大鼠急性心肌缺血早期血管内皮生长因子的表达
作者：陈建国 徐小虎 吴贤英
单位：徐小虎 吴贤英 (515030 汕头大学医学院病理学教研室)；陈建国 (中山医科大学法医病理学教研室,广州510089)
关键词：
中华医学杂志990827 我们建立了大鼠急性心肌缺血模型，并运用免疫组织化学及原位杂交技术，初步观察了大鼠急性心肌缺血早期血管内皮生长因子(VEGF)在心脏不同部位的表达。
一、材料和方法
1.材料：(1)中山医科大学实验动物中心提供SD系成年健康大鼠30只，雌雄不限，体重(300±20)g。将大鼠分成5组(每组6只)：对照组(开胸后不结扎)、缺血30分钟组、缺血1小时组、缺血3小时组和缺血5小时组。(2)仪器与试剂：动物呼吸机DH-140(浙江产)。VEGF兔多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒(武汉博士德公司)。编码VEGF cDNA片段的质粒(美国Gospodarowicz教授惠赠)。地高辛标记与检测试剂盒(德国宝灵曼公司)。
, 百拇医药
2.方法：(1)大鼠急性心肌缺血模型的建立参照文献[1]。对照组大鼠按上述方法开胸后仅在同一部位进针线，而不进行结扎。以结扎前后标准心电图导联ⅡST段抬高≥0.1 mV作为检测结扎左冠状动脉成功造成心肌缺血的指标。不同时间点以断颈法处死大鼠，取出心脏，分别取缺血区(左心室前壁中心区域)、缺血边缘区(左心室与右心室前壁交界处)和正常区(右心室前壁中心区域)组织进行冰冻切片。各组切片常规HE染色。(2)免疫组织化学染色：按SABC试剂盒说明书进行。(3)原位杂交过程简述如下：冰冻切片厚8 μm，0.04 kg/L多聚甲醛室温固定30分钟，新鲜配制体积分数为0.3% H2O2甲醛溶液室温30分钟，滴加新鲜稀释的蛋白酶K，37℃10分钟，滴加已变性的含地高辛标记探针(0.5 μg/ml)的原位杂交液20 μl，盖上保护膜，湿盒中37℃杂交24小时。杂交后洗涤：梯度标准柠檬酸盐-氯化钠液(SSC)洗涤，时间严格控制。滴加封闭液，室温20分钟，不洗。滴加小鼠抗地高辛，37℃30分钟，滴加生物素化羊抗小鼠IgG，37℃20分钟，滴加SABC，37℃20分钟，对氨基联苯胺(DAB)显色，显微镜下控制，出现棕横色产物为阳性反应。阴性对照：无探针杂交；杂交前用RNA酶处理。(4)图像分析及统计学处理：各组免疫组织化学及原位杂交阳性产物应用Quantimet-520图像分析系统进行定量分析，具体操作为低倍镜下找视野后，调至400倍，自动控制装置随机选10个位点测量阳性反应产物面积，然后取平均值。阳性反应产物强度应用图像处理系统灰度值表示，然后将上述数值转化成阳性指数：阳性指数=(阳性反应面积/测量面积)×阳性强度灰度值。数据应用SPSS for Windows软件包AVONA(方差分析)及S-N-K检验等方法进行差异显著性检验。数据用
±s表示。
, 百拇医药
二、结果
1.免疫组织化学染色及图像分析处理结果：大鼠心肌缺血30分钟在心肌缺血区可见极为散在的阳性反应细胞，缺血边缘区与正常区域均未见阳性反应细胞。缺血1小时后在缺血区心肌和内皮细胞膜及细胞浆开始出现明显的阳性棕黄色反应，缺血边缘区和正常区域局限部位的心肌与内皮细胞膜也出现多量的阳性反应。缺血区域随着缺血时间的延长其细胞膜阳性染色愈强，至缺血3小时左右缺血边缘区和正常区细胞也随着缺血时间的延长而出现愈来愈强的阳性染色反应。到冠状动脉结扎后5小时，缺血区域、缺血边缘区域及心肌正常区域均可出现很强的VEGF阳性表达细胞，几乎遍及心肌细胞、心肌间质细胞和血管内皮细胞，但主要集中于缺血边缘区域。对照组均未见阳性反应细胞。图像分析处理结果见表1。
表1 各组大鼠血管内皮生长因子的表达情况(阳性指数，±s) 组别
, 百拇医药
鼠数(只)
VEGF蛋白
VEGF mRNA
对照组
缺血相应区
6
0.14±0.08
0.26±0.11
缺血边缘相应区
6
0.17±0.12
0.21±0.07
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正常相应区
6
0.16±0.13
0.18±0.09
缺血30分钟组
缺血区
6
0.64±0.24
2.08±1.17△
缺血边缘区
6
0.25±0.19
, 百拇医药
0.32±0.10*
正常区
6
0.24±0.15
0.29±0.14*
缺血1小时组
缺血区
6
3.98±0.86△
5.57±2.35▲
缺血边缘区
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6
0.73±0.37*
2.82±1.46*△
正常区
6
0.27±0.11*
2.51±1.70*△
缺血3小时组
缺血区
6
8.63±2.55▲
, http://www.100md.com
8.42±3.37▲
缺血边缘区
6
6.45±2.47▲
10.38±5.29▲
正常区
6
3.70±1.07*△
6.08±3.27▲
缺血5小时组
缺血区
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6
6.02±2.21▲
6.30±3.42▲
缺血边缘区
6
10.16±3.82*▲
14.27±5.01**▲
正常区
6
6.86±1.76▲
6.39±2.13▲
, 百拇医药
注：实验组与对照组间比较：△ F=3.09，P<0.05；▲F=47.32，P<0.01。同组内不同区域间比较*F=6.14，P<0.05;**F=53.65，P<0.01
2.VEGF mRNA原位杂交及图像分析处理结果：大鼠缺血30分钟在缺血区域心肌细胞浆出现VEGF mRNA明显表达，随缺血时间的延长其表达的阳性强度也越强。缺血1小时，表达位置从缺血区扩散至缺血边缘区和正常区。缺血3小时，缺血区域、缺血边缘区域及正常区域心肌均可出现很强的VEGF mRNA阳性表达细胞。缺血5小时，VEGF mRNA阳性表达细胞主要集中于缺血边缘区。对照组未见阳性反应结果(表1)。
三、讨论
本实验中大鼠急性心肌缺血1小时即可在缺血心肌局部检测到VEGF蛋白的明显表达，而且表达的阳性强度随缺血时间的延长而越来越强。到缺血3小时达到高峰，而到缺血5小时则出现了下降趋势。造成这种现象的主要原因是：缺血早期，缺血心肌血供突然减少形成氧梯度变化促使心肌细胞产生VEGF，致使VEGF的表达急骤上升，随着缺血时间的延长，氧梯度消失以及心肌细胞发生不可逆损伤，使心肌细胞失去合成VEGF的功能，而出现VEGF表达下降的趋势[1]。心肌缺血早期增加的VEGF与其血管内皮细胞膜上的特异性受体结合后，发挥剂量依赖性舒张小冠状动脉作用，开放冠脉侧支循环以改善心肌血液供应，减少缺血面积而起到保护心肌的作用。
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本研究中我们还发现，随着缺血时间的延长，VEGF蛋白的表达除了阳性强度增加外，在心脏的表达位置也出现了变化。缺血1小时VEGF主要在缺血区域心肌细胞中表达。缺血3小时则扩散到缺血边缘区域和正常区域。到缺血5小时VEGF的表达则在缺血区域、缺血边缘区域和正常区域几乎所有的心肌细胞和内皮细胞中都有明显表达，但主要集中在缺血边缘区域。这可能是因为冠状动脉左前降支阻塞后引起的心肌梗塞，通常可使左心室梗塞区域舒张压上升25～30 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，继而导致左心室正常区域和右心室负荷加重，因而使此处的心肌处于相对缺氧状态而诱导局部心肌细胞表达VEGF[1，2]。但随着心肌缺血时间的延长，VEGF蛋白表达越来越局限于缺血边缘区域的现象可能正好与此区域新血管的生成有关[3]。因为缺血边缘区域存在氧梯度，促使局部存活细胞合成VEGF以促进新血管的生成，而一旦氧梯度消失，则新血管的生成也会停止[3]。
VEGF基因的表达时间较其蛋白的表达时间更早，心肌缺血30分钟在缺血心肌局部即出现明显的VEGF mRNA表达，以后随缺血时间的延长，VEGF mRNA表达的趋势与其蛋白的表达趋势一致，只是在时间上有所提前[1]。VEGF基因表达提前于蛋白的表达，表明VEGF蛋白的表达受其基因在转录和翻译水平的调控，因此VEGF主要是通过自分泌机制在局部发挥生理作用。
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参考文献
1 Li J，Brown LF，Hibberd MG，et al.VEGF，flk-1 and flt-1 expression in a rat myocardial infarction model of angiogenesis.Am J Physiol，1996，270(5 pt2):H1803-H1811.
2 Litwin SE，Katz SE，Morgan JP，et al.Serial echocardiographic assessment of left ventricular geometry after large myocardial infarction in the rat.Circulation，1994，90:345-354.
3 Knighton DR，Silver IA，Hunt TK.Regulation of woundhealing angiogenesis-effect of oxygen gradients and inspired oxygen concentration.Surgery，1981，90:262-270.
(收稿：1998-09-17 修回：1999-04-05), 百拇医药
单位：徐小虎 吴贤英 (515030 汕头大学医学院病理学教研室)；陈建国 (中山医科大学法医病理学教研室,广州510089)
关键词：
中华医学杂志990827 我们建立了大鼠急性心肌缺血模型，并运用免疫组织化学及原位杂交技术，初步观察了大鼠急性心肌缺血早期血管内皮生长因子(VEGF)在心脏不同部位的表达。
一、材料和方法
1.材料：(1)中山医科大学实验动物中心提供SD系成年健康大鼠30只，雌雄不限，体重(300±20)g。将大鼠分成5组(每组6只)：对照组(开胸后不结扎)、缺血30分钟组、缺血1小时组、缺血3小时组和缺血5小时组。(2)仪器与试剂：动物呼吸机DH-140(浙江产)。VEGF兔多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒(武汉博士德公司)。编码VEGF cDNA片段的质粒(美国Gospodarowicz教授惠赠)。地高辛标记与检测试剂盒(德国宝灵曼公司)。
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2.方法：(1)大鼠急性心肌缺血模型的建立参照文献[1]。对照组大鼠按上述方法开胸后仅在同一部位进针线，而不进行结扎。以结扎前后标准心电图导联ⅡST段抬高≥0.1 mV作为检测结扎左冠状动脉成功造成心肌缺血的指标。不同时间点以断颈法处死大鼠，取出心脏，分别取缺血区(左心室前壁中心区域)、缺血边缘区(左心室与右心室前壁交界处)和正常区(右心室前壁中心区域)组织进行冰冻切片。各组切片常规HE染色。(2)免疫组织化学染色：按SABC试剂盒说明书进行。(3)原位杂交过程简述如下：冰冻切片厚8 μm，0.04 kg/L多聚甲醛室温固定30分钟，新鲜配制体积分数为0.3% H2O2甲醛溶液室温30分钟，滴加新鲜稀释的蛋白酶K，37℃10分钟，滴加已变性的含地高辛标记探针(0.5 μg/ml)的原位杂交液20 μl，盖上保护膜，湿盒中37℃杂交24小时。杂交后洗涤：梯度标准柠檬酸盐-氯化钠液(SSC)洗涤，时间严格控制。滴加封闭液，室温20分钟，不洗。滴加小鼠抗地高辛，37℃30分钟，滴加生物素化羊抗小鼠IgG，37℃20分钟，滴加SABC，37℃20分钟，对氨基联苯胺(DAB)显色，显微镜下控制，出现棕横色产物为阳性反应。阴性对照：无探针杂交；杂交前用RNA酶处理。(4)图像分析及统计学处理：各组免疫组织化学及原位杂交阳性产物应用Quantimet-520图像分析系统进行定量分析，具体操作为低倍镜下找视野后，调至400倍，自动控制装置随机选10个位点测量阳性反应产物面积，然后取平均值。阳性反应产物强度应用图像处理系统灰度值表示，然后将上述数值转化成阳性指数：阳性指数=(阳性反应面积/测量面积)×阳性强度灰度值。数据应用SPSS for Windows软件包AVONA(方差分析)及S-N-K检验等方法进行差异显著性检验。数据用
±s表示。, 百拇医药
二、结果
1.免疫组织化学染色及图像分析处理结果：大鼠心肌缺血30分钟在心肌缺血区可见极为散在的阳性反应细胞，缺血边缘区与正常区域均未见阳性反应细胞。缺血1小时后在缺血区心肌和内皮细胞膜及细胞浆开始出现明显的阳性棕黄色反应，缺血边缘区和正常区域局限部位的心肌与内皮细胞膜也出现多量的阳性反应。缺血区域随着缺血时间的延长其细胞膜阳性染色愈强，至缺血3小时左右缺血边缘区和正常区细胞也随着缺血时间的延长而出现愈来愈强的阳性染色反应。到冠状动脉结扎后5小时，缺血区域、缺血边缘区域及心肌正常区域均可出现很强的VEGF阳性表达细胞，几乎遍及心肌细胞、心肌间质细胞和血管内皮细胞，但主要集中于缺血边缘区域。对照组均未见阳性反应细胞。图像分析处理结果见表1。
表1 各组大鼠血管内皮生长因子的表达情况(阳性指数，
±s) 组别, 百拇医药
鼠数(只)
VEGF蛋白
VEGF mRNA
对照组
缺血相应区
6
0.14±0.08
0.26±0.11
缺血边缘相应区
6
0.17±0.12
0.21±0.07
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正常相应区
6
0.16±0.13
0.18±0.09
缺血30分钟组
缺血区
6
0.64±0.24
2.08±1.17△
缺血边缘区
6
0.25±0.19
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0.32±0.10*
正常区
6
0.24±0.15
0.29±0.14*
缺血1小时组
缺血区
6
3.98±0.86△
5.57±2.35▲
缺血边缘区
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6
0.73±0.37*
2.82±1.46*△
正常区
6
0.27±0.11*
2.51±1.70*△
缺血3小时组
缺血区
6
8.63±2.55▲
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8.42±3.37▲
缺血边缘区
6
6.45±2.47▲
10.38±5.29▲
正常区
6
3.70±1.07*△
6.08±3.27▲
缺血5小时组
缺血区
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6
6.02±2.21▲
6.30±3.42▲
缺血边缘区
6
10.16±3.82*▲
14.27±5.01**▲
正常区
6
6.86±1.76▲
6.39±2.13▲
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注：实验组与对照组间比较：△ F=3.09，P<0.05；▲F=47.32，P<0.01。同组内不同区域间比较*F=6.14，P<0.05;**F=53.65，P<0.01
2.VEGF mRNA原位杂交及图像分析处理结果：大鼠缺血30分钟在缺血区域心肌细胞浆出现VEGF mRNA明显表达，随缺血时间的延长其表达的阳性强度也越强。缺血1小时，表达位置从缺血区扩散至缺血边缘区和正常区。缺血3小时，缺血区域、缺血边缘区域及正常区域心肌均可出现很强的VEGF mRNA阳性表达细胞。缺血5小时，VEGF mRNA阳性表达细胞主要集中于缺血边缘区。对照组未见阳性反应结果(表1)。
三、讨论
本实验中大鼠急性心肌缺血1小时即可在缺血心肌局部检测到VEGF蛋白的明显表达，而且表达的阳性强度随缺血时间的延长而越来越强。到缺血3小时达到高峰，而到缺血5小时则出现了下降趋势。造成这种现象的主要原因是：缺血早期，缺血心肌血供突然减少形成氧梯度变化促使心肌细胞产生VEGF，致使VEGF的表达急骤上升，随着缺血时间的延长，氧梯度消失以及心肌细胞发生不可逆损伤，使心肌细胞失去合成VEGF的功能，而出现VEGF表达下降的趋势[1]。心肌缺血早期增加的VEGF与其血管内皮细胞膜上的特异性受体结合后，发挥剂量依赖性舒张小冠状动脉作用，开放冠脉侧支循环以改善心肌血液供应，减少缺血面积而起到保护心肌的作用。
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本研究中我们还发现，随着缺血时间的延长，VEGF蛋白的表达除了阳性强度增加外，在心脏的表达位置也出现了变化。缺血1小时VEGF主要在缺血区域心肌细胞中表达。缺血3小时则扩散到缺血边缘区域和正常区域。到缺血5小时VEGF的表达则在缺血区域、缺血边缘区域和正常区域几乎所有的心肌细胞和内皮细胞中都有明显表达，但主要集中在缺血边缘区域。这可能是因为冠状动脉左前降支阻塞后引起的心肌梗塞，通常可使左心室梗塞区域舒张压上升25～30 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，继而导致左心室正常区域和右心室负荷加重，因而使此处的心肌处于相对缺氧状态而诱导局部心肌细胞表达VEGF[1，2]。但随着心肌缺血时间的延长，VEGF蛋白表达越来越局限于缺血边缘区域的现象可能正好与此区域新血管的生成有关[3]。因为缺血边缘区域存在氧梯度，促使局部存活细胞合成VEGF以促进新血管的生成，而一旦氧梯度消失，则新血管的生成也会停止[3]。
VEGF基因的表达时间较其蛋白的表达时间更早，心肌缺血30分钟在缺血心肌局部即出现明显的VEGF mRNA表达，以后随缺血时间的延长，VEGF mRNA表达的趋势与其蛋白的表达趋势一致，只是在时间上有所提前[1]。VEGF基因表达提前于蛋白的表达，表明VEGF蛋白的表达受其基因在转录和翻译水平的调控，因此VEGF主要是通过自分泌机制在局部发挥生理作用。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Li J，Brown LF，Hibberd MG，et al.VEGF，flk-1 and flt-1 expression in a rat myocardial infarction model of angiogenesis.Am J Physiol，1996，270(5 pt2):H1803-H1811.
2 Litwin SE，Katz SE，Morgan JP，et al.Serial echocardiographic assessment of left ventricular geometry after large myocardial infarction in the rat.Circulation，1994，90:345-354.
3 Knighton DR，Silver IA，Hunt TK.Regulation of woundhealing angiogenesis-effect of oxygen gradients and inspired oxygen concentration.Surgery，1981，90:262-270.
(收稿：1998-09-17 修回：1999-04-05), 百拇医药