中蛋白的测定按Lowry等[5]方法。
4.BAL表面张力的测定：采用仪器型号为MTP-2膜天平，液槽内加入蒸馏水450 ml，缓缓滴入BAL 20 ml，吸附平衡20分钟后开动滑尺，压缩单分子层表面膜的面积，表面张力随PS表面膜面积的变化而相应变化。将液面表面张力的变化通过型号为LE3-A的函数记录仪描记下来。根据最大表面张力(γmax)和最小表面张力(γmin)计算出恢复系数(RI)和稳定系数(SI)等指标。RI=(Δγ′+γmin)/ γmin ；SI=2(γmax-γmin)/(γmax+γmin)。式中Δγ′为表面积压缩至25%时的表面张力。
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5.离体支气管肺灌流模型的建立：离体支气管肺灌流是通过观察灌流液流出速率的变化，借以测定末梢细支气管通畅情况的一种方法，具体操作见文献[6]。
6.肺组织光镜标本的制备：处死豚鼠后取出肺脏，进行大体病理观察，再用体积分数为10%的甲醛浸泡固定，常规石蜡切片，HE染色。
7.统计学方法：应用SPLM统计软件进行数据分析，数据用
±s表示，差异显著性检验采用t检验，对支气管肺泡灌洗液中PS表面活性与总磷脂、饱和磷脂及总蛋白作多元相关分析。
二、结果
1.哮喘时肺的形态学变化：致敏豚鼠吸入雾化质量浓度为1 kg/L的卵蛋白溶液后1分钟内均出现呼吸急促、口周紫绀、呼吸困难甚至抽搐、死亡。大体标本可见肺气肿，表面有点状或小片状新鲜出血点。显微镜下支气管痉挛，管腔中有粘液栓形成，肺间质毛细血管明显扩张充血，支气管及毛细血管周围大量炎细胞浸润。
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2.BAL中磷脂和蛋白含量的变化：致敏豚鼠诱发哮喘后，其灌洗液中总磷脂和饱和卵磷脂的含量分别为(65±10)g/L和(48±11)g/L，对照组分别为(66±11)g/L和(51±11)g/L，两者比较差异无显著意义，t=0.199，0.487，P>0.05。哮喘豚鼠BAL中蛋白的含量为(137±8 )g/L，对照组为(108±8)g/L，两组比较，t=5.218,P<0.01。
3.表面活性的变化：和对照组相比，哮喘发作组灌洗液表面活性下降明显(P<0.05或P<0.01)，表现为最小表面张力升高，稳定系数减小，恢复系数降低(表1)。
表1 两组豚鼠支气管肺灌洗液表面活性指标(±s) 组别
鼠数
γmax(mN/m)
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γmin(mN/m)
SI
RI
对照组
6
55.4±0.7
37.9±0.9
0.37±0.03
2.09±0.01
哮喘组
6
56.3±0.3*
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45.0±0.8**
0.22±0.02**
2.01±0.01*
注：与对照组比较*t=3.14，3.45，P<0.05;**t=8.84，6.98，P<0.01;γmax:最大表面张力；γmin：最小表面张力；SI：稳定系数；RI：恢复系数(表2同)
4.支气管-肺灌流结果：结果显示动物哮喘发作后，单位时间内灌流量为(6±4)g/min，对照组为(17±4) g/min，两组比较差异有非常显著意义(P<0.01)。
5.BAL表面活性指标与总磷脂、饱和卵磷脂及总蛋白量的多元线性相关分析：支气管肺灌洗液表面活性的高低与灌洗液磷脂含量呈显著正相关，而与灌洗液总蛋白含量呈显著负相关(表2)。
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表2 豚鼠支气管肺灌洗液表面活性指标与磷脂量及总蛋白量的偏相关系数(R) 指标
总磷脂量
饱和磷脂量
总蛋白量
γmax
-0.0351
-0.1327
0.5893*
γmin
-0.5149*
-0.5572*
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0.8404**
SI
0.5579*
0.5912**
-0.8250**
RI
0.6833**
0.6977**
-0.7591**
注：*P<0.05;**P<0.01
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三、讨论
目前认为PS不但存在于肺泡表面，降低气-液界面表面张力防止呼气末肺泡塌陷；而且末梢细支气管表面也存在PS并发挥其生理功能，维持末梢细支气管稳定，它能使体外末梢细支气管模型-毛细玻璃管及兔末梢支气管保持通畅且在维持末梢支气管稳定方面起着非常重要的作用。
哮喘是炎症反应致气道平滑肌痉挛，阻力增高而引起，但Enhorning[1]提出PS相对不足或功能不良也可造成气道阻力增加，根据Laplace定律，当PS缺乏时，呼气时小肺泡气体进入与之相连的大肺泡，这时大肺泡半径则远远大于与其相连的末梢细支气管半径，从而使末梢细支气管塌陷或在其腔内形成液体栓子，若大部分末梢细支气管均发生类似情况，则整个气道阻力升高，哮喘发生。实验证明功能良好的PS可使末梢毛细支气管保持通畅，而PS缺乏或加入白蛋白则会使其阻力增加。本实验显示，哮喘豚鼠离体肺支气管灌流单位时间灌流量明显低于对照组，这也许能从另一个侧面证实此观点。那么哮喘时是否存在PS缺乏呢？本结果显示与正常豚鼠相比，哮喘豚鼠BAL的γmin升高、RI降低、SI减小；而哮喘急性发作病人痰中γmin增高、总蛋白增加[7]，支持我们的结果，说明哮喘时PS活性明显下降。有研究发现哮喘时炎细胞释放的磷脂酶A2和溶血磷脂酶能降解磷脂，使PS失活[8]，但本实验中哮喘豚鼠BAL中的总磷脂和饱和磷脂并无明显降低，故基本排除酶降解磷脂致PS功能不良的可能。同时本实验结果显示BAL中PS表面活性与磷脂呈显著正相关，与蛋白含量呈显著负相关，提示哮喘时PS表面活性下降与蛋白增加有关。
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参考文献
1 Groan Enhorning，Surfactant research of interest to the clinician.Progress Respir Res， 1990，25：265-270.
2 Folch J，Less M，Sloane Stanlay GH.A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues.J Biol Chem,1957,226:497-509.
3 Mason RJ，Nellenbogen J.Clements JA.Isolation of disaturation phosphatidylcholine with osmium tetroxide.J Lipid Res ,1976,17:281-284.
, http://www.100md.com
4 Bartlett GB.Phosphorous assay in column chromatography.J Lipid Res,1959,234:466-468.
5 Lowry OH,Rosebrough NJ，Farr AL.Protein measurement with the folin phenol reagent.J Biol Chem,1951,193:265-275.
6 徐叔云，卞如濂，陈修，主编.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1991；1184.
7 Kurashima K，Fujimura M，Matsuda T，et al.Surface activity of sputum from acute asthmatic patients.Am J Respir Care Med，1997，155:1254-1259.
8 Lema G，Enhorning G.Surface properties after a simulated PLA2 hydrolysis of pulmonary surfactant′s main component，DPPC.Biochim Biophys Acta,1997，1345: 86-92.
(收稿：1998-06-23 修回：1999-05-20), 百拇医药
单位：200433上海，第二军医大学长海医院儿科实验室
关键词：
中华医学杂志990828 肺表面活性物质(pulmonary surfactant，PS)对于肺发挥正常呼吸功能有着重要的生理作用。已证实哮喘发作可能也与PS相对不足有关[1]，为此，我们从动物支气管肺灌洗液(BAL)等方面论证了PS与哮喘的关系，以探讨PS在哮喘发病机制中的作用。
一、材料和方法
1.动物分组：雄性豚鼠60只(250～500 g)，用随机数字表法将其随机分为对照组和哮喘组，每组30只。每组再分肺病理形态观察组、BAL中磷脂和蛋白定量测定组、BAL表面活性测定组及支气管肺灌流组，每个亚组6只豚鼠。
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2.模型建立：以质量浓度为1 kg/L卵蛋白溶液按100 mg/kg腹腔注射致敏，3周后以质量浓度为0.1 kg/L卵蛋白溶液雾化吸入，豚鼠出现气促、口唇紫绀、呼吸困难甚至抽搐等症状。
3.BAL中磷脂、蛋白的分离和测定：麻醉后豚鼠，行气管插管，再以致死剂量戊巴比妥钠颈动脉注射处死，然后按10 ml/g湿肺生理盐水以20 cm H2O压力缓慢流入肺部，保留3分钟后使其尽可能流出，反复5次，收集灌洗液，离心(2500 r/min，5分钟)，吸取上清液作为BAL。按文献[2]的方法提取出BAL中的磷脂，按文献[3]方法提取饱和卵磷脂，定量测定按Bartlett[4]的方法；BAL中蛋白的测定按Lowry等[5]方法。
4.BAL表面张力的测定：采用仪器型号为MTP-2膜天平，液槽内加入蒸馏水450 ml，缓缓滴入BAL 20 ml，吸附平衡20分钟后开动滑尺，压缩单分子层表面膜的面积，表面张力随PS表面膜面积的变化而相应变化。将液面表面张力的变化通过型号为LE3-A的函数记录仪描记下来。根据最大表面张力(γmax)和最小表面张力(γmin)计算出恢复系数(RI)和稳定系数(SI)等指标。RI=(Δγ′+γmin)/ γmin ；SI=2(γmax-γmin)/(γmax+γmin)。式中Δγ′为表面积压缩至25%时的表面张力。
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5.离体支气管肺灌流模型的建立：离体支气管肺灌流是通过观察灌流液流出速率的变化，借以测定末梢细支气管通畅情况的一种方法，具体操作见文献[6]。
6.肺组织光镜标本的制备：处死豚鼠后取出肺脏，进行大体病理观察，再用体积分数为10%的甲醛浸泡固定，常规石蜡切片，HE染色。
7.统计学方法：应用SPLM统计软件进行数据分析，数据用
±s表示，差异显著性检验采用t检验，对支气管肺泡灌洗液中PS表面活性与总磷脂、饱和磷脂及总蛋白作多元相关分析。二、结果
1.哮喘时肺的形态学变化：致敏豚鼠吸入雾化质量浓度为1 kg/L的卵蛋白溶液后1分钟内均出现呼吸急促、口周紫绀、呼吸困难甚至抽搐、死亡。大体标本可见肺气肿，表面有点状或小片状新鲜出血点。显微镜下支气管痉挛，管腔中有粘液栓形成，肺间质毛细血管明显扩张充血，支气管及毛细血管周围大量炎细胞浸润。
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2.BAL中磷脂和蛋白含量的变化：致敏豚鼠诱发哮喘后，其灌洗液中总磷脂和饱和卵磷脂的含量分别为(65±10)g/L和(48±11)g/L，对照组分别为(66±11)g/L和(51±11)g/L，两者比较差异无显著意义，t=0.199，0.487，P>0.05。哮喘豚鼠BAL中蛋白的含量为(137±8 )g/L，对照组为(108±8)g/L，两组比较，t=5.218,P<0.01。
3.表面活性的变化：和对照组相比，哮喘发作组灌洗液表面活性下降明显(P<0.05或P<0.01)，表现为最小表面张力升高，稳定系数减小，恢复系数降低(表1)。
表1 两组豚鼠支气管肺灌洗液表面活性指标(
±s) 组别鼠数
γmax(mN/m)
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γmin(mN/m)
SI
RI
对照组
6
55.4±0.7
37.9±0.9
0.37±0.03
2.09±0.01
哮喘组
6
56.3±0.3*
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45.0±0.8**
0.22±0.02**
2.01±0.01*
注：与对照组比较*t=3.14，3.45，P<0.05;**t=8.84，6.98，P<0.01;γmax:最大表面张力；γmin：最小表面张力；SI：稳定系数；RI：恢复系数(表2同)
4.支气管-肺灌流结果：结果显示动物哮喘发作后，单位时间内灌流量为(6±4)g/min，对照组为(17±4) g/min，两组比较差异有非常显著意义(P<0.01)。
5.BAL表面活性指标与总磷脂、饱和卵磷脂及总蛋白量的多元线性相关分析：支气管肺灌洗液表面活性的高低与灌洗液磷脂含量呈显著正相关，而与灌洗液总蛋白含量呈显著负相关(表2)。
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表2 豚鼠支气管肺灌洗液表面活性指标与磷脂量及总蛋白量的偏相关系数(R) 指标
总磷脂量
饱和磷脂量
总蛋白量
γmax
-0.0351
-0.1327
0.5893*
γmin
-0.5149*
-0.5572*
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0.8404**
SI
0.5579*
0.5912**
-0.8250**
RI
0.6833**
0.6977**
-0.7591**
注：*P<0.05;**P<0.01
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三、讨论
目前认为PS不但存在于肺泡表面，降低气-液界面表面张力防止呼气末肺泡塌陷；而且末梢细支气管表面也存在PS并发挥其生理功能，维持末梢细支气管稳定，它能使体外末梢细支气管模型-毛细玻璃管及兔末梢支气管保持通畅且在维持末梢支气管稳定方面起着非常重要的作用。
哮喘是炎症反应致气道平滑肌痉挛，阻力增高而引起，但Enhorning[1]提出PS相对不足或功能不良也可造成气道阻力增加，根据Laplace定律，当PS缺乏时，呼气时小肺泡气体进入与之相连的大肺泡，这时大肺泡半径则远远大于与其相连的末梢细支气管半径，从而使末梢细支气管塌陷或在其腔内形成液体栓子，若大部分末梢细支气管均发生类似情况，则整个气道阻力升高，哮喘发生。实验证明功能良好的PS可使末梢毛细支气管保持通畅，而PS缺乏或加入白蛋白则会使其阻力增加。本实验显示，哮喘豚鼠离体肺支气管灌流单位时间灌流量明显低于对照组，这也许能从另一个侧面证实此观点。那么哮喘时是否存在PS缺乏呢？本结果显示与正常豚鼠相比，哮喘豚鼠BAL的γmin升高、RI降低、SI减小；而哮喘急性发作病人痰中γmin增高、总蛋白增加[7]，支持我们的结果，说明哮喘时PS活性明显下降。有研究发现哮喘时炎细胞释放的磷脂酶A2和溶血磷脂酶能降解磷脂，使PS失活[8]，但本实验中哮喘豚鼠BAL中的总磷脂和饱和磷脂并无明显降低，故基本排除酶降解磷脂致PS功能不良的可能。同时本实验结果显示BAL中PS表面活性与磷脂呈显著正相关，与蛋白含量呈显著负相关，提示哮喘时PS表面活性下降与蛋白增加有关。
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参考文献
1 Groan Enhorning，Surfactant research of interest to the clinician.Progress Respir Res， 1990，25：265-270.
2 Folch J，Less M，Sloane Stanlay GH.A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues.J Biol Chem,1957,226:497-509.
3 Mason RJ，Nellenbogen J.Clements JA.Isolation of disaturation phosphatidylcholine with osmium tetroxide.J Lipid Res ,1976,17:281-284.
, http://www.100md.com
4 Bartlett GB.Phosphorous assay in column chromatography.J Lipid Res,1959,234:466-468.
5 Lowry OH,Rosebrough NJ，Farr AL.Protein measurement with the folin phenol reagent.J Biol Chem,1951,193:265-275.
6 徐叔云，卞如濂，陈修，主编.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1991；1184.
7 Kurashima K，Fujimura M，Matsuda T，et al.Surface activity of sputum from acute asthmatic patients.Am J Respir Care Med，1997，155:1254-1259.
8 Lema G，Enhorning G.Surface properties after a simulated PLA2 hydrolysis of pulmonary surfactant′s main component，DPPC.Biochim Biophys Acta,1997，1345: 86-92.
(收稿：1998-06-23 修回：1999-05-20), 百拇医药