胰头癌组织中PGGT基因研究
作者：沈洪薰 江 颖 王志伟 邵苏吉 芮 理 郑震林 朱远源 陈玉泉 王惠民
单位：南通医学院附属医院普外科 江苏省南通市 226001
关键词：胰腺肿瘤；γ-谷氨酰转移酶基因；核苷酸序列
世界华人消化杂志990834 中国图书馆分类号 R735.9
Subject headings pancreatic neoplasms; γ-glutamyl transferase gene; nucleotide sequence
胰头癌患者的血清中，一种胰源性γ-谷氨酰转移酶(Pancreatic Gamma-Glutamyl Transferase, PGGT)异常升高，应用血清PGGT，PGGT/TGGT诊断胰头癌阳性率62.5%[1]. 应用杂交瘤技术制备人胰腺的γ GT(PGGT)mAB，诊断胰头癌，诊断正确率高达99.6%[2]. 为了探讨PGGT与胰头癌发生和发展关系，对胰头癌组织中PGGT基因进行研究，发现胰头癌组织中PGGT基因与人胰腺GGT具有同源性，但PGGT基因表达量增高，现报告如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 胰头癌组织标本3例，壶腹部癌组织标本2例，胆管癌组织标本2例. 人肝组织标本2例，人肾组织标本2例，人胰腺组织标本3例，均取自南通医学院附属医院普外科及肿瘤外科手术切除标本.胚肝、胚胰取自22wk流产胎儿，来自于南通医学院附属医院妇产科. 所有标本均离体后迅速置液氮保存. Trizol试剂购于Gibco公司；5×First stand Buffer, 0.1mol/L DTT，10mmol/L dNTP mix, SuperscriptTMⅡ，E.ColiRNase H购于GIBCOBRL；10×PCR Buffer, 50mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP，Taq酶购于GIBCO BRL；ECOR I，NotⅠ酶购于GIBCO BRL；丙烯酰胺、N-N＇亚甲基双丙烯酰胺购于Sigma公司；PGEM 7Zf(+)DNA/Hae Ⅲ Markers购于上海华美公司；TA克隆试剂盒，购于Promega公司；第一对引物由上海Sangon公司合成. 上游引物序列5＇>CGTGCTGGCCC_TCATCCTCA<3＇，下游引物序列5＇>CTGACCGGGGAG_CGGACCT<3＇，扩增片段长度约387bp. 第二对引物由美国Clontech york.Y.Zhu提供. 上游引物序列5＇>AGCGGGCCC_GTGCTGGCCCTCATCCTCA<3＇，下游引物序列5＇>AGGATC_CCGCTGACCGGGGAGCGGACCT<3＇，PCR仪为美国PE 2400；TGL-16G台式高速冷冻离心机由上海安亭科学仪器厂生产；752紫外光栅分光光度仪；Dy-A垂直电泳仪，由上海康达电子仪器厂生产.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取 切取组织80mg，加Trizol试剂1mL，于冰浴中匀浆；置1.5mL离心管，15℃～30℃水浴5min，加0.2mL氯仿，摇15s，置水浴15℃～30℃ 3min，离心12000r/min，15min；转移上清，加0.5mL异丙醇，孵育15℃～30℃ 15min，离心12000r/min，10min；弃去上清，加750mL/L乙醇1mL，混匀，离心12000r/min，5min；测定A(吸光度)，计算胰头癌组织中总RNA.
1.2.2 cDNA合成 将微量离心管中加入1uL oligo(dT)12～18(500mg/L)，5ug RNA，加灭菌水至总体积20uL混匀；加热70℃，10min；冰上快速冷却；加入4uL 5xFirst Stand Buffer, 2uL 0.1mol/L DTT，1uL 2.5mmol/L dNTP Mix，轻轻混匀；42℃孵育2min；加1uL Superscipt TMⅡ，用吸头轻轻混匀；42℃孵育50min；加热70℃，15min，加1uL E Coli RNase H；孵育37℃，20min. 将RNA逆转录成cDNA.
, http://www.100md.com
1.2.3 PCR扩增 在0.5mL离心管中加入10XPCR Buffer 5uL；2.5mmol/L dNTP 2uL；50mmol/L MgCl2 1uL；5＇端引物3uL；3＇端引物3uLTaq酶(5Mu/L)0.5uL；cDNA 3uL；灭菌水32.5uL，置PCR仪. 用第一对引物扩增条件：94℃预变性、4min，94℃变性、1min→55℃退火、1.5min→72℃延伸、1.5min，40个循环. 第二对引物扩增条件：95℃预变性20s；95℃变性5s→72℃ 退火、延伸2min，5个循环；95℃变性5s→67℃退火、延伸2min 25个循环. 70g/L聚丙烯胺凝胶电泳(非变性胶)：将各PCR产物进行聚丙烯胺凝胶电泳80V 4h，用PGEM，7Zf(+)DNA Hae Ⅲ Marker作标准，经溴化乙锭染色在紫外灯下观察(图2). 凝胶DNA回收：用刀切将凝胶中DNA片段切下，放入1.5mL离心管中；压碎凝胶，加入60uL洗脱缓冲液；盖紧管盖，在37℃下轻摇. 洗脱3h～4h；4℃离心12000r/min，1min，转移上清；再加20uL洗脱缓冲液，混匀后离心，合并两部分上清；加2.5倍体积无水乙醇，置-20℃，30min；离心12000r/min，10min，回收沉淀的DNA；用200uL TE溶解DNA，等体积酚和氯仿各抽提1次，将水相转移至另一离心管中；将1/10体积的3mol乙酸钠和2.5倍体积的乙醇再次沉淀DNA，置-20℃ 30min；离心12000r/min，15min，弃上清；用700mL/L乙醇淋洗沉淀，加20uL水溶解.
, 百拇医药
1.2.4 TA克隆 将回收DNA进行PCR，电泳证实为一条带后进行连接反应. 在1.5mL离心管中加入；PCR产物3uL；Ligation Buffer 1.2uL；Ligase 1.0uL；PGEM TA Vector 0.8uL；灭菌水6uL. 置14℃，16h～20h，取连接产物5uL加100uL钙化菌，置冰浴30min. 42℃，90s. 置冰浴1.5min. 加LB培养基200uL，置37℃ 45min后，平铺于含X-gal-IPTG及氨基苄青霉素培养板上，37℃温箱过夜. 从平板上挑取白色单菌落置3mL含氨基苄青霉素的LB培养基中，置37℃摇床振摇过夜.
1.2.5 质粒提取 试剂及配制：溶液Ⅰ：葡萄糖1.982g；双蒸去离子水160mL；0.5mol/L EDTA(PH8.0)4mL；1mol/L Tris-CL(pH 8.0). 用双蒸去离子水定容至200mL. 高压下蒸气灭菌15min，4℃保存. 溶液Ⅱ：2mol/L NaoH 1mL，双蒸去离子水8mL；10%SDS 1mL. 溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾60mL；冰乙酸11.5mL；双蒸去离子水28.5mL定容量至100mL. 溶液Ⅳ：3mol/L乙酸钠(pH 5.2)：乙酸钠204.1g加双蒸去离子水200mL，用冰乙酸调pH (5.2)，用双蒸去离子水定容至500mL. 方法：取1.5mL菌液置1.5mL离心管中，离心10000r/min，30s；弃上清，弃尽；加溶液Ⅰ100uL，重悬菌体；加溶液Ⅱ 200uL，倒转混匀；加溶液Ⅲ 150uL混匀；离心10000r/min，5min；转移上清至另一离心管中；加等体积平衡酚，混匀，室温，离心，5000r/min，3min；小心吸取上清液，转移至另一离心管中；等体积氯仿抽提1次；离心5000r/min，5min；转移上清液至另一离心管中；加2.5倍体积无水乙醇混匀；室温放置2min；离心10000r/min，15min；弃上清，留沉淀，700mL/L乙醇洗1次；离心8000r/min，5min；弃上清、留沉淀，自然干燥.
, 百拇医药
1.2.6 酶切及DNA测序 取10×REACT 1.5uL；EcoRⅠ酶0.5uL质粒2uL；双蒸去离子水10.5uL RNA酶A 0.5uL. 置1.5mL离心管，37℃水浴1h. 将酶切产物进行聚丙烯凝胶电泳，证实为预期条带后，将质粒进行测序.
2 结果
胰头癌(3例)正常人胰腺(2例)组织中γ_GT的RNA 20g/L琼脂糖电泳显示胰头癌组织PGGT和正常人胰腺GGT的RNA有二条带，为28S和18S.
2.1 胰头癌组织PGGT基因片段cDNA的核苷酸序列 第1次将2例胰头癌组织中提取PGGT基因片段质粒cDNA通过酶切鉴定，证实为插入片段，为目的基因后，进行cDNA的核苷酸序列测定. 质粒标本直接邮寄给美国Clontech Laboratories公司，york.y.Zhu，结果发现胰头癌组织提取PGGT基因片段cDNA的核苷酸序列B3和B4，和胰头癌组织提取的B8和B9与人胰腺GGT基因cDNA核苷酸序列1210～1596相一致. 第2次为3例胰头癌组织提取总RNA，邮寄给美国CLONTECH Laboratories公司，york, y, Zhu，检测结果发现3例胰头癌组织提取PGGT基因片段cDNA的核苷酸序列：A1序列为使用3＇PGGT引物显示的cDNA；B1序列为使用5＇PGGT引物显示的cDNA；C1序列为使用5＇PGGT引物和3＇PGGT引物显示的cDNA，与人胰腺GGT基因cDNA的核苷酸1202-1605相一致. 二次胰头癌组织中PGGT基因片段cDNA与人胰腺GGT基因片段cDNA的核苷酸序列相同的，同源性100%.
, http://www.100md.com
2.2 胰头癌组织PGGT基因过度表达 PCR产物聚丙烯胺电泳：本组3例胰头癌组织，2例胆管癌组织和2例正常人胰腺标本总RNA提取，逆转录成cDNA，PCR扩增，PCR产物聚丙烯胺电泳，显示不同组织PCR扩增片段，碱基数目相同，在同一水平面上. PCR产物20g/L琼脂糖电泳：本组3例胰头癌组织、2例胆管癌组织和2例人正常胰腺标本总RNA提取，逆转录成cDNA，PCR扩增，PCR产物20g/L琼脂糖电泳，加入G3PD内参，应用SX-100图象处理系统进行扫描(见表1)，显示胰头癌组3例PGGT基因表达高于2例胆管癌和2例人正常胰腺GGT基因(t=17.02，P<0.01)，这表明胰头癌组织中PGGT基因呈过表达.
表1 胰头癌组织PGGT基因扩增片段的光密度图象扫描结果 序号
标本灰度值(均值)
G3PD灰度值(均值)
, http://www.100md.com
标本/G3PD(均值)(%)
胰头癌组
Ⅰ胰头癌
15438
24585
62.79
Ⅱ胰头癌
15114 (15155)
23868 (24247)
63.32 (62.5)
Ⅲ胰头癌
14912
, http://www.100md.com
24288
61.39
胆管癌组
Ⅳ胆管癌
10560
27580
38.28
Ⅴ胆管癌
9141 (9850)
27300 (27440)
33.48 (35.88)
正常胰组
, http://www.100md.com
Ⅵ正常胰
9735
29636
32.84
Ⅶ正常胰
8024 (8880)
30816 (30226)
26.04 (29.44)
t=17.02，P<0.01.
3 讨论
一个典型的哺乳动物细胞约含10pg RNA，其中80%～85%为rRNA (主要是28S，18S和5S三种类型)其余15%～20%主要由各种类型的低分子RNA组成(为tRNA，核内小分子RNA等)这些RNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，并能用电泳加以分离纯化，mRNA与上述RNA不同，其含量为细胞总RNA的1%～5%，大小和核苷酸序列各不相同. 本结果显示胰头癌和胰腺RNA见28S和18S两条带. 这说明组织标本RNA末被降解，为检测cDNA的核苷酸序列提供条件. Laperchey报告鼠GGT，它有2072bp，5＇端非编码区227，可读框架1707bp和3＇端非编码区138bp. 有关人GGT基因研究报告不多，人胰腺GGT基因cDNA的核苷酸序列，Courtay et al[3]作过研究，它有2244bp，其中包含了5＇非编码区358bp，可读框架1710bp和3＇非编码区156bp(内含20bp poly(A)尾巴)，并发现编码蛋白的可读框架与人胎盘和肝细胞瘤Hep G2的GGT相同. 为本研究提供技术路线和研究方法. 有关人胰头癌GGT基因研究，国内外文献尚未见报道. 检索GenBank数据库未发现其他组织来源GGT与胰源性GGT(PGGT)之间有差异，组织同源性100%. 我们参照COURTAY报告人胰腺GGT基因cDNA核苷酸序列的检测方法，对胰头癌、胆管癌和人胰腺组织GGT基因片段cDNA核苷酸进行研究，在人胰GGT可读框架区内，请上海Sangon公司合成第一对引物，上游引物序列为5＇>CGTGCTGGCCCTCATCCTCA<3＇，下游引物序列为5＇>GGACCGGGGACGGACCT<3＇. 我们把胰头癌1和胰头癌2组织中提取的质粒邮寄美国Clontech Laboratories公司，经检测胰头癌1组织的B3，B4和胰头癌2组织B8，B9的PGGT基因片段cDNA的核苷酸序列，发现胰头癌组织中PGGT与人胰GGT基因片段cDNA核苷酸序列1210～1596完全相同，在这区域内无碱基插入与碱基的缺失. 为此，我们又请Zhu提供第二对引物，上游引物序列：5＇>AGCGGGCCCGTGCTGG_CCCTCATCCTCA<3＇，下游引物序列：5＇>AGGATCCCGCT_GACCGGGGAGCGGACCT<3＇，检测了3例胰头癌组织的GGT基因片段cDNA核苷酸序列A1，B1和C1，结果发现胰头癌与人胰腺GGT基因片段cDNA的核苷酸序列1202～1605完全相同，在这区域内无碱基插入与碱基缺失，3例胰头癌组织二次PGGT基因片段cDNA的核苷酸序列与人胰腺GGT基因片段cDNA的核苷酸序列均相同，证明它与人胰腺GGT基因是相同的，同源性100%.
, 百拇医药
胰头癌组织PGGT基因表达量增高. 本研究结果，对3例胰头癌，2例胆管癌和2例正常人胰腺标本经总RNA提取，逆转录成cDNA，PCR扩增和PCR扩增产物2%琼脂糖电泳，加入内参G3PD应用光密度图象扫描仪进行扫描，结果显示胰头癌PGGT基因表达高于胆管癌和正常人胰腺. 这一结果阐明胰头癌患者血清中PGGT升高机制，可能为胰头癌组织中PGGT过表达，由于胰胆管梗阻而反流入血所致.
研究PGGT基因对了解胰头癌的发生发展有着十分重要意义. 其一，可作为诊断胰头癌的临床指标，血清PGGT，PGGT/TGGT诊断胰头癌阳性率高；其二，可作为阻塞性黄疸的鉴别诊断指标. 肝外胆管恶性阻塞性黄疸常见原因为胰头癌和胆管癌，本研究结果胰头癌组织PGGT基因表达高于胆管癌，这解释血清PGGT可鉴别胰头癌和胆管癌. 其三，可作为胰头癌发生发展的观察指标，在临床诊断中我们发现随着胰头癌的发展、血清PGGT升高呈现递增趋势.
国家自然基金资助课题 No. 39570693
, http://www.100md.com
通讯作者 沈洪薰
4 参考文献
1 沈洪薰，陈玉泉. 血清PGGT，PGGT/TGGT诊断胰头癌的临床价值(附40例胰头癌分析)中华外科杂志，1991；1：63
2 蔡兵，陈玉泉，沈洪薰. 人胰腺γ-GT酶单克隆抗体诊断胰头癌. 中华实验外科杂志，1996；13：267
3 Courtay，C. Oster，T. Michelet F. r-Glutamyltransferase: Nucleotide sequence of the human pancreatic cDNA. Biochemical Pharmacology, 1992;43:2527-2533ISSN 1007-9319 CN 14-1218/R 世界华人消化杂志，1999;7(8):714
收稿日期 1999-04-08 修回日期 1999-06-06, 百拇医药
单位：南通医学院附属医院普外科 江苏省南通市 226001
关键词：胰腺肿瘤；γ-谷氨酰转移酶基因；核苷酸序列
世界华人消化杂志990834 中国图书馆分类号 R735.9
Subject headings pancreatic neoplasms; γ-glutamyl transferase gene; nucleotide sequence
胰头癌患者的血清中，一种胰源性γ-谷氨酰转移酶(Pancreatic Gamma-Glutamyl Transferase, PGGT)异常升高，应用血清PGGT，PGGT/TGGT诊断胰头癌阳性率62.5%[1]. 应用杂交瘤技术制备人胰腺的γ GT(PGGT)mAB，诊断胰头癌，诊断正确率高达99.6%[2]. 为了探讨PGGT与胰头癌发生和发展关系，对胰头癌组织中PGGT基因进行研究，发现胰头癌组织中PGGT基因与人胰腺GGT具有同源性，但PGGT基因表达量增高，现报告如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 胰头癌组织标本3例，壶腹部癌组织标本2例，胆管癌组织标本2例. 人肝组织标本2例，人肾组织标本2例，人胰腺组织标本3例，均取自南通医学院附属医院普外科及肿瘤外科手术切除标本.胚肝、胚胰取自22wk流产胎儿，来自于南通医学院附属医院妇产科. 所有标本均离体后迅速置液氮保存. Trizol试剂购于Gibco公司；5×First stand Buffer, 0.1mol/L DTT，10mmol/L dNTP mix, SuperscriptTMⅡ，E.ColiRNase H购于GIBCOBRL；10×PCR Buffer, 50mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP，Taq酶购于GIBCO BRL；ECOR I，NotⅠ酶购于GIBCO BRL；丙烯酰胺、N-N＇亚甲基双丙烯酰胺购于Sigma公司；PGEM 7Zf(+)DNA/Hae Ⅲ Markers购于上海华美公司；TA克隆试剂盒，购于Promega公司；第一对引物由上海Sangon公司合成. 上游引物序列5＇>CGTGCTGGCCC_TCATCCTCA<3＇，下游引物序列5＇>CTGACCGGGGAG_CGGACCT<3＇，扩增片段长度约387bp. 第二对引物由美国Clontech york.Y.Zhu提供. 上游引物序列5＇>AGCGGGCCC_GTGCTGGCCCTCATCCTCA<3＇，下游引物序列5＇>AGGATC_CCGCTGACCGGGGAGCGGACCT<3＇，PCR仪为美国PE 2400；TGL-16G台式高速冷冻离心机由上海安亭科学仪器厂生产；752紫外光栅分光光度仪；Dy-A垂直电泳仪，由上海康达电子仪器厂生产.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取 切取组织80mg，加Trizol试剂1mL，于冰浴中匀浆；置1.5mL离心管，15℃～30℃水浴5min，加0.2mL氯仿，摇15s，置水浴15℃～30℃ 3min，离心12000r/min，15min；转移上清，加0.5mL异丙醇，孵育15℃～30℃ 15min，离心12000r/min，10min；弃去上清，加750mL/L乙醇1mL，混匀，离心12000r/min，5min；测定A(吸光度)，计算胰头癌组织中总RNA.
1.2.2 cDNA合成 将微量离心管中加入1uL oligo(dT)12～18(500mg/L)，5ug RNA，加灭菌水至总体积20uL混匀；加热70℃，10min；冰上快速冷却；加入4uL 5xFirst Stand Buffer, 2uL 0.1mol/L DTT，1uL 2.5mmol/L dNTP Mix，轻轻混匀；42℃孵育2min；加1uL Superscipt TMⅡ，用吸头轻轻混匀；42℃孵育50min；加热70℃，15min，加1uL E Coli RNase H；孵育37℃，20min. 将RNA逆转录成cDNA.
, http://www.100md.com
1.2.3 PCR扩增 在0.5mL离心管中加入10XPCR Buffer 5uL；2.5mmol/L dNTP 2uL；50mmol/L MgCl2 1uL；5＇端引物3uL；3＇端引物3uLTaq酶(5Mu/L)0.5uL；cDNA 3uL；灭菌水32.5uL，置PCR仪. 用第一对引物扩增条件：94℃预变性、4min，94℃变性、1min→55℃退火、1.5min→72℃延伸、1.5min，40个循环. 第二对引物扩增条件：95℃预变性20s；95℃变性5s→72℃ 退火、延伸2min，5个循环；95℃变性5s→67℃退火、延伸2min 25个循环. 70g/L聚丙烯胺凝胶电泳(非变性胶)：将各PCR产物进行聚丙烯胺凝胶电泳80V 4h，用PGEM，7Zf(+)DNA Hae Ⅲ Marker作标准，经溴化乙锭染色在紫外灯下观察(图2). 凝胶DNA回收：用刀切将凝胶中DNA片段切下，放入1.5mL离心管中；压碎凝胶，加入60uL洗脱缓冲液；盖紧管盖，在37℃下轻摇. 洗脱3h～4h；4℃离心12000r/min，1min，转移上清；再加20uL洗脱缓冲液，混匀后离心，合并两部分上清；加2.5倍体积无水乙醇，置-20℃，30min；离心12000r/min，10min，回收沉淀的DNA；用200uL TE溶解DNA，等体积酚和氯仿各抽提1次，将水相转移至另一离心管中；将1/10体积的3mol乙酸钠和2.5倍体积的乙醇再次沉淀DNA，置-20℃ 30min；离心12000r/min，15min，弃上清；用700mL/L乙醇淋洗沉淀，加20uL水溶解.
, 百拇医药
1.2.4 TA克隆 将回收DNA进行PCR，电泳证实为一条带后进行连接反应. 在1.5mL离心管中加入；PCR产物3uL；Ligation Buffer 1.2uL；Ligase 1.0uL；PGEM TA Vector 0.8uL；灭菌水6uL. 置14℃，16h～20h，取连接产物5uL加100uL钙化菌，置冰浴30min. 42℃，90s. 置冰浴1.5min. 加LB培养基200uL，置37℃ 45min后，平铺于含X-gal-IPTG及氨基苄青霉素培养板上，37℃温箱过夜. 从平板上挑取白色单菌落置3mL含氨基苄青霉素的LB培养基中，置37℃摇床振摇过夜.
1.2.5 质粒提取 试剂及配制：溶液Ⅰ：葡萄糖1.982g；双蒸去离子水160mL；0.5mol/L EDTA(PH8.0)4mL；1mol/L Tris-CL(pH 8.0). 用双蒸去离子水定容至200mL. 高压下蒸气灭菌15min，4℃保存. 溶液Ⅱ：2mol/L NaoH 1mL，双蒸去离子水8mL；10%SDS 1mL. 溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾60mL；冰乙酸11.5mL；双蒸去离子水28.5mL定容量至100mL. 溶液Ⅳ：3mol/L乙酸钠(pH 5.2)：乙酸钠204.1g加双蒸去离子水200mL，用冰乙酸调pH (5.2)，用双蒸去离子水定容至500mL. 方法：取1.5mL菌液置1.5mL离心管中，离心10000r/min，30s；弃上清，弃尽；加溶液Ⅰ100uL，重悬菌体；加溶液Ⅱ 200uL，倒转混匀；加溶液Ⅲ 150uL混匀；离心10000r/min，5min；转移上清至另一离心管中；加等体积平衡酚，混匀，室温，离心，5000r/min，3min；小心吸取上清液，转移至另一离心管中；等体积氯仿抽提1次；离心5000r/min，5min；转移上清液至另一离心管中；加2.5倍体积无水乙醇混匀；室温放置2min；离心10000r/min，15min；弃上清，留沉淀，700mL/L乙醇洗1次；离心8000r/min，5min；弃上清、留沉淀，自然干燥.
, 百拇医药
1.2.6 酶切及DNA测序 取10×REACT 1.5uL；EcoRⅠ酶0.5uL质粒2uL；双蒸去离子水10.5uL RNA酶A 0.5uL. 置1.5mL离心管，37℃水浴1h. 将酶切产物进行聚丙烯凝胶电泳，证实为预期条带后，将质粒进行测序.
2 结果
胰头癌(3例)正常人胰腺(2例)组织中γ_GT的RNA 20g/L琼脂糖电泳显示胰头癌组织PGGT和正常人胰腺GGT的RNA有二条带，为28S和18S.
2.1 胰头癌组织PGGT基因片段cDNA的核苷酸序列 第1次将2例胰头癌组织中提取PGGT基因片段质粒cDNA通过酶切鉴定，证实为插入片段，为目的基因后，进行cDNA的核苷酸序列测定. 质粒标本直接邮寄给美国Clontech Laboratories公司，york.y.Zhu，结果发现胰头癌组织提取PGGT基因片段cDNA的核苷酸序列B3和B4，和胰头癌组织提取的B8和B9与人胰腺GGT基因cDNA核苷酸序列1210～1596相一致. 第2次为3例胰头癌组织提取总RNA，邮寄给美国CLONTECH Laboratories公司，york, y, Zhu，检测结果发现3例胰头癌组织提取PGGT基因片段cDNA的核苷酸序列：A1序列为使用3＇PGGT引物显示的cDNA；B1序列为使用5＇PGGT引物显示的cDNA；C1序列为使用5＇PGGT引物和3＇PGGT引物显示的cDNA，与人胰腺GGT基因cDNA的核苷酸1202-1605相一致. 二次胰头癌组织中PGGT基因片段cDNA与人胰腺GGT基因片段cDNA的核苷酸序列相同的，同源性100%.
, http://www.100md.com
2.2 胰头癌组织PGGT基因过度表达 PCR产物聚丙烯胺电泳：本组3例胰头癌组织，2例胆管癌组织和2例正常人胰腺标本总RNA提取，逆转录成cDNA，PCR扩增，PCR产物聚丙烯胺电泳，显示不同组织PCR扩增片段，碱基数目相同，在同一水平面上. PCR产物20g/L琼脂糖电泳：本组3例胰头癌组织、2例胆管癌组织和2例人正常胰腺标本总RNA提取，逆转录成cDNA，PCR扩增，PCR产物20g/L琼脂糖电泳，加入G3PD内参，应用SX-100图象处理系统进行扫描(见表1)，显示胰头癌组3例PGGT基因表达高于2例胆管癌和2例人正常胰腺GGT基因(t=17.02，P<0.01)，这表明胰头癌组织中PGGT基因呈过表达.
表1 胰头癌组织PGGT基因扩增片段的光密度图象扫描结果 序号
标本灰度值(均值)
G3PD灰度值(均值)
, http://www.100md.com
标本/G3PD(均值)(%)
胰头癌组
Ⅰ胰头癌
15438
24585
62.79
Ⅱ胰头癌
15114 (15155)
23868 (24247)
63.32 (62.5)
Ⅲ胰头癌
14912
, http://www.100md.com
24288
61.39
胆管癌组
Ⅳ胆管癌
10560
27580
38.28
Ⅴ胆管癌
9141 (9850)
27300 (27440)
33.48 (35.88)
正常胰组
, http://www.100md.com
Ⅵ正常胰
9735
29636
32.84
Ⅶ正常胰
8024 (8880)
30816 (30226)
26.04 (29.44)
t=17.02，P<0.01.
3 讨论
一个典型的哺乳动物细胞约含10pg RNA，其中80%～85%为rRNA (主要是28S，18S和5S三种类型)其余15%～20%主要由各种类型的低分子RNA组成(为tRNA，核内小分子RNA等)这些RNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，并能用电泳加以分离纯化，mRNA与上述RNA不同，其含量为细胞总RNA的1%～5%，大小和核苷酸序列各不相同. 本结果显示胰头癌和胰腺RNA见28S和18S两条带. 这说明组织标本RNA末被降解，为检测cDNA的核苷酸序列提供条件. Laperchey报告鼠GGT，它有2072bp，5＇端非编码区227，可读框架1707bp和3＇端非编码区138bp. 有关人GGT基因研究报告不多，人胰腺GGT基因cDNA的核苷酸序列，Courtay et al[3]作过研究，它有2244bp，其中包含了5＇非编码区358bp，可读框架1710bp和3＇非编码区156bp(内含20bp poly(A)尾巴)，并发现编码蛋白的可读框架与人胎盘和肝细胞瘤Hep G2的GGT相同. 为本研究提供技术路线和研究方法. 有关人胰头癌GGT基因研究，国内外文献尚未见报道. 检索GenBank数据库未发现其他组织来源GGT与胰源性GGT(PGGT)之间有差异，组织同源性100%. 我们参照COURTAY报告人胰腺GGT基因cDNA核苷酸序列的检测方法，对胰头癌、胆管癌和人胰腺组织GGT基因片段cDNA核苷酸进行研究，在人胰GGT可读框架区内，请上海Sangon公司合成第一对引物，上游引物序列为5＇>CGTGCTGGCCCTCATCCTCA<3＇，下游引物序列为5＇>GGACCGGGGACGGACCT<3＇. 我们把胰头癌1和胰头癌2组织中提取的质粒邮寄美国Clontech Laboratories公司，经检测胰头癌1组织的B3，B4和胰头癌2组织B8，B9的PGGT基因片段cDNA的核苷酸序列，发现胰头癌组织中PGGT与人胰GGT基因片段cDNA核苷酸序列1210～1596完全相同，在这区域内无碱基插入与碱基的缺失. 为此，我们又请Zhu提供第二对引物，上游引物序列：5＇>AGCGGGCCCGTGCTGG_CCCTCATCCTCA<3＇，下游引物序列：5＇>AGGATCCCGCT_GACCGGGGAGCGGACCT<3＇，检测了3例胰头癌组织的GGT基因片段cDNA核苷酸序列A1，B1和C1，结果发现胰头癌与人胰腺GGT基因片段cDNA的核苷酸序列1202～1605完全相同，在这区域内无碱基插入与碱基缺失，3例胰头癌组织二次PGGT基因片段cDNA的核苷酸序列与人胰腺GGT基因片段cDNA的核苷酸序列均相同，证明它与人胰腺GGT基因是相同的，同源性100%.
, 百拇医药
胰头癌组织PGGT基因表达量增高. 本研究结果，对3例胰头癌，2例胆管癌和2例正常人胰腺标本经总RNA提取，逆转录成cDNA，PCR扩增和PCR扩增产物2%琼脂糖电泳，加入内参G3PD应用光密度图象扫描仪进行扫描，结果显示胰头癌PGGT基因表达高于胆管癌和正常人胰腺. 这一结果阐明胰头癌患者血清中PGGT升高机制，可能为胰头癌组织中PGGT过表达，由于胰胆管梗阻而反流入血所致.
研究PGGT基因对了解胰头癌的发生发展有着十分重要意义. 其一，可作为诊断胰头癌的临床指标，血清PGGT，PGGT/TGGT诊断胰头癌阳性率高；其二，可作为阻塞性黄疸的鉴别诊断指标. 肝外胆管恶性阻塞性黄疸常见原因为胰头癌和胆管癌，本研究结果胰头癌组织PGGT基因表达高于胆管癌，这解释血清PGGT可鉴别胰头癌和胆管癌. 其三，可作为胰头癌发生发展的观察指标，在临床诊断中我们发现随着胰头癌的发展、血清PGGT升高呈现递增趋势.
国家自然基金资助课题 No. 39570693
, http://www.100md.com
通讯作者 沈洪薰
4 参考文献
1 沈洪薰，陈玉泉. 血清PGGT，PGGT/TGGT诊断胰头癌的临床价值(附40例胰头癌分析)中华外科杂志，1991；1：63
2 蔡兵，陈玉泉，沈洪薰. 人胰腺γ-GT酶单克隆抗体诊断胰头癌. 中华实验外科杂志，1996；13：267
3 Courtay，C. Oster，T. Michelet F. r-Glutamyltransferase: Nucleotide sequence of the human pancreatic cDNA. Biochemical Pharmacology, 1992;43:2527-2533ISSN 1007-9319 CN 14-1218/R 世界华人消化杂志，1999;7(8):714
收稿日期 1999-04-08 修回日期 1999-06-06, 百拇医药