鲤鱼精巢DNA对自然衰老小鼠体内抗氧化酶活性的影响
作者：唐孝礼* 颜光美 许实波 周永红
单位：唐孝礼 颜光美 中山医科大学药理学教研室 广州 510089；许实波 中山大学生命科学学院药学系；周永红 广东药学院预防医学系卫化室
关键词：鲤鱼精巢；脱氧核糖核酸；抗氧化酶
鲤鱼精巢DNA对自然衰老小鼠体内抗氧化酶活性的影响 摘 要 以自然衰老小鼠为实验对象，采用邻苯三酚自氧化法测定SOD活性、紫外分光光度法测定CAT活性、愈创木酚法测定POD活性、DTNB直接比色法测定GSH-Px活性，研究了鲤鱼精巢DNA对老龄动物体内抗氧化酶活性的影响。结果表明，鲤鱼精巢DNA可明显提高自然衰老小鼠体内抗氧化酶的活性。
Effects of Carp Spermary DNA on Some Oxidoreductase Activities
, 百拇医药
in Naturally Senile Mice
Tang Xiaoli, Xu Shibo, Zhou Yonghong, et al
(Department of Pharmacology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089)
Abstract Effects of carp spermary DNA on various oxidoreductase activities in naturelly senile mice were investigated. The activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were measured by means of pyrogallol auto-oxidation, ultraviolet spectrometry, guaiacol oxidation and DTNB (5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid) direct colorimetry, respectively. The results showed that DNA from carp spermary could enhance the activities of these enzymes in naturally senile mice.
, 百拇医药
Key words carp spermary deoxyribonucleic acid (DNA) naturally senile mice
鲤鱼既是一种常见食用鱼类，又是一种常用滋补中药，能利小便、去水气。据《食物本草备考》记载，鲤鱼能“消水肿、黄疸、脚气”，又能“安胎，治怀孕以后身肿”。雄性鲤鱼在发情期，它的精巢约占体重的十分之一，精巢的主要成分是核蛋白，由鱼精蛋白和脱氧核糖核酸(DNA)组成。鲤鱼精巢的药用价值未见文献报道，为了科学合理地利用鲤鱼精巢，我们进行了鲤鱼精巢DNA的分离提取及其药理作用研究，发现鲤鱼精巢DNA的毒性极低，为实际无毒级物质[1]；小鼠服用鲤鱼精巢DNA后，对动物体内自身DNA的损伤具有明显的保护作用[2]；鲤鱼精巢DNA对果蝇和小鼠的生存寿命有显著的延长作用[3]。本文报道鲤鱼精巢DNA对自然衰老小鼠体内抗氧化酶活性的影响。
1 实验材料
, 百拇医药
1.1 动物和样品：NIH小鼠由广东省医学实验动物中心提供。DNA由作者从鲤科鲤Cyprinus (Cyprinus) carpio haemtopterus Temminck et Schlegel 的精巢中提取得到，经鉴定纯度为96.52%，实验时用蒸馏水配成所需浓度的受试液。
1.2 试剂：Vit E，广州星群药业股份有限公司生产，批号951208；邻苯三酚，沈阳化学试剂厂生产，批号960514；还原型谷胱甘肽，购自Serva公司；5，5-硫代对硝基苯甲酸，购自Sigma公司；愈创木酚，上海佘山化工厂生产，批号950117；三羟甲基氨基甲烷，购自Merck公司，其余均为市售分析纯。
2 方法与结果
2.1 对超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响：选取12月龄健康NIH小鼠40只，雌雄各半，体重(34±3)g，随机分成4组，每组雌雄各5只。实验设空白对照组，DNA高、低剂量组和VitE阳性对照组。每天分别ig生理盐水，鲤鱼精巢DNA 120、60mg/kg，VitE120mg/kg1次，给药体积为0.25 mL/10g体重。各组小鼠在相同条件下常规饲养。连续给药45d后，自小鼠眼眶取血，提取SOD测其活性，SOD活性测定采用邻苯三酚自氧化法[4]。同时选2月龄健康NIH小鼠雌雄各5 只，同样取血提取SOD测活性，作青年小鼠对照组，结果见表1。
, 百拇医药
表1 鲤鱼精巢DNA对SOD活性的影响(
±s,n=10)
组别
剂量
(mg/kg)
SOD活性
(U/mL)
提高率
(%)
青年小鼠空白对照
—
, 百拇医药
124.5±4.9***
—
老年小鼠空白对照
—
74.7±5.6
—
老年鼠DNA高剂量
120
103.4±5.3***
38.4
老年鼠DNA低剂量
60
, http://www.100md.com
99.3±6.1***
32.9
老年小鼠Vit E
120
91.5±5.3***
22.5
与老年小鼠空白对照组比较：***P<0.001
由表1可见，老龄小鼠红细胞中SOD活性比青年小鼠明显降低，其活力只有青年小鼠的60%；老龄小鼠服用鲤鱼精巢DNA或Vit E后，其SOD活力明显提高。
2.2 对过氧化氢酶(CAT)活性的影响：动物分组及给药方法同实验2.1。连续给药30 d后，每鼠眼眶取血10 μL，加入到1.0 mL蒸馏水中，制成全血溶血液；同时选2月龄健康NIH小鼠雌雄各5 只，每鼠眼眶取血10 μL，加入到1.0 mL蒸馏水中，制成同样浓度的溶血液，作青年小鼠对照组。CAT活性测定采用紫外分光光度法[5]。测试条件：温度25℃，测试时间400 s，间隔8 s测1 次。以时间为横坐标、吸光度值A230nm为纵坐标作图，得到CAT分解H2O2的速率曲线，结果见图1。
, 百拇医药
A-老年小鼠空白对照； B-ig Vit E 120 mg/kg的老年小鼠； C-ig鲤鱼精巢DNA 60mg/kg的老年小鼠； D-ig鲤鱼精巢DNA 120 mg/kg的老年小鼠 E-青年小鼠空白对照
图1 鲤鱼精巢DNA对CAT活性的影响
由图1可见，青年鼠的CAT分解H2O2的速度最快，老年空白对照鼠的CAT分解H2O2的速度最慢；老龄小鼠服用鲤鱼精巢DNA或Vit E30d后，其CAT活性明显提高，但仍然不及青年鼠；鲤鲤精巢DNA对CAT活性的提高作用强于Vit E。
2.3 对过氧化物酶(POD)活性的影响：动物分组及给药方法同实验2.1。连续给药60d后，急性处死小鼠，每鼠取肝200mg，加5mL预冷的5%氯化钙于玻璃匀浆器中制成匀浆，于4℃以11 994×g离心20min，上清液即为POD酶液；同时选2月龄健康NIH小鼠雌雄各5 只作青年小鼠对照组，同样处理，制备POD酶液。POD活性测定采用愈创木酚法[4]，结果见表2。
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表2 鲤鱼精巢DNA对POD活性的影响(±s,n=10)
组别
剂量
(mg/kg)
POD活性
(U/mL)
提高率
(%)
青年小鼠空白对照
—
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413.1±25.6***
—
老年小鼠空白对照
—
271.7±20.5
—
老年鼠DNA高剂量
120
361.1±22.7***
32.9
老年鼠DNA低剂量
60
, 百拇医药
348.6±21.2***
28.3
老年小鼠Vit E
120
355.2±23.4***
30.7
与老年小鼠空白对照组比较：***P<0.001
由表2可见，老龄小鼠肝中POD活性比青年小鼠明显降低，其活力只有青年小鼠的65.8%；老龄小鼠服用鲤鱼精巢DNA或Vit E后，其POD活力明显提高。
2.4 对谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响：动物分组及给药方法同实验2.1。连续给药60 d后，每鼠眼眶取血10 μL，用双蒸水稀释至1.0 mL；同时选2月龄健康NIH小鼠雌雄各5 只作青年小鼠对照组，每鼠眼眶取血10 μL，用双蒸水稀释至1.0 mL。GSH-Px活性测定采用DTNS直接比色法[5，6]，结果见表3。
, 百拇医药
表3 鲤鱼精巢DNA对GSH-Px活性的影响(±s,n=10)
组别
剂量
(mg/kg)
GSH-Px活性
(U/mL)
提高率
(%)
青年小鼠空白对照
—
, 百拇医药
28.3±2.1***
—
老年小鼠空白对照
—
16.3±1.8
—
老年鼠DNA高剂量
120
22.9±1.9***
40.5
老年鼠DNA低剂量
60
, 百拇医药
21.4±1.8***
31.3
老年小鼠Vit E
120
22.7±2.2***
39.3
与老年小鼠空白对照组比较：***P<0.001
由表3可见，老龄小鼠血中GSH-Px活性比青年小鼠明显降低，其活力只有青年小鼠的57.6%，老龄小鼠服用鲤鱼精巢DNA或Vit E后，其GSH-Px活力明显提高。
3 讨论
, 百拇医药
SOD、CAT、POD、GSH-Px是动物机体内的抗氧化酶，其作用是清除自由基，防止自由基对细胞结构的损伤，它们的活性随着年龄的增长而下降，因此是老化负相关酶，测定它们的活性可以反映动物的衰老状况。随着年龄的增长，抗氧化酶清除活性氧自由基的能力逐渐下降，从而引起活性氧自由基及脂质过氧化产物日益增多，最终导致机体衰老和老年性疾病的发生[7]。抗氧化酶的增龄性失活可能是由于编码抗氧化酶的基因及抗氧化酶本身受到自由基损伤所致[8，9]，老龄动物机体内由于抗氧化酶活力不足，细胞生命活动过程中产生的自由基不能得到有效的清除，自由基不断损伤细胞的结构，损伤的不断积累最终导致细胞衰亡和动物机体的衰老。老龄小鼠服用鲤鱼精巢DNA一段时期以后，其体内的SOD、CAT、POD、GSH-Px活性均显著提高，因而其衰老的速度得到一定程度的遏制。鲤鱼精巢DNA提高老龄小鼠体内抗氧化酶的活性的机制，可能是它能直接清除自由基，减少自由基对抗氧化酶的损伤，也可能是增加了抗氧化酶的表达，其具体作用机制正在研究之中。
, 百拇医药
参考文献
1 唐孝礼，等.中山大学学报(自然科学版)，1998，37(增刊)：74
2 唐孝礼，等.中山大学学报(自然科学版)，1998，37(4)：125
3 唐孝礼，等.中国老年学杂志，1999，19(2)：101
4 陈 勤主编.抗衰老研究实验方法.北京：中国医药科技出版社，1996：458、501
5 荣征星，等.生物化学与生物物理进展，1994，21(4)：362
6 柯雪红，等.中国老年学杂志，1997，17(4)：205
7 Jung K, et al. Free Radic Biol Med, 1996,20(4):613
8 Hayakawa M, et al. Biochem Biophys Res Commun,1996,226(2):369
9 Filser N, et al. Biochem Biophys Res Commun,1997,233(1):102
收稿日期：1999-03-28, 百拇医药(唐孝礼* 颜光美 许实波 周永红)
单位：唐孝礼 颜光美 中山医科大学药理学教研室 广州 510089；许实波 中山大学生命科学学院药学系；周永红 广东药学院预防医学系卫化室
关键词：鲤鱼精巢；脱氧核糖核酸；抗氧化酶
鲤鱼精巢DNA对自然衰老小鼠体内抗氧化酶活性的影响 摘 要 以自然衰老小鼠为实验对象，采用邻苯三酚自氧化法测定SOD活性、紫外分光光度法测定CAT活性、愈创木酚法测定POD活性、DTNB直接比色法测定GSH-Px活性，研究了鲤鱼精巢DNA对老龄动物体内抗氧化酶活性的影响。结果表明，鲤鱼精巢DNA可明显提高自然衰老小鼠体内抗氧化酶的活性。
Effects of Carp Spermary DNA on Some Oxidoreductase Activities
, 百拇医药
in Naturally Senile Mice
Tang Xiaoli, Xu Shibo, Zhou Yonghong, et al
(Department of Pharmacology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089)
Abstract Effects of carp spermary DNA on various oxidoreductase activities in naturelly senile mice were investigated. The activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were measured by means of pyrogallol auto-oxidation, ultraviolet spectrometry, guaiacol oxidation and DTNB (5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid) direct colorimetry, respectively. The results showed that DNA from carp spermary could enhance the activities of these enzymes in naturally senile mice.
, 百拇医药
Key words carp spermary deoxyribonucleic acid (DNA) naturally senile mice
鲤鱼既是一种常见食用鱼类，又是一种常用滋补中药，能利小便、去水气。据《食物本草备考》记载，鲤鱼能“消水肿、黄疸、脚气”，又能“安胎，治怀孕以后身肿”。雄性鲤鱼在发情期，它的精巢约占体重的十分之一，精巢的主要成分是核蛋白，由鱼精蛋白和脱氧核糖核酸(DNA)组成。鲤鱼精巢的药用价值未见文献报道，为了科学合理地利用鲤鱼精巢，我们进行了鲤鱼精巢DNA的分离提取及其药理作用研究，发现鲤鱼精巢DNA的毒性极低，为实际无毒级物质[1]；小鼠服用鲤鱼精巢DNA后，对动物体内自身DNA的损伤具有明显的保护作用[2]；鲤鱼精巢DNA对果蝇和小鼠的生存寿命有显著的延长作用[3]。本文报道鲤鱼精巢DNA对自然衰老小鼠体内抗氧化酶活性的影响。
1 实验材料
, 百拇医药
1.1 动物和样品：NIH小鼠由广东省医学实验动物中心提供。DNA由作者从鲤科鲤Cyprinus (Cyprinus) carpio haemtopterus Temminck et Schlegel 的精巢中提取得到，经鉴定纯度为96.52%，实验时用蒸馏水配成所需浓度的受试液。
1.2 试剂：Vit E，广州星群药业股份有限公司生产，批号951208；邻苯三酚，沈阳化学试剂厂生产，批号960514；还原型谷胱甘肽，购自Serva公司；5，5-硫代对硝基苯甲酸，购自Sigma公司；愈创木酚，上海佘山化工厂生产，批号950117；三羟甲基氨基甲烷，购自Merck公司，其余均为市售分析纯。
2 方法与结果
2.1 对超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响：选取12月龄健康NIH小鼠40只，雌雄各半，体重(34±3)g，随机分成4组，每组雌雄各5只。实验设空白对照组，DNA高、低剂量组和VitE阳性对照组。每天分别ig生理盐水，鲤鱼精巢DNA 120、60mg/kg，VitE120mg/kg1次，给药体积为0.25 mL/10g体重。各组小鼠在相同条件下常规饲养。连续给药45d后，自小鼠眼眶取血，提取SOD测其活性，SOD活性测定采用邻苯三酚自氧化法[4]。同时选2月龄健康NIH小鼠雌雄各5 只，同样取血提取SOD测活性，作青年小鼠对照组，结果见表1。
, 百拇医药
表1 鲤鱼精巢DNA对SOD活性的影响(
±s,n=10)组别
剂量
(mg/kg)
SOD活性
(U/mL)
提高率
(%)
青年小鼠空白对照
—
, 百拇医药
124.5±4.9***
—
老年小鼠空白对照
—
74.7±5.6
—
老年鼠DNA高剂量
120
103.4±5.3***
38.4
老年鼠DNA低剂量
60
, http://www.100md.com
99.3±6.1***
32.9
老年小鼠Vit E
120
91.5±5.3***
22.5
与老年小鼠空白对照组比较：***P<0.001
由表1可见，老龄小鼠红细胞中SOD活性比青年小鼠明显降低，其活力只有青年小鼠的60%；老龄小鼠服用鲤鱼精巢DNA或Vit E后，其SOD活力明显提高。
2.2 对过氧化氢酶(CAT)活性的影响：动物分组及给药方法同实验2.1。连续给药30 d后，每鼠眼眶取血10 μL，加入到1.0 mL蒸馏水中，制成全血溶血液；同时选2月龄健康NIH小鼠雌雄各5 只，每鼠眼眶取血10 μL，加入到1.0 mL蒸馏水中，制成同样浓度的溶血液，作青年小鼠对照组。CAT活性测定采用紫外分光光度法[5]。测试条件：温度25℃，测试时间400 s，间隔8 s测1 次。以时间为横坐标、吸光度值A230nm为纵坐标作图，得到CAT分解H2O2的速率曲线，结果见图1。
, 百拇医药
A-老年小鼠空白对照； B-ig Vit E 120 mg/kg的老年小鼠； C-ig鲤鱼精巢DNA 60mg/kg的老年小鼠； D-ig鲤鱼精巢DNA 120 mg/kg的老年小鼠 E-青年小鼠空白对照
图1 鲤鱼精巢DNA对CAT活性的影响
由图1可见，青年鼠的CAT分解H2O2的速度最快，老年空白对照鼠的CAT分解H2O2的速度最慢；老龄小鼠服用鲤鱼精巢DNA或Vit E30d后，其CAT活性明显提高，但仍然不及青年鼠；鲤鲤精巢DNA对CAT活性的提高作用强于Vit E。
2.3 对过氧化物酶(POD)活性的影响：动物分组及给药方法同实验2.1。连续给药60d后，急性处死小鼠，每鼠取肝200mg，加5mL预冷的5%氯化钙于玻璃匀浆器中制成匀浆，于4℃以11 994×g离心20min，上清液即为POD酶液；同时选2月龄健康NIH小鼠雌雄各5 只作青年小鼠对照组，同样处理，制备POD酶液。POD活性测定采用愈创木酚法[4]，结果见表2。
, http://www.100md.com
表2 鲤鱼精巢DNA对POD活性的影响(
±s,n=10)组别
剂量
(mg/kg)
POD活性
(U/mL)
提高率
(%)
青年小鼠空白对照
—
, http://www.100md.com
413.1±25.6***
—
老年小鼠空白对照
—
271.7±20.5
—
老年鼠DNA高剂量
120
361.1±22.7***
32.9
老年鼠DNA低剂量
60
, 百拇医药
348.6±21.2***
28.3
老年小鼠Vit E
120
355.2±23.4***
30.7
与老年小鼠空白对照组比较：***P<0.001
由表2可见，老龄小鼠肝中POD活性比青年小鼠明显降低，其活力只有青年小鼠的65.8%；老龄小鼠服用鲤鱼精巢DNA或Vit E后，其POD活力明显提高。
2.4 对谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响：动物分组及给药方法同实验2.1。连续给药60 d后，每鼠眼眶取血10 μL，用双蒸水稀释至1.0 mL；同时选2月龄健康NIH小鼠雌雄各5 只作青年小鼠对照组，每鼠眼眶取血10 μL，用双蒸水稀释至1.0 mL。GSH-Px活性测定采用DTNS直接比色法[5，6]，结果见表3。
, 百拇医药
表3 鲤鱼精巢DNA对GSH-Px活性的影响(
±s,n=10)组别
剂量
(mg/kg)
GSH-Px活性
(U/mL)
提高率
(%)
青年小鼠空白对照
—
, 百拇医药
28.3±2.1***
—
老年小鼠空白对照
—
16.3±1.8
—
老年鼠DNA高剂量
120
22.9±1.9***
40.5
老年鼠DNA低剂量
60
, 百拇医药
21.4±1.8***
31.3
老年小鼠Vit E
120
22.7±2.2***
39.3
与老年小鼠空白对照组比较：***P<0.001
由表3可见，老龄小鼠血中GSH-Px活性比青年小鼠明显降低，其活力只有青年小鼠的57.6%，老龄小鼠服用鲤鱼精巢DNA或Vit E后，其GSH-Px活力明显提高。
3 讨论
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SOD、CAT、POD、GSH-Px是动物机体内的抗氧化酶，其作用是清除自由基，防止自由基对细胞结构的损伤，它们的活性随着年龄的增长而下降，因此是老化负相关酶，测定它们的活性可以反映动物的衰老状况。随着年龄的增长，抗氧化酶清除活性氧自由基的能力逐渐下降，从而引起活性氧自由基及脂质过氧化产物日益增多，最终导致机体衰老和老年性疾病的发生[7]。抗氧化酶的增龄性失活可能是由于编码抗氧化酶的基因及抗氧化酶本身受到自由基损伤所致[8，9]，老龄动物机体内由于抗氧化酶活力不足，细胞生命活动过程中产生的自由基不能得到有效的清除，自由基不断损伤细胞的结构，损伤的不断积累最终导致细胞衰亡和动物机体的衰老。老龄小鼠服用鲤鱼精巢DNA一段时期以后，其体内的SOD、CAT、POD、GSH-Px活性均显著提高，因而其衰老的速度得到一定程度的遏制。鲤鱼精巢DNA提高老龄小鼠体内抗氧化酶的活性的机制，可能是它能直接清除自由基，减少自由基对抗氧化酶的损伤，也可能是增加了抗氧化酶的表达，其具体作用机制正在研究之中。
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参考文献
1 唐孝礼，等.中山大学学报(自然科学版)，1998，37(增刊)：74
2 唐孝礼，等.中山大学学报(自然科学版)，1998，37(4)：125
3 唐孝礼，等.中国老年学杂志，1999，19(2)：101
4 陈 勤主编.抗衰老研究实验方法.北京：中国医药科技出版社，1996：458、501
5 荣征星，等.生物化学与生物物理进展，1994，21(4)：362
6 柯雪红，等.中国老年学杂志，1997，17(4)：205
7 Jung K, et al. Free Radic Biol Med, 1996,20(4):613
8 Hayakawa M, et al. Biochem Biophys Res Commun,1996,226(2):369
9 Filser N, et al. Biochem Biophys Res Commun,1997,233(1):102
收稿日期：1999-03-28, 百拇医药(唐孝礼* 颜光美 许实波 周永红)