哮喘宁煎剂对豚鼠哮喘模型支气管壁内c-jun表达的影响
作者：崔红生，黄启福，贾 旭，武维屏
单位：崔红生，武维屏(北京中医药大学东直门医院呼吸科，北京 100700)；黄启福，贾 旭(北京中医药大学基础医学院病理室，北京 100029)
关键词：哮喘宁；原癌基因；炎症细胞
中国中医基础医学杂志990811 哮喘宁是根据武维屏教授临床验方研制的中药复方制剂，主要由柴胡、葶苈子、防风、栝楼、丹参等药物组成，具有调肝理肺，理气降逆，祛风化痰，活血通络等功效，临床上用于治疗支气管哮喘，收到良好疗效[1]。为了进一步探讨其作用机理，本实验应用豚鼠哮喘模型，观察了哮喘宁煎剂对致敏原激发后不同时间气道中炎症细胞内c-jun表达的影响。现将结果报告如下。
材料与方法
1 动物与分组
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正常雄性豚鼠120只，体重300 g±20 g，购自北京市实验动物中心。随机分为正常对照组、病理模型组、氨茶碱组及哮喘宁组，每组各30只。
2 药物与试剂
哮喘宁煎剂，由本院制剂室提供，每毫升含生药3.3 g；氨茶碱片剂，天津市力生制药厂生产，每片0.1 g，用生理盐水溶解。兔抗鼠c-jun蛋白多克隆抗体(USA Santa Cruz.)，生物素化山羊抗兔IgG(USA vector)，辣根酶标记链霉亲和素(Streptavidin/HRP,USA vector),DAB kit(USA Sigma)，均购自北京中山生物技术公司；卵清蛋白(Ovalbumin,Grade Ⅱ,Sigma)，购自北京邦定生物医学公司；多聚甲醛，天津泰德精细化学有限公司生产；甲醇，北京益利精细化学品有限公司生产。
3 造模与给药
病理模型组、氨茶碱组与哮喘宁组用10%卵清蛋白1 ml腹腔注射，两周后以1%的卵清蛋白雾化吸入直至出现咳嗽、喘鸣、呼吸道梗阻等哮喘症状。正常对照组给予相同剂量的生理盐水。氨茶碱组和哮喘宁组于激发前1 h分别给予氨茶碱50 mg/kg和哮喘宁煎剂22 g/kg灌胃；正常对照组和病理模型组分别给予蒸馏水2 ml/只灌胃。
, 百拇医药
4 标本制备
致敏豚鼠分别于激发后4 h、12 h、24 h用10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，然后经右心室插管先以生理盐水100 ml快速灌洗，继以含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PB 300 ml(pH7.4)缓缓灌注，固定40 min,取出肺脏，置同一固定液后固定2 h—4 h。将上述组织制成厚度为5 μm的石蜡切片，用于免疫组化。
5 免疫组织化学染色
ABC法免疫组化染色程序：石蜡切片常规脱蜡至水；切水浸入0.3%甲醇-H2O2溶液，室温下处理30 min，消除内源性过氧化物酶的活性；0.4%胃蛋白酶消化30 min(37℃)；10%正常山羊血清(0.01 mol/L,pH7.4 PBS稀释，下同)封闭20 min(37℃)，倾去血清，加入兔抗鼠c-jun蛋白多克隆抗体(1∶50)，4℃冰箱过夜；滴加生物素化山羊抗兔IgG(1∶200)，37℃孵育60 min；滴加Streptavidin/HRP(1∶200)，37℃孵育60 min。以上各步骤后均用0.01 mol/L,pH7.4 PBS洗3×3 min。DAB呈色；自来水充分冲洗；酒精脱水，二甲苯透明，DPX封片，显微镜观察并摄像。
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免疫组化染色对照设置 以PBS和正常兔血清分别代替一抗行上述染色，作为空白对照和替代对照。
6 结果观察与统计方法
高倍镜下，分别对各组激发后3个不同时点组织切片中支气管壁内c-jun阳性细胞计数(不包括管腔内的阳性细胞颗粒)，每一时点计数100个气道，然后求其平均数(
±s)。用t检验比较各组间的结果。
结果
免疫组织化学染色结果显示，c-jun免疫反应阳性颗粒呈棕褐色，分布于嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、上皮细胞及肺泡巨噬细胞的胞核，胞质呈阴性反应，反差鲜明。正常组各时点无或偶见反应极弱的炎性细胞或上皮细胞(图1)。病理组激发后4 h，支气管粘膜层、粘膜下层、平滑肌层及其周围即可见有少量呈阳性反应的白细胞和上皮细胞(图2)；激发后12 h，支气管壁内及其周围阳性细胞数明显增多，与炎症细胞浸润程度一致，且着色明显加深，支气管腔及肺泡内亦可见呈阳性反应的炎性细胞和脱落的上皮细胞。至24 h，支气管壁内及其周围虽仍有阳性细胞表达，但数量明显减少，强度亦明显减弱。氨茶碱组于激发后4 h、12 h阳性细胞均较病理组明显减少，哮喘宁组则于激发后12 h、24 h阳性细胞较病理组明显减少，阳性反应明显减弱(图3、4)。空白对照和替代对照均呈阴性反应。比较各组致敏原激发后不同时间支气管壁内阳性细胞数变化，具体结果见表1。
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图1
图2
图3
图4
表1 致敏原激发后不同时间支气管壁内c-jun阳性细胞计数变化(±s,Cells/100气道) 组 别
n
4 h
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12 h
24 h
正常组
8
11.73±3.24
13.20±5.06
12.00±3.55
病理组
8
113.20±16.90*
314.33±20.65*★
118.064±14.35*■
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氨茶碱组
8
78.47±10.08*▲▲
239.27±37.97*▲▲★
121.35±16.95*★■
哮喘宁组
8
108.13±18.97*#
278.20±30.62*▲▲#★
105.80±11.52*▲#■
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注：与正常组比较：P<0.01；与病理组比较：▲P<0.05；▲▲P<0.01；与氨茶碱组比较：#P<0.01；与4 h比较：★P<0.01；与12 h比较：■P<0.01；其余P均>0.05。
讨论
原癌基因(proto-oncogene)，或称细胞癌基因(cellular oncogene,c-onc)，是一类广泛存在于原核细胞和真核细胞基因组内的高度保守基因，由于它被逆转录病毒转导后可变成致癌活性的病毒癌基因(viral oncogene,v-onc)而得名。近年来的大量研究表现，原癌基因及其蛋白产物不仅参与细胞的正常生长、分化过程，而且作为核内信使参与细胞内的信息传递过程，在生命活动中起着极为基本而重要的作用[2]。原癌基因几乎参与信号传递通路的每一环节。在原癌基因家族中，有一类可被第二信使诱导的原癌基因称为即刻早期基因(immediate-early genes,IEG)，也可称为快速反应基因，有的学者称为初级反应基因(primary response genes)。所谓即刻早期基因，是指该类基因能对神经递质、激素、神经冲动等外界刺激引起的传入信息在数分钟内作出反应，进行表达[2]。哮喘是一种气道慢性非特异性炎症，其病理过程涉及EOS、淋巴细胞、肥大细胞、肺泡巨噬细胞浸润以及气道上皮细胞的脱落等[8]。与正常细胞相比，哮喘发作时这些炎症细胞在气道内呈现活化状态，并分泌有关炎性介质。虽然这一原因目前尚不十分清楚，但可能至少与即刻早期原癌基因的活化有关。c-jun为即刻早期原癌基因，其蛋白产物为AP-1转录因子成分之一，后者与DNA分子的AP-1位点结合，启动靶基因的转录[4]，因此c-jun蛋白产物的产生为细胞增殖及生物合成的早期标志之一。许多疾病的病理变化都涉及到原癌基因的表达[5]。本实验发现，豚鼠哮喘模型卵清蛋白激发后支气管肺组织中浸润的炎症细胞内以及粘膜上皮细胞中均有c-jun表达，且激发后4 h及12 h阳性细胞数目与气道和肺组织炎症细胞浸润程度一致，说明了炎症细胞内原癌基因c-jun参与了哮喘的发病过程。由于外周组织中的白细胞为成熟的细胞，丧失了分裂增殖的能力，因此，推测炎症细胞内c-jun的表达可能是炎症细胞活化的早期标志，并与炎症细胞合成、释放细胞因子和炎性介质有关[6]。致敏原激发后24 h，阳性细胞颗粒明显减少，阳性反应明显减弱，这可能提示为细胞的活化状态降低，细胞因子合成减少的缘故。气道上皮细胞中c-jun阳性细胞表达，提示原癌基因c-jun不仅参与炎症所致的上皮细胞脱落，而且还与上皮细胞活化有关。
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通过提前给予致敏豚鼠氨茶碱和哮喘宁灌胃，发现氨茶碱组于致敏原激发后4 h支气管壁内c-jun阳性细胞计数即明显减少，哮喘宁组与病理组比较无显著性差异。激发后12 h，氨茶碱组与哮喘宁组c-jun阳性细胞数较病理组均有所减少，但前者减少更为显著，与哮喘宁组比较仍有极显著性差异(P<0.01)。至激发后24 h，氨茶碱组c-jun阳性细胞数与病理组比较无显著性差异，哮喘宁组c-jun阳性细胞数却持续减少，阳性颗粒强度亦明显减弱，与病理组和氨茶碱组比较均有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。本实验研究结果表明，哮喘宁能够抑制豚鼠哮喘模型气道中炎症细胞内c-jun的阳性表达，进而提示哮喘宁具有抑制炎症细胞活化，阻断其分泌和释放多种细胞因子或炎性介质，降低气道反应性的作用。
作者简介：崔红生，男，32岁，北京中医药大学东直门医院呼吸科主治医师，医学博士，主要从事中医内科肺系疾病的研究。通讯地址：北京市东城区海运仓5号，邮编：100700。
参考文献
, 百拇医药
[1]崔红生，武维屏，赵燕荣，等.哮喘宁煎剂治疗支气管哮喘急性发作期的临床研究.北京中医药大学学报，1999，22(1)：57.
[2]韩济生.神经科学纲要.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993.6：272—274.
[3]Holgate ST.The 1992 cournand lecture.asthma:past,present and future.Eur Respir J,1993，6:1507—1520.
[4]Curran T,Robert BF. Fos and Jun: The Ap-1 connection.Cell,1988，55:395.
[5]Angel P,Michael K.The role of Jun,Fos and the Ap-1 complex in cell-proliferation and transformation.Biochim Biophys Acta,1991，1072:129.
[6]吕坤聚，戚好文，李玉松，等.豚鼠哮喘模型气道中炎症细胞浸润与c-jun表达的关系.中国病理生理杂志，1997，13(4)：352.
(收稿日期 1999—04—27 修回日期 1999—05—26), http://www.100md.com
单位：崔红生，武维屏(北京中医药大学东直门医院呼吸科，北京 100700)；黄启福，贾 旭(北京中医药大学基础医学院病理室，北京 100029)
关键词：哮喘宁；原癌基因；炎症细胞
中国中医基础医学杂志990811 哮喘宁是根据武维屏教授临床验方研制的中药复方制剂，主要由柴胡、葶苈子、防风、栝楼、丹参等药物组成，具有调肝理肺，理气降逆，祛风化痰，活血通络等功效，临床上用于治疗支气管哮喘，收到良好疗效[1]。为了进一步探讨其作用机理，本实验应用豚鼠哮喘模型，观察了哮喘宁煎剂对致敏原激发后不同时间气道中炎症细胞内c-jun表达的影响。现将结果报告如下。
材料与方法
1 动物与分组
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正常雄性豚鼠120只，体重300 g±20 g，购自北京市实验动物中心。随机分为正常对照组、病理模型组、氨茶碱组及哮喘宁组，每组各30只。
2 药物与试剂
哮喘宁煎剂，由本院制剂室提供，每毫升含生药3.3 g；氨茶碱片剂，天津市力生制药厂生产，每片0.1 g，用生理盐水溶解。兔抗鼠c-jun蛋白多克隆抗体(USA Santa Cruz.)，生物素化山羊抗兔IgG(USA vector)，辣根酶标记链霉亲和素(Streptavidin/HRP,USA vector),DAB kit(USA Sigma)，均购自北京中山生物技术公司；卵清蛋白(Ovalbumin,Grade Ⅱ,Sigma)，购自北京邦定生物医学公司；多聚甲醛，天津泰德精细化学有限公司生产；甲醇，北京益利精细化学品有限公司生产。
3 造模与给药
病理模型组、氨茶碱组与哮喘宁组用10%卵清蛋白1 ml腹腔注射，两周后以1%的卵清蛋白雾化吸入直至出现咳嗽、喘鸣、呼吸道梗阻等哮喘症状。正常对照组给予相同剂量的生理盐水。氨茶碱组和哮喘宁组于激发前1 h分别给予氨茶碱50 mg/kg和哮喘宁煎剂22 g/kg灌胃；正常对照组和病理模型组分别给予蒸馏水2 ml/只灌胃。
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4 标本制备
致敏豚鼠分别于激发后4 h、12 h、24 h用10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，然后经右心室插管先以生理盐水100 ml快速灌洗，继以含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PB 300 ml(pH7.4)缓缓灌注，固定40 min,取出肺脏，置同一固定液后固定2 h—4 h。将上述组织制成厚度为5 μm的石蜡切片，用于免疫组化。
5 免疫组织化学染色
ABC法免疫组化染色程序：石蜡切片常规脱蜡至水；切水浸入0.3%甲醇-H2O2溶液，室温下处理30 min，消除内源性过氧化物酶的活性；0.4%胃蛋白酶消化30 min(37℃)；10%正常山羊血清(0.01 mol/L,pH7.4 PBS稀释，下同)封闭20 min(37℃)，倾去血清，加入兔抗鼠c-jun蛋白多克隆抗体(1∶50)，4℃冰箱过夜；滴加生物素化山羊抗兔IgG(1∶200)，37℃孵育60 min；滴加Streptavidin/HRP(1∶200)，37℃孵育60 min。以上各步骤后均用0.01 mol/L,pH7.4 PBS洗3×3 min。DAB呈色；自来水充分冲洗；酒精脱水，二甲苯透明，DPX封片，显微镜观察并摄像。
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免疫组化染色对照设置 以PBS和正常兔血清分别代替一抗行上述染色，作为空白对照和替代对照。
6 结果观察与统计方法
高倍镜下，分别对各组激发后3个不同时点组织切片中支气管壁内c-jun阳性细胞计数(不包括管腔内的阳性细胞颗粒)，每一时点计数100个气道，然后求其平均数(
±s)。用t检验比较各组间的结果。结果
免疫组织化学染色结果显示，c-jun免疫反应阳性颗粒呈棕褐色，分布于嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、上皮细胞及肺泡巨噬细胞的胞核，胞质呈阴性反应，反差鲜明。正常组各时点无或偶见反应极弱的炎性细胞或上皮细胞(图1)。病理组激发后4 h，支气管粘膜层、粘膜下层、平滑肌层及其周围即可见有少量呈阳性反应的白细胞和上皮细胞(图2)；激发后12 h，支气管壁内及其周围阳性细胞数明显增多，与炎症细胞浸润程度一致，且着色明显加深，支气管腔及肺泡内亦可见呈阳性反应的炎性细胞和脱落的上皮细胞。至24 h，支气管壁内及其周围虽仍有阳性细胞表达，但数量明显减少，强度亦明显减弱。氨茶碱组于激发后4 h、12 h阳性细胞均较病理组明显减少，哮喘宁组则于激发后12 h、24 h阳性细胞较病理组明显减少，阳性反应明显减弱(图3、4)。空白对照和替代对照均呈阴性反应。比较各组致敏原激发后不同时间支气管壁内阳性细胞数变化，具体结果见表1。
, 百拇医药
图1
图2
图3
图4
表1 致敏原激发后不同时间支气管壁内c-jun阳性细胞计数变化(
±s,Cells/100气道) 组 别n
4 h
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12 h
24 h
正常组
8
11.73±3.24
13.20±5.06
12.00±3.55
病理组
8
113.20±16.90*
314.33±20.65*★
118.064±14.35*■
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氨茶碱组
8
78.47±10.08*▲▲
239.27±37.97*▲▲★
121.35±16.95*★■
哮喘宁组
8
108.13±18.97*#
278.20±30.62*▲▲#★
105.80±11.52*▲#■
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注：与正常组比较：P<0.01；与病理组比较：▲P<0.05；▲▲P<0.01；与氨茶碱组比较：#P<0.01；与4 h比较：★P<0.01；与12 h比较：■P<0.01；其余P均>0.05。
讨论
原癌基因(proto-oncogene)，或称细胞癌基因(cellular oncogene,c-onc)，是一类广泛存在于原核细胞和真核细胞基因组内的高度保守基因，由于它被逆转录病毒转导后可变成致癌活性的病毒癌基因(viral oncogene,v-onc)而得名。近年来的大量研究表现，原癌基因及其蛋白产物不仅参与细胞的正常生长、分化过程，而且作为核内信使参与细胞内的信息传递过程，在生命活动中起着极为基本而重要的作用[2]。原癌基因几乎参与信号传递通路的每一环节。在原癌基因家族中，有一类可被第二信使诱导的原癌基因称为即刻早期基因(immediate-early genes,IEG)，也可称为快速反应基因，有的学者称为初级反应基因(primary response genes)。所谓即刻早期基因，是指该类基因能对神经递质、激素、神经冲动等外界刺激引起的传入信息在数分钟内作出反应，进行表达[2]。哮喘是一种气道慢性非特异性炎症，其病理过程涉及EOS、淋巴细胞、肥大细胞、肺泡巨噬细胞浸润以及气道上皮细胞的脱落等[8]。与正常细胞相比，哮喘发作时这些炎症细胞在气道内呈现活化状态，并分泌有关炎性介质。虽然这一原因目前尚不十分清楚，但可能至少与即刻早期原癌基因的活化有关。c-jun为即刻早期原癌基因，其蛋白产物为AP-1转录因子成分之一，后者与DNA分子的AP-1位点结合，启动靶基因的转录[4]，因此c-jun蛋白产物的产生为细胞增殖及生物合成的早期标志之一。许多疾病的病理变化都涉及到原癌基因的表达[5]。本实验发现，豚鼠哮喘模型卵清蛋白激发后支气管肺组织中浸润的炎症细胞内以及粘膜上皮细胞中均有c-jun表达，且激发后4 h及12 h阳性细胞数目与气道和肺组织炎症细胞浸润程度一致，说明了炎症细胞内原癌基因c-jun参与了哮喘的发病过程。由于外周组织中的白细胞为成熟的细胞，丧失了分裂增殖的能力，因此，推测炎症细胞内c-jun的表达可能是炎症细胞活化的早期标志，并与炎症细胞合成、释放细胞因子和炎性介质有关[6]。致敏原激发后24 h，阳性细胞颗粒明显减少，阳性反应明显减弱，这可能提示为细胞的活化状态降低，细胞因子合成减少的缘故。气道上皮细胞中c-jun阳性细胞表达，提示原癌基因c-jun不仅参与炎症所致的上皮细胞脱落，而且还与上皮细胞活化有关。
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通过提前给予致敏豚鼠氨茶碱和哮喘宁灌胃，发现氨茶碱组于致敏原激发后4 h支气管壁内c-jun阳性细胞计数即明显减少，哮喘宁组与病理组比较无显著性差异。激发后12 h，氨茶碱组与哮喘宁组c-jun阳性细胞数较病理组均有所减少，但前者减少更为显著，与哮喘宁组比较仍有极显著性差异(P<0.01)。至激发后24 h，氨茶碱组c-jun阳性细胞数与病理组比较无显著性差异，哮喘宁组c-jun阳性细胞数却持续减少，阳性颗粒强度亦明显减弱，与病理组和氨茶碱组比较均有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。本实验研究结果表明，哮喘宁能够抑制豚鼠哮喘模型气道中炎症细胞内c-jun的阳性表达，进而提示哮喘宁具有抑制炎症细胞活化，阻断其分泌和释放多种细胞因子或炎性介质，降低气道反应性的作用。
作者简介：崔红生，男，32岁，北京中医药大学东直门医院呼吸科主治医师，医学博士，主要从事中医内科肺系疾病的研究。通讯地址：北京市东城区海运仓5号，邮编：100700。
参考文献
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[1]崔红生，武维屏，赵燕荣，等.哮喘宁煎剂治疗支气管哮喘急性发作期的临床研究.北京中医药大学学报，1999，22(1)：57.
[2]韩济生.神经科学纲要.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993.6：272—274.
[3]Holgate ST.The 1992 cournand lecture.asthma:past,present and future.Eur Respir J,1993，6:1507—1520.
[4]Curran T,Robert BF. Fos and Jun: The Ap-1 connection.Cell,1988，55:395.
[5]Angel P,Michael K.The role of Jun,Fos and the Ap-1 complex in cell-proliferation and transformation.Biochim Biophys Acta,1991，1072:129.
[6]吕坤聚，戚好文，李玉松，等.豚鼠哮喘模型气道中炎症细胞浸润与c-jun表达的关系.中国病理生理杂志，1997，13(4)：352.
(收稿日期 1999—04—27 修回日期 1999—05—26), http://www.100md.com