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编号:10233565
消化系统癌肿的自杀基因疗法
http://www.100md.com 《世界华人消化杂志》 1999年第8期
     作者:徐克成 吴建文

    单位:深圳养和医疗中心 广东省深圳市 518051;吴建文 Laboratory of Molecular and Cellular Biology, National Institute of Diabetes, Digestives and Kidney disease, NIH, MD, 20892-0840, USA

    关键词:消化系统肿瘤/治疗;自杀基因;基因疗法

    世界华人消化杂志990813

    主题词

    中国图书馆分类号 R735

    Subject headings digestive system neoplasms/therapy; suicide gene; gene therapy
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    在恶性肿瘤的各种基因治疗中,自杀基因(suicide gene)/前药(prodrug)系统备受关注. 目前已在多种肿瘤进行大量临床前研究,有的已进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验. 该疗法对消化系肿瘤的治疗作用,业已得到证明[1]. 不管哪一种自杀基因/前药系统,均需有下列3个成分:①能编码一种酶的自杀基因:该基因通常来源于病毒或真核细胞,其编码的酶能将无毒的前药转变为活性毒物,引起靶细胞死亡;在缺乏前药的条件下,该种基因的表达对机体无害;该基因编码的酶对基质(前药)应具有高度催化效能(高Kcat)[2]. ②基因转移载体(gene-transfer Vectors):为了转移自杀基因至靶细胞,一般采用基因工程改造的逆转录病毒(retroviruses)、腺病毒(adenoviruses)和腺病毒相关性病毒(adenovirus-associated viruses)作为载体[3]. 也有人采用阳离子脂质体作为载体,发现其对内皮细胞有高度亲和力[4]. 基因转移的关键是其靶向性(targeting)[5]. 如将甲胎蛋白(AFP)启动子和清蛋白增强子(Alb)TRS连接自杀基因,则后者便仅于表达AFP的肝癌细胞中表达,而不影响正常肝细胞[6]. ③能被自杀基因编码的酶作用的前药(prodrug):这种前药在自杀基因不存在时,对机体无毒或仅有微小毒性,而在自杀基因编码的酶特异性作用下,前药转化为活性药物,后者的细胞毒性较无活性的前药至少强100倍.
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    1 自杀基因/前药系统

    1.1 单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊环鸟苷(HSV-tk/GCV)系统 表达单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶(herpes simplex virus-1 thymidine kinase, HSV-tk)的小鼠成纤维细胞,对戊环鸟苷(ganciclovir, GCV)的敏感性较野生型细胞强1000倍,在BALB/c小鼠,给予GCV,可使表达HSV-tk的肉瘤和Abelson白血病病毒性淋巴瘤完全退缩. 上述发现奠定了HSV-tk/GCV系统的基础. GCV本身无毒性,在HSV-tk作用下,变成GCV单磷酸盐(GCV-MP),再经内源性细胞激酶作用,迅速转化为其二磷酸-(GCV-DP)和三磷酸盐(GCV-TP),后者对增殖中的哺乳细胞具有高度毒性. 虽然哺乳动物细胞胸腺嘧啶激酶也能催化GCV的转化,但HSV-tk的作用比其强200倍. GCV-TP具有羟基,能插入DNA链中,引起碱基配对错误、DNA断裂、姐姝染色单体交换和致死性基因失稳定[7];GCV-TP尚能抑制DNA聚合酶,进一步阻止DNA合成[8]. 在暴露于GCV后,表达HSV-tk的哺乳动物细胞内迅速聚集GCV磷酸盐,而未表达HSV-tk的野生型细胞则无GCV磷酸盐测得;将HSV-tk转染的细胞与3H标记的GCV一起孵育,发现放射性标记物迅速而稳定地掺入细胞DNA内. 应用IH核磁共振分光镜检测,发现肿瘤组织在HSV-tk/GCV治疗后,含胆碱物质的显性弥散系数减少50%,而迅速弥散性水成分的显性弥散系数增加219%,细胞内粘滞度明显增加,而大分子物质的流体动力学面积可能减少[9];动力学分析显示细胞内P53蛋白水平先增加,继之cyclin β1蛋白水平升高,细胞周期中止于S/G2[10]. 上述事实说明HSV tk/GCV引起肿瘤细胞凋亡. HSV-tk/GCV系统不仅能杀灭表达HSV tk的细胞,且具有显著的旁观者效应(bystander effect, BSE).
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    无论是体外抑或体内实验均观察到,GCV剂量越大,培养中的HSV-tk+细胞被杀灭的比例和肿瘤退缩率也越高,荷HSV-tk+瘤的动物生存期也越长. 至于HSV-tk本身的表达水平,一般与对GCV的敏感性不具有相关性,但不完全如此. 此外,细胞对HSV-tk/GCV的敏感性尚取决于担负着GCV二-和三磷酸化的细胞激酶的活性、细胞增殖速率以及将GCV-TP整合入DNA的DNA聚合酶活性[11]. 有人认为,GCV被HSV-tk+细胞摄取较慢,亲和力较差,不是很理想的HSV-tk基质[12]. Balzarini et al[13]发现,Elaidic acid ester GCV(E-GCV)的代谢物在HSV-tk+细胞内停留时间较GCV代谢物长1倍以上,且E-GCV在血浆中较GCV稳定,因此如用作HSV-tk系统的前药,其作用至少比GCV强10倍;Tong et al[14]发现,如果用无环鸟苷(acyclovir, ACV)代替GCV作为前药,并使用较GCV常用剂量高2.5~5.0倍的剂量,则引致的旁观者效应明显高于应用GCV作为前药时.
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    1.2 带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶/阿糖甲氧基嘌呤(VZV-tk/Ara-M)系统 与HSV-tk不同,带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(varicella zoster virus thymidine kinase, VZV-tk)对GCV亲和性甚弱,而对前药阿糖甲氧基嘌呤(6-methoxypurine arabinside, Ara-M)和溴乙烯基脱氧尿嘧啶(E)-5(2-bromovinyl)-2'-deoxyuridine ,BVdU)具有亲和力,能选择性催化二者磷酸化,再在细胞内酶作用下,最后生成三磷酸盐,分别为Ara-ATP和BVdU-TP[15]. 野生型细胞对高达1500μmol/L浓度的Ara-A和75μmol/L~250μmol/L浓度的BVdU均不敏感,而对表达VZV-tk的细胞,低至1μmol/L~100μmol/L浓度的Ara-M和0.06μmol/L~0.6μmol/L的BVdU即呈细胞毒性[16].

    1.3 胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5FC)系统 胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase, CD)系由大肠杆菌和某些霉菌表达的一种酶,不存在于哺乳动物细胞内,能催化胞嘧啶生成尿嘧啶. 抗霉菌药5氟胞嘧啶(5-fluorocytosine, 5FC)经CD脱氨后,生成5氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5FU),再经细菌内酶作用,生成氟脲嘧啶三磷酸盐(5-fluoro-5'-trip hosphate)和氟脱氧尿嘧啶单磷酸盐(5-fluoro-2'-deoxyuridine-5'-monophosphate, FdUMP). 后二者抑制胸苷酸合成酶(thynidylate synthase),阻抑DNA,RNA和蛋白合成,引致细胞死亡. 一般选用大肠杆菌的CD基因作为自杀基因. 应用5FC作为前药,有不少优点,例如,人的细胞酶不能使5FC脱氨,因此在通常剂量下5FC几无毒性;口服吸收良好(>80%);能透过血脑屏障等[1]. 表达CD的哺乳动物的细胞在暴露于5FC后. 细胞内迅速产生可测定水平的5FC,胸苷酸合成酶受抑,广泛形成RNA皱缩物(RNA adduts). 由CD/5FC介导的细胞死亡发生较HSV-tk/GCV引起者为慢[17],可能由于5FC被摄取和转化较慢所致. 但CD/5FC引起的细胞杀死作用不一定弱于HSV-tk/GCV,主要由于前者往往有更强的旁观者作用. 如同HSV-tk/GCV一样,前药5FC的细胞毒性作用也呈现剂量相关性,在某些敏感的细胞系如结肠癌,细胞毒性与CD表达呈正相关[18],但在对5FU不敏感的肉瘤细胞,此种相关性不明显,看来,细胞毒作用的强弱可能最终取决于特殊细胞系对5FU的内在敏感性. CD/5-FC系统也显示旁观者效应,与HSV/GCV时相似,但机制不同[19].
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    1.4 细胞色素P450微粒体酶CYP2B1/环磷酰胺(CYP2B1/CPA)系统 自大鼠肝分离出的细胞色素P450微粒体酶CYP2B1,能催化化疗药环磷酰胺(CPA)和异环磷酰胺(IFF),生成4羟环磷酰胺(4HC),再迅速转化为短寿命的烷基化物磷酰胺氮芥(phosphoramide mustard),引致细胞DNA损伤. 在体内,转染CYP2B1基因的细胞对CPA的敏感性较野生型细胞高15倍~20倍. 该系统具有中等强度的旁观者效应. 该系统对累及某些特殊部位如脑、脑膜的肿瘤可能具有特殊作用. CPA能自由地透过血脑屏障,但CPA转化为4HC主要发生于肝内,而4HC不易透过血脑屏障. 如将CYP2B1基因转导入脑瘤内,再给予CPA,则局部生成的4HC可对脑瘤发挥细胞毒作用. 在进行自身骨髓移植的肿瘤患者,可利用CYP2B1/CPA清除骨髓内瘤细胞. 4HC对正常造血细胞和肿瘤细胞均有毒性,如将表达CYP2B1的腺病毒载体转染骨髓,由于造血细胞缺乏腺病毒表面受体,因此仅有肿瘤细胞被CYP2B1基因有效地转染,从而被毒性4HC杀灭,而正常造血细胞不受危害[1].
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    1.5 细胞色素P450 CYP4B1/氨基蒽(CYP4B1/2AA)系统 免细胞色素P450 CYP4B1能选择性作用于前药氨基蒽(2-aminoanthracene, ZAA)或4-ipomeanol (4-IM),使之转化为活性物质烷化剂不饱和性或乙醛呋喃环氧化物(aldehyde furan epoxide[20]). 此种活化药物在很低浓度即显示高度DNA毒性. 体外实验表明,只要有1%的细胞表达CYB4B1,即有显著的旁观者效应.

    1.6 脱氧胞苷激酶/阿糖胞苷(dCK/Ara-C)系统 临床上发现,抗白血病的核苷酸类药物如阿糖胞苷(Ara-C)、2-氯脱氧腺苷(2CdA)和fludarabine的效应与白血病细胞表达脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase, dCK)的水平相关. 这些前药在细胞内活化的关键步骤是被dCK磷酸化. Ara-C虽为造血系统恶性肿瘤的有效药物,但对实体肿瘤作用有限. 人dCK能将Ara-C在细胞内磷酸化,使其细胞毒性增加. 有人用逆转录病毒或腺病毒,将dCK基因转染至神经胶质瘤细胞,使这些瘤细胞对Ara-C敏感性明显提高[21].
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    1.7 乌苷-黄嘌呤磷酸核糖基转移酶/6-硫黄嘌呤(gpt/6TX)系统 大肠杆菌的乌苷-黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(guanosine-xanthine phosphoribosyl transferase, gpt)基因表达产物,既能增强被转染细胞对硫黄嘌呤的敏感性,也能增强对mycophenolic acid、黄嘌呤和次嘌黄嘌呤的抗性,从而可对被转染细胞进行正、负选择. gpt能使6-硫黄嘌呤(6-thioxanthine, 6TX)和6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine, 6-TG)磷酸化,增加转染gpt基因细胞对该两种前药的敏感性. 鼠神经胶质瘤细胞被逆转录病毒转染gpt基因后,对6-TX的敏感性提高50倍~100倍.[22]. 给予无胸腺鼠颅内C6肿瘤内移植gpt-逆转录病毒载体产生细胞,随后给予6TX,引起肿瘤缩小80%,生存期较对照组明显延长[23].

    1.8 硝基还原酶/CB1954(NTR/CB1954)系统 大肠杆菌的硝基还原酶(nitroreductase, NTR)对基质5-(aziridin-1-yl)-2, 4-dinitrobenzamide (CB1954)具有高度催化活性,能迅速将其还原为一系列羟胺类烷化剂. 表达NTR的细胞对CB1954的敏感性较野生型细胞高500倍,且具有强大旁观者效应[24,25]. NTR也能激活一些抗菌药如硝基呋喃妥英(nitrofuratoin)和甲硝唑,使之具有细胞毒性,但不显示旁观者效应[25].
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    1.9 嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脱氧核苷(PNP/6-MeP-dR)系统 大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase, PNP)基因编码的酶能激活相对无毒性的6-甲基嘌呤脱氧核苷(6-methyl purine-deoxyriboside, 6-MeP-dR),生成高毒性的6-甲基嘌呤(6-methylpurine, 6-MeP). 用逆转录病毒载体将PNP基因转达给小鼠黑素瘤和乳癌细胞,再暴露于6-MeP-dR,发现黑素瘤细胞被选择性杀灭. 该系统具有强大旁观者效应,只要有1%的细胞表达PNP,即可引起大多数非转染细胞死亡.

    1.10 胸腺嘧啶磷酸化酶/5'-脱氧-5-氟尿嘧啶(TP/5'-DFUR)系统 胸腺嘧啶磷酸化酶(thymidine phosphorylase, TP)能催化胸腺嘧啶或脱氧尿嘧啶,生成1-磷酸脱氧核糖. 对于前药5'-脱氧-5氟尿嘧啶(5'-deoxy-5-fluorouridine, 5'-DFUR)或1-(tetrahydrofuryl-5-fluorouracil, Tegafur), TP使之转化为5FU. 业已证明该系统可使人MCF-7乳癌细胞对5'-DFUR的敏感性提高1000倍. 该系统也呈旁观者效应.
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    1.11 羧基肽酶G2/CMDA系统(CPG2/CMDA) 假单胞菌属(Pseudomonas)RS16产生的羧基肽酶G2(carboxy peptidase G2,CPG2)可使4-([2-chloroethyl][2-mesyloxyethyl]amino)benzyol-L-glutamic acid(CMDA)分解为苯甲酸衍生物,后者为强毒性烷化剂. CMDA不易进入细胞,不能被细胞内表达的CPG2活化,但如果应用基因工程方法让CPG2在细胞膜表面表达,则CMDA便易被激活,从而显示细胞毒性[26].

    1.12 羧酸酯酶/CPT-11(CE/CPT-11)系统 兔羧酸酯酶(carboxylesterase, CE)能使化疗药CPT-11 (irinotecan, 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino] carbonyloxycamptothecin)转化为其活性形式SN38(7-ethyl-10 hydroxycamptothecin)[27]. 人横纹肌肉瘤细胞被免CE基因转染后,对CPT-11的敏感性较之野生型细胞高8倍以上. 从CPT-11转化为SN38的过程具有同工酶特异性,在人,主要由肝内CE-Ⅰ催化.
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    1.13 复合系统 联合应用不同的自杀基因前药系统可能比单一系统更有效[28,29]. 例如,联合应用CD/5FC和HSV-tk/GCV系统,前者产生的5FU可抑制胸苷酸合成酶,减少胸腺嘧啶生成,相应减少在HSV-tk活性部位胸腺嘧啶和GCV的竞争,从面增强HSV-tk/GCV系统的效应. 给鼠9L神经胶质瘤同时转染CD和HSV-tk两种基因,可使杀灭肿瘤所需的5FC和GCV最低浓度下降50%以上.

    2 作用机制

    基因转移载体将自杀基因转染给肿瘤细胞,在自杀基因表达的特殊酶作用下,本身无毒或微毒的前药在局部被激活,转化为高度毒性药物,从而将瘤细胞毒杀灭. 表达这种酶的瘤细胞越多,被杀灭的细胞越多. 此为直接细胞毒效应. 但实践中发现,为了取得肿瘤退缩,并不需要每个肿瘤细胞均表达自杀基因,换言之,在自杀基因/前药系统介导的肿瘤治疗中,被杀灭的细胞数远超过表达自杀基因的细胞数. 这是由于在前药存在下,基因改造的瘤细胞能引起未经基因改造细胞的细胞毒性和死亡. 这种现象即前已述及的旁观者效应(bystander effect, BSE). 此种效应有力的增强了自杀基因/前药系统的作用,但因细胞系和酶/前药不同而差异很大,可以不存在,也可以很强大,以致肿瘤内只要有1%~5%的转染细胞即可引起几乎全部瘤细胞死亡. 前述的各系统中,许多均显示这种效应. BSE产生的机制尚不完全清楚,主要有:
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    2.1 单纯弥散作用 某些激活的前药(如5FU)为可溶性分子,可自由地在细胞-细胞之间弥散,从而引发BSE. 在CD/5FU系统,暴露于5FU后,CD+细胞培养液中很快可测出5FU. 在细胞水平,BSE取决于5FC被基因改造细胞转化为5FU的速率、5FU弥散至邻近未基因改造细胞的速率,以及靶细胞对5FU的内在敏感性. 如果肿瘤细胞本身对5FU敏感,则从邻近基因改造细胞弥散而来的5FU,即使浓度很低,也呈现细胞毒作用.

    2.2 代谢协作作用(metabolic cooperation) 在某些自杀基因系统,例如HSV-tk/GCV,活化的前药GCV-TP为荷电分子,不能被动地穿越细胞膜,但在HSV-tk+细胞和野生型细胞共培养中,却在后一种细胞内显示有高浓度GCV-TP[30]. 现认为,这是HSV tk+细胞内GCV-TP经过细胞的裂隙连接(gap junction)转移给野生型细胞的结果. 裂隙连接系由结合蛋白(connexons)组成的特殊细胞膜结构. 结合蛋白由connexins装配而成,为一六聚体圆柱形蛋白,中心有孔道. 不同细胞之间的裂隙连接形成“代谢协作”管道,经过此管道,一些小电荷分子能在细胞间流动. GCV-TP分子甚小(<1000),能透过裂隙连接. 业已证实,在HSV-tk/GCV系统中,细胞-细胞接触是细胞杀灭作用所必需;细胞间裂隙连接与BSE强弱密切相关,而裂隙连接的透过性又与connexins 43,37,32和26的表达水平有关. 缺乏BSE的细胞系在转入connexins 43基因后,显示BSE. 胰癌细胞呈现的BSE强于某些胃肠癌细胞,前者的connexins 43和connexins 26 mRNA表达水平,比后者分别高8倍~26倍和2倍~229倍[31]. 为了强化BSE,可通过药理学方法疏通裂隙连接或增强其表达. 由HSV-tk+和野生型肿瘤细胞混合物构建的鼠间质细胞瘤,如果同时接受GCV和维生素A酸(retinoid acid),其肿瘤消退作用加快,这种作用即使在HSV-tk+细胞与野生型细胞的比例低至1∶40时仍存在. 已知维生素A酸能增加connexins 43的表达,促进小分子色素在细胞之间转移,而其本身对肿瘤大小并无影响,由此推测,维生素A酸之所以能强化HSV-tk/GCV的作用,系由于其能加强裂隙连接的透过性,强化BSE所致[32]. 其他能增强HSV-tk/GCV BSE杀伤作用的物质尚有黄酮类apigenin、胆固醇合成抑制剂lovastatin. 已知细胞酪氨酸激酶能使connexins磷酸化,减弱裂隙连接的透过性,而lovastatin能抑制该酶活性,从而增强裂隙连接的通透性:apigenin可能会增加裂隙连接的表达. 相反,cAMP活化剂forskolin和钙通道阻滞剂硝苯吡啶能减弱BSE.
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    2.3 免疫介导作用 给动物在两个不同部位分别移植HSV-tk+肿瘤和野生型肿瘤,再给予GCV,发现野生型肿瘤也退缩,这种现象称为“距离性旁观者效应”(“bystander effect at a distance”),提示体内出现抗肿瘤性免疫反应[33]. 下列事实提示这种免疫反应的存在:①给小鼠植入含有HSV-tk+和野生型细胞的肿瘤,再接受亚致死量照射,发现BSE减弱;②在免疫缺陷性荷瘤BALB/c小鼠,HSV-tk/GCV的BSE弱于免疫功能正常的荷瘤鼠;③接受HSV-tk/GCV治疗的荷瘤动物,对同源肿瘤的再接种呈现特异性抗体反应[34];④前列腺癌鼠模型接受HSV-tk/GCV治疗期间,如果去除自然杀伤细胞(NK),则原发肿瘤的抑制作用减少20%,肺转移癌的生长不能被抑制[35];⑤HSV-tk/GCV介导的肿瘤坏死伴有明显炎细胞浸润,CD4+和CD+8T细胞集聚、瘤内白介素-12(IL-12)水平增高,这与环磷酰胺引起的坏死不同,后者缺乏炎症反应[34]. 自杀基因/前药促发的免疫反应的原理尚不清楚,可能由于肿瘤细胞坏死后,抗原成分更多地暴露,或在对坏死细胞的炎症反应中,抗原提呈细胞得到补充或激活,从而引发延迟型肿瘤免疫反应,如同体内产生活的抗肿瘤疫苗. 有人认为CD基因表达的CD蛋白本身具有超级免疫原性,可刺激淋巴细胞产生交叉免疫反应. 进一步研究表明,免疫反应的出现与细胞因子的表达有关. HSV-tk+细胞暴露于GCV后,体内α肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1α(IL-1α)、IL-6、γ干扰素(IFN-γ)和粒细胞菌落刺激因子(GM-CSF)水平均提高;HSV-tk+细胞表面共刺激性分子(costimulating molecules)ICAM和B7的表达增加. 有人发现,如果免疫缺陷性HSV-tk载体同时表达TNF-α,则HSV-tk/GCV抗肿瘤效应明显提高.
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    2.4 其他作用 有人认为,死亡的HSV-tk+细胞可释放含GCV-TP凋亡囊泡,野生型肿瘤细胞吞噬这些囊泡后会死亡. 但这些囊泡出现较迟,不能解释早期发生的BSE. 有人认为HSV-tk/GCV可引起血管内皮细胞基因改造,通过对肿瘤血管的破坏而引发BSE[36]. 已知转染HSV-tk基因的大鼠脑瘤,在暴露于GCV后,瘤内血管明显减少.

    3 消化系肿瘤的治疗

    迄今,已在许多肿瘤试验了自杀基因疗法的治疗作用,这些肿瘤包括黑素瘤、神经胶质瘤、间皮瘤、肺癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、腹膜癌、宫颈癌等,但多半为体内、外临床前研究,真正进入临床Ⅰ/Ⅱ期研究的仅见于恶性胸膜间皮瘤(美国)、成胶质细胞瘤和转移性黑素瘤(法国)等少数肿瘤. 在消化系肿瘤中,研究较多的是关于HSV-tk/GCV和CD/5FC对肝癌、结肠癌、胰癌和胃癌的治疗作用.
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    3.1 肝癌 1993年Caruso et al[37]首先报告向大鼠实验性转移性肝癌组织内,注入含有表达HSV-tk重组逆转录病毒的包装细胞,再给予GCV,引起肿瘤明显退缩,瘤细胞数平均减至对照组的1/60. 应用重组腺病毒作为HSK-tk基因的载体,也得出类似结果. Kwong et al[38]给鼠肝植入乳腺癌细胞,制造实验性肝癌,2wk后,瘤内注入表达HSV-tk的复制缺陷性腺病毒载体,结果显示肿瘤明显退缩,生存期明显长于对照组(P<0.01). HSV-tk/GCV可能特别适于治疗肝肿瘤,这是因为:①迅速分裂的肿瘤细胞生长于非增生性、相对正常的肝组织中,而用于基因转移的逆转录病毒载体对增殖旺盛的细胞最有亲和力. 体外实验表明,HSV-tk基因转染的肝肿瘤细胞对GCV的敏感性是野生型细胞的500倍~1000倍[39];②由于70%的肝细胞癌表达甲胎蛋白(AFP),而正常肝细胞不表达此种蛋白,因此如应用AFP基因作为启动子,可提高基因转录载体的靶向性,增加目的基因转染肝癌细胞的效果[6,39-41];③,由于肝肿瘤的血液供应主要来自肝动脉,因此如果从肝动脉输注基因转移载体和前药,可能进一步增加基因转移的靶向性,减少副作用[39]. Gerolami et al[42]在二乙基硝胺肝癌鼠模型,比较了经门脉、肝动脉和瘤内直接注射等3种途径输注重组腺病毒载体的效果,发现以肝动脉输注产生的肿瘤抑制效应最显著. HSV-tk/GCV对肝肿瘤的抑制作用尚见于肝外输注自杀基因时,此很可能系“距离性旁观者效应”发挥了作用. 向鼠腹腔内注入HSV-tk+和HSV-tk-结肠癌细胞,10d后,再向肝内注入HSV-tk-结肠癌细胞,所有动物均接受GCV. 结果显示,不仅腹腔内HSV-tk+肿瘤和HSV-tk-肿瘤相比,明显退缩,而且肝内HSV-tk-肿瘤在腹腔HSV-tk+肿瘤鼠也小于腹腔HSV-tk-肿瘤鼠. 腹腔HSV-tk+肿瘤鼠的肝内肿瘤内有大量单核细胞浸润,伴纤维化,仅偶见存活的肿瘤细胞.
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    3.2 结直肠癌 CD/5FC系统看来更适合于治疗结直肠癌. 体外实验表明培养的结肠癌细胞中只要1/3表达胞嘧啶脱氨酶(CD),即足以使前药5FC转化为足够浓度的5FC,而使全部癌细胞的生长受到抑制;皮下移植的结肠癌组织中只要2%的癌细胞表达CD,在给予5FC后,肿瘤生长即完全停止. 如果将载有CD基因的腺病毒载体,直接注射入裸鼠皮下移植性结肠肿瘤内,再给予5FC,引起肿瘤缩小3/4~4/5. Rowley et al[17]报告表达CD的结直肠癌细胞对5FC的敏感性,比不表达CD的腺癌细胞高200倍以上,在7d内,90%以上癌细胞被杀死. 有人比较了经基因改造的结直肠癌细胞对前药5FC或GCV的敏感性,发现GCV对HSV-tk+细胞的50%抑制浓度(IC50)为对野生型细胞的1/140,而5FC对CD+细胞的IC50仅为对野生型细胞的1/960;移植瘤内如果HSV-tk+细胞少于10%,则不显示抗肿瘤效应,而CD+细胞仅需4%,实验动物肿瘤生长便受到抑制.
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    结直肠癌对CD/5FC更为敏感的原因可能为:①肿瘤本身对5FC具有内在敏感性;②CD/5FC系统的旁观者效应(BSE)较显著. 在此系统中,BSE不取决于细胞-细胞间接触,而取决于5FC的细胞间自由弥散. 现认为结直肠癌对HSV-tk/GCV的敏感性与癌细胞的类型有关. Link et al[43]发现在由HSV-tk+和HSV-tk-结直肠癌细胞构建的种植瘤,如果HSV-tk+细胞在全部癌细胞中占9%,在给予GCV后,发生肿瘤退缩;但某些类型HSV-tk+结直肠癌细胞对GCV呈现抗性,进一步研究发现这些细胞内HSV/tk基因部分或完全性脱落,免疫组化研究显示细胞内HSV/tk蛋白缺乏[44]. McMaster et al[45]发现三种结肠癌细胞株中有二种在HSV-tk/GCV作用期间无明显BSE发生. 分子杂交技术虽然在这些细胞测到裂隙连接蛋白connexin43,但免疫组化研究显示,这种蛋白存在于细胞浆内,而不是在细胞表面;相反,呈现强有力BSE的结直肠癌细胞表面有connexin43表达. 由于细胞表面connexin43表达是HSV-tk/GCV治疗时BSE发生的必要条件,因此某些类型结直肠癌细胞对HSV-tk/GCV缺乏敏感性[31],可能主要与BSE不足有关,这对基因治疗方法和适合病例的选择具有实际意义.
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    3.3 胰癌 1994年DiMaio et al用重组逆转录病毒载体,将HSV-tk基因转染胰癌细胞. 给免疫缺陷鼠皮下注射以各种比例混合的HSV-tk+和野生型胰癌细胞,全部动物均发生胰癌. 给予GCV后,肿瘤明显消退,即使仅含10% HSV-tk+细胞的肿瘤也显示瘤体积明显缩小. 应用CEA基因作为启动子,可提高病毒载体将目的基因转入产CEA性胰癌细胞的耙向性. Ohashi et al[46]发现,用表达HSV-tk基因的腺病毒载体转染胰癌细胞时,如采用一般的启动子,则癌细胞对GCV的敏感性与CEA产生无关,如果采用CEA启动子,则GCV杀伤作用在产CEA细胞明显增强. 在胰癌的自杀基因/前药治疗中,BSE甚为显著. Green et al[24]应用硝基还原酶ND/CB1954系统,发现胰癌细胞转染ND基因后,对CB1954的敏感性提高500倍,在与野生型细胞混合培养中,只要10%的胰癌细胞表达ND,即足以引起强大BSE. 对于腹腔转移性胰癌,腹腔内输注表达自杀基因的病毒载体,往往可有效地诱发BSE. Rosenfeld et al[47]给BALB/c裸鼠腹腔内注入胰癌细胞诱发肿瘤形成,再注入表达HSV-tk基因的腺病毒载体,在注射GCV后,肿瘤明显退缩,伴有强大BSE出现. Aoki et al[48]作过类似实验, 但采用脂质体作为载体,将HSV-tk基因注入腹腔,对照组24只鼠全部出现胰肿瘤伴腹腔播散,而治疗组14只鼠中8只未见肿瘤生长.
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    3.4 胃癌 Yoshida et al[49]将包装有HSV-tk基因的逆转录病毒转染胃癌细胞,发现这种细胞对GCV呈现剂量和时间依赖性反应,在体外实验中低至0.1μg/mL的GCV即可将胃癌细胞杀灭;在13只皮下接种HSV-tk+胃癌细胞的裸鼠中,12只的肿瘤在给予GCV后显著退缩. 与结直肠癌相似,胃癌对HSV-tk/GCV的敏感性也以产CEA细胞最高. Tanaka et al[50]应用含CEA启动子的重组逆转录病毒转染HSV-tk基因,发现腹腔注射这种重组逆转录病毒后,30%产CEA性胃癌细胞选择性表达HSV-tk基因,给予GCV后,肿瘤生长较未给予GCV的对照组减少20%. 类似地,如果以CEA基因作为启动子,腺病毒载体也可将CD基因选择性转染于CEA阳性胃癌细胞. 有人认为,腹腔内注射以CEA基因作为启动子的腺病毒介导的CD/5FU,可能是治疗播散性胃癌的新途径.

    4 问题和前景
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    4.1 安全性 由于本身无毒性的前药,仅在表达自杀基因的瘤细胞内才被转化为活性物质,引起后者局部高浓度,因此,在理论上,本疗法不会引起全身性副作用. 动物实验证明这种疗法是安全的. 临床Ⅰ/Ⅱ期试验同样显示本疗法不会引起严重的副作用. Klatzmann et al用鼠细胞包装表达HSV-tk基因的逆转录病毒,然后将这种鼠细胞注入黑素瘤瘤体内,每次108~3×109细胞,共1次~3次,然后给予GCV 5mg/kg,2次/d,共14d. 共治疗8例患者. 治疗后3d~9d于注射局部发生炎症反应,多数持续几天后消失;伴中等度发热,持续24h后自退. 无其他严重副反应. Klatzmann et al[51]在1998年又报告治疗12例复发性胶质细胞瘤的结果. 在手术切除肿瘤后,于腔壁多部位注入含有HSV-tk+逆转录病毒的鼠Mll细胞8.7×106/cm2,7d后再输注GCV 5mg/kg,2次/d共14d. 未见明显副作用,无一例因此项治疗而引发症状加剧或死亡. Sterman et al[52]报告胸腔内注射含HSV-tk基因的腺病毒载体,每次1012pfu,共治疗12例胸膜间皮瘤患者. 多数患者在6h~12h内轻度发热,48h~72h后消退,1例出现急性胸膜炎症状. 无明显血液学异常. 胸腔插管周围常发生皮疹,但不治而愈.
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    病毒载体可否在体内重新获得复制能力,而引发播散性病毒感染自杀基因能否转染非靶细胞,而引起各脏器损害目前的资料均持否定的看法. Klatzmann et al[51]曾在治疗的1例患者中测到HSV-tk基因,但为一过性,未引起不良后果. 值得注意的是自杀基因疗法治疗肝癌,对肝功能有无影响尚有不同看法. Qian et al[53]发现在二乙基硝胺(DENA)诱发的鼠肝癌,HSV-tk/GCV治疗后,在肿瘤退缩的同时,血清转氨酶明显升高,肝组织呈弥漫性损害. 但这可能由于DENA诱发的细胞增生,不仅见于肝癌结节,也发生于非癌性肝实质,以致非肿瘤性细胞也被HSV-tk基因转染,而对GCV呈现敏感性. van de Eb et al[54]报告正常的非有丝分裂肝细胞能被表达HSV-tk的腺病毒载体转染,以致在HSV-tk/GCV 治疗后可发生严重肝功能异常. 但其他学者则认为该疗法对肝无明显副作用,肝癌组织内发生的旁观者效应不会波及肿瘤外肝组织.

    4.2 展望 自杀基因/前药疗法可使前药在表达自杀基因的肿瘤内,转为高效毒性物质,通过直接细胞毒性或旁观者效应发挥抗肿瘤作用. 如果基因靶向表达能够实现,则不仅正常组织免受损伤,而且可清除无法手术切除的癌灶或转移灶. 但迄今为止,该疗法主要尚处于临床前试验阶段,仅有少数进入临床Ⅰ/Ⅱ期试验,疗效也难称满意. 提高疗效的关键看来是真正做到靶向表达. 虽然某些肿瘤特异性启动子驱动的自杀基因可转染特殊瘤细胞内,但这种特异性是相对的,也可转染正常细胞;而且,病毒载体在肿瘤组织内不可能均匀分布,更不可能转染每个肿瘤细胞. 为了提高靶向性,有人主张采用复制型而不采用免疫缺陷性病毒载体,认为前者可在肿瘤内形成次级循环感染(secondary round of infection)[1],提高转染效果;也有人主张采用不同的病毒载体,以转染不同类型的肿瘤组织或同一类型肿瘤的不同细胞. 由于病毒载体引入机体后,可诱发抗病毒抗体,而影响病毒载体的转染效果,因此采用不同的病毒载体尚有可能进行反复治疗.
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    努力提高旁观者效应(BSE),对增强自杀基因/前药疗效有重要意义. 自杀基因/前药系统不同,BSE的机制也可不同,例如HSV-tk/GCV系统的BSE有赖于细胞裂隙连接的表达,而某些肿瘤不表达或甚少表达裂隙连接,显然不适于HSV-tk/GCV疗法,因此,筛选适合某一疗法的肿瘤甚为重要;也可应用药物促进裂隙连接的表达. 前药的选择也很重要,应发展新的半寿期长的高效前药,并探讨最适剂量和给药方式. 此外,联合应用不同的自杀基因/前药系统,将自杀基因和细胞因子基因联合转染入肿瘤,或联合应用常规抗癌疗法或免疫促进因子,以形成叠加杀伤效应,等,均是目前正在研究的课题. 相信在不远的将来,自杀基因疗法一定会有新的突破.

    讯作者 徐克成

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    收稿日期 1999-04-28, 百拇医药