利肾口服液拮抗细胞因子对系膜细胞影响的研究★
作者:钟柏松* 石锦萍* 常克* 吴巍* 荣晓凤* 指导 吴康衡*
单位:
关键词:@利肾口服液;药理学;系膜细胞;清热利湿
新中医990920 提要 探讨利肾口服液治疗系膜细胞增殖型肾炎的机理。以肾小球系膜细胞培养技术,3H-TdR掺入测定法。结果:利肾口服液高、中剂量组3H-TdR掺入值极显著低于空白组和IL-1、IL-6、TNF组(P<0.01);IL-1、IL-6、TNF组3H-TdR掺入值极显著高于空白组(P<0.01)。提示:直接抑制系膜细胞和拮抗IL-1、IL-6、TNF刺激系膜细胞异常增殖是利肾口服液治疗以系膜细胞增殖为主要病理的肾小球肾炎的机理之一。
, 百拇医药
肾小球系膜细胞(GMC)的增殖及其基质的病理性聚积是肾小球硬化的主要病理。研究表明某些细胞因子在肾小球肾炎的发生发展和慢性化过程中起重要作用〔1〕;若探索出拮抗这些细胞因子的中药,则可望在一定程度上防止肾小球病变的发生和发展。本研究观察了利肾口服液拮抗细胞因子对GMC影响。
1 材料和方法
1.1 材料 大白鼠,重200g(由华西医科大学动物实验室提供),RPMI-1640(美国GIBCO公司提供),普通胰岛素(美国Sigma公司提供),利肾口服液(由石韦、木贼、益母草等组成,本校附院制剂室提供);1g/ml(相当于含生药3g/ml),滤过除菌,无菌7.5% NaHCO3调pH值至7.1~7.4。IL-110万u/支、IL-6 10万u/支、TNF 5万u/支、地塞米松5mg/ml(中国军事医学科学院提供)。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 GMC的培养 参照谌贻璞氏法〔2〕。第3代GMC用于实验。
1.2.2 分组 共分6组,每组设6复孔。将GMC配成1.5×104/ml的悬液,转种至96孔板,200 μl/孔,预培24小时,使大部分细胞同步在G0期。除空白组外,其余分别再加入含IL-1、IL-6、TNF各100U/ml各等份和利肾口服液高、中、低剂量组(简称中药组,7.5mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml)以及地塞米松10μg/ml的培养液40μl。置37℃5%CO2恒温培养箱共孵育24小时,于最后6小时每孔添加2.5μCiH-TdR(放射性比度20Ci/mmol)继续培养6小时,再添加0.02%胰蛋白酶消化细胞30分钟,收集细胞凉干,用LKB-1211液闪仪记录样品CPM值。
1.2.3 统计学处理 抑制率参照〔3〕公式计算。采用方差分析及t检验处理数据,统计软件为SPSS。
, 百拇医药
2 结果
2.1 利肾口服液直接对GMC的抑制作用 见表1。
表1 利肾口服液对GMC的直接作用(±s) 组别
n
剂量
CPM
抑制率
(%)
空 白 组
6
Ⅱ号液20μl
, 百拇医药
1988.5±153.45
+地米组
6
10μg/ml
1214.2±259.98※
39.34
+利肾高
6
7.5mg/ml
1168.0±105.22※※
41.26
+利肾中
, 百拇医药
6
5mg/ml
1334.8±49.44※※
32.87
+利肾低
6
2.5mg/ml
1387.2±71.01※※#
30.23
注:※与空白组比较P<0.05;#与地米组比较P<0.05,※※与空白组比较P<0.01(下同)
从表1可以看出,地塞米松能直接抑制GMC的增殖,与同类研究结果近似〔4〕。中药高、中、低剂量组与地塞米松组CPM值均显著低于空白组(P<0.01)。提示利肾口服液可显著直接抑制GMC增殖。中药高、中、低剂量组之间有一定的量效关系。其抑制率由强至弱的顺序为利肾高剂量组>地塞米松组>利肾中剂量组>利肾低剂量组。
, 百拇医药
2.2 利肾口服液拮抗IL-1刺激GMC的增殖作用 见表2。
从表2可以看出,加IL-1组CPM显著高于空白组(P<0.01),提示IL-1能促进GMC增殖;而在IL-1培养皿中加用中药各剂量组及地塞米松组均可显著抑制IL-1刺激GMC异常增殖作用(P<0.01)。
2.3 利肾口服液拮抗IL-6刺激GMC的增殖作用 见表3。表2 利肾口服液拮抗IL-1刺激GMC增殖的作用(±s) 剂量
n
剂量
CPM
抑制率
, 百拇医药 (%)
空白组
6
Ⅱ号液20μl
1988.5±153.45
IL-1组
6
100U
3696.3±606.68※※
-85.88
+地米组
6
, 百拇医药 10μg/ml
1882.2±139.39△△
49.08
+利肾高
6
7.5mg/ml
1939.2±75.99△△
47.54
+利肾中
6
5mg/ml
1903.7±203.98△△
, 百拇医药
48.50
+利肾低
6
2.5mg/ml
2254.5±28.36※##△△
39.01
注:△△与IL-1组比较P<0.01,##与地米组比较P<0.01
表3 利肾口服液拮抗IL-6刺激GMC增殖的作用(±s) 组别
n
剂量
, http://www.100md.com
CPM
抑制率
(%)
空白组
6
Ⅱ号液20μl
1988.5±153.45
IL-6组
6
100u
3048.8±260.71※※
-53.32
, 百拇医药
+地米组
6
10μg/ml
1665.3±109.64※※△△
45.78
+利肾高
6
7.5mg/ml
1311.8±61.54※※##△△
56.98
+利肾中
6
, http://www.100md.com
5mg/ml
1545.3±157.01※※△△
49.31
+利肾低
6
2.5mg/ml
2229.3±357.29△##
26.88
注:△与IL-6组比较P<0.05,△△与IL-6组比较P<0.01
从表3可以看出,在IL-6培养皿中加用中药各剂量组及地塞米松组均可显著抑制IL-6刺激MC异常增殖的作用(P<0.01),中药高、中、低剂量组之间有一定量效关系。
, 百拇医药
2.4 利肾口服液拮抗TNF刺激GMC的增殖作用 见表4。表4 利肾口服液拮抗TNF刺激GMC增殖的作用(±s) 组别
n
剂量
CPM
抑制率
(%)
空白组
6
Ⅱ号液20μl
1988.5±153.45
, 百拇医药 TNF组
6
100u
2949.0±595.76※※
-48.30
+地米组
6
10μg/ml
1522.3±170.34※※△△
48.38
+利肾高
6
, http://www.100md.com
7.5mg/ml
1362.8±47.28※※△△#
53.79
+利肾中
6
5mg/ml
2003.8±201.98△△#
32.05
+利肾低
6
2.5mg/ml
2435.8±89.41※※△##
, 百拇医药
17.40
注:△与TNF组比较P<0.05,△△与TNF组比较P<0.01
从表4可以看出:在TNF培养皿中加用中药各剂量组及地塞米松组均可显著抑制TNF刺激MC异常增殖的作用(P<0.05~0.01)。
3 讨论
多种肾小球疾病发生发展的结果均可导致肾小球硬化,虽引起其硬化的因素很多,但其中IL-1、IL-6、TNF作用于GMC使其异常增生是主因之一。人类多种肾小球疾病,如IgA肾病、膜增生性肾炎、狼疮性肾炎、局灶性肾小球硬化等主要病变均与GMC增生密切相关。IL-1、IL-6、TNF等因子可由GMC分泌产生,且也与GMC膜上相应的受体结合,刺激GMC增殖,并使GMC产生大量的超氧阴离子损伤肾小球,以及GMC增生而致使肾小球基底膜损伤出现大量蛋白尿。因此,阻断这些因子可以防止肾小球疾病的发生发展〔1〕。虽糖皮质激素是治疗肾病的常用药之一,但疗效仍不理想。国内尚未见有关探讨中医药复方对细胞因子影响的报道。
, http://www.100md.com
本病中医学多从“水肿”论治。一因外感湿热,困阻上中下三焦,气机不利,水湿内停,发为水肿;二因临床长期应用糖皮质激素,也致“药源性湿热证”。湿热内蕴,则阻碍血行。故湿热夹瘀是导致肾病缠绵难愈原因之一。方中石韦清热利湿,木贼清热止血,益母草活血祛瘀,利尿消肿,诸药共奏清热利湿,化瘀消肿之功。本实验表明外源性IL-1、IL-6、TNF可刺激GMC DNA合成增加。并进一步证实利肾口服液除能直接抑制GMC的增殖外,尚可显著拮抗IL-1、IL-6、TNF刺激GMC DNA合成作用,且这种抑制作用随剂量增加呈增强趋势。可见,直接抑制GMC和拮抗外源性上述因子对GMC的刺激作用是利肾口服液防治肾小球硬化发生发展的机理之一。
(本文承蒙华西医科大学第一附属医院肾内科许国章教授、樊均明博士和基础医学院免疫研究室魏大鹏技师的大力帮助,特此表示谢意)。
★四川省教委资助课题(97035)
参考文献
1 王海燕.肾脏病学.北京∶人民卫生出版社,1996.2
2 谌贻璞,高 进.肾小球系膜细胞培养.北京医科大学学报,1989,24(4)∶335
3 杨景山.医学细胞生物技术.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1990.6,444
4 赵志辉,王海燕.地塞米松、降钙素基因相关肽、THP对系膜细胞与IL-1相互作用的影响.中华肾脏病杂志,1994,10(5)∶262
(修回日期:1999-02-07), 百拇医药(钟柏松* 石锦萍* 常克* 吴巍* 荣晓凤* 指导 吴康衡*)
单位:
关键词:@利肾口服液;药理学;系膜细胞;清热利湿
新中医990920 提要 探讨利肾口服液治疗系膜细胞增殖型肾炎的机理。以肾小球系膜细胞培养技术,3H-TdR掺入测定法。结果:利肾口服液高、中剂量组3H-TdR掺入值极显著低于空白组和IL-1、IL-6、TNF组(P<0.01);IL-1、IL-6、TNF组3H-TdR掺入值极显著高于空白组(P<0.01)。提示:直接抑制系膜细胞和拮抗IL-1、IL-6、TNF刺激系膜细胞异常增殖是利肾口服液治疗以系膜细胞增殖为主要病理的肾小球肾炎的机理之一。
, 百拇医药
肾小球系膜细胞(GMC)的增殖及其基质的病理性聚积是肾小球硬化的主要病理。研究表明某些细胞因子在肾小球肾炎的发生发展和慢性化过程中起重要作用〔1〕;若探索出拮抗这些细胞因子的中药,则可望在一定程度上防止肾小球病变的发生和发展。本研究观察了利肾口服液拮抗细胞因子对GMC影响。
1 材料和方法
1.1 材料 大白鼠,重200g(由华西医科大学动物实验室提供),RPMI-1640(美国GIBCO公司提供),普通胰岛素(美国Sigma公司提供),利肾口服液(由石韦、木贼、益母草等组成,本校附院制剂室提供);1g/ml(相当于含生药3g/ml),滤过除菌,无菌7.5% NaHCO3调pH值至7.1~7.4。IL-110万u/支、IL-6 10万u/支、TNF 5万u/支、地塞米松5mg/ml(中国军事医学科学院提供)。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 GMC的培养 参照谌贻璞氏法〔2〕。第3代GMC用于实验。
1.2.2 分组 共分6组,每组设6复孔。将GMC配成1.5×104/ml的悬液,转种至96孔板,200 μl/孔,预培24小时,使大部分细胞同步在G0期。除空白组外,其余分别再加入含IL-1、IL-6、TNF各100U/ml各等份和利肾口服液高、中、低剂量组(简称中药组,7.5mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml)以及地塞米松10μg/ml的培养液40μl。置37℃5%CO2恒温培养箱共孵育24小时,于最后6小时每孔添加2.5μCiH-TdR(放射性比度20Ci/mmol)继续培养6小时,再添加0.02%胰蛋白酶消化细胞30分钟,收集细胞凉干,用LKB-1211液闪仪记录样品CPM值。
1.2.3 统计学处理 抑制率参照〔3〕公式计算。采用方差分析及t检验处理数据,统计软件为SPSS。
, 百拇医药
2 结果
2.1 利肾口服液直接对GMC的抑制作用 见表1。
表1 利肾口服液对GMC的直接作用(±s) 组别
n
剂量
CPM
抑制率
(%)
空 白 组
6
Ⅱ号液20μl
, 百拇医药
1988.5±153.45
+地米组
6
10μg/ml
1214.2±259.98※
39.34
+利肾高
6
7.5mg/ml
1168.0±105.22※※
41.26
+利肾中
, 百拇医药
6
5mg/ml
1334.8±49.44※※
32.87
+利肾低
6
2.5mg/ml
1387.2±71.01※※#
30.23
注:※与空白组比较P<0.05;#与地米组比较P<0.05,※※与空白组比较P<0.01(下同)
从表1可以看出,地塞米松能直接抑制GMC的增殖,与同类研究结果近似〔4〕。中药高、中、低剂量组与地塞米松组CPM值均显著低于空白组(P<0.01)。提示利肾口服液可显著直接抑制GMC增殖。中药高、中、低剂量组之间有一定的量效关系。其抑制率由强至弱的顺序为利肾高剂量组>地塞米松组>利肾中剂量组>利肾低剂量组。
, 百拇医药
2.2 利肾口服液拮抗IL-1刺激GMC的增殖作用 见表2。
从表2可以看出,加IL-1组CPM显著高于空白组(P<0.01),提示IL-1能促进GMC增殖;而在IL-1培养皿中加用中药各剂量组及地塞米松组均可显著抑制IL-1刺激GMC异常增殖作用(P<0.01)。
2.3 利肾口服液拮抗IL-6刺激GMC的增殖作用 见表3。表2 利肾口服液拮抗IL-1刺激GMC增殖的作用(±s) 剂量
n
剂量
CPM
抑制率
, 百拇医药 (%)
空白组
6
Ⅱ号液20μl
1988.5±153.45
IL-1组
6
100U
3696.3±606.68※※
-85.88
+地米组
6
, 百拇医药 10μg/ml
1882.2±139.39△△
49.08
+利肾高
6
7.5mg/ml
1939.2±75.99△△
47.54
+利肾中
6
5mg/ml
1903.7±203.98△△
, 百拇医药
48.50
+利肾低
6
2.5mg/ml
2254.5±28.36※##△△
39.01
注:△△与IL-1组比较P<0.01,##与地米组比较P<0.01
表3 利肾口服液拮抗IL-6刺激GMC增殖的作用(±s) 组别
n
剂量
, http://www.100md.com
CPM
抑制率
(%)
空白组
6
Ⅱ号液20μl
1988.5±153.45
IL-6组
6
100u
3048.8±260.71※※
-53.32
, 百拇医药
+地米组
6
10μg/ml
1665.3±109.64※※△△
45.78
+利肾高
6
7.5mg/ml
1311.8±61.54※※##△△
56.98
+利肾中
6
, http://www.100md.com
5mg/ml
1545.3±157.01※※△△
49.31
+利肾低
6
2.5mg/ml
2229.3±357.29△##
26.88
注:△与IL-6组比较P<0.05,△△与IL-6组比较P<0.01
从表3可以看出,在IL-6培养皿中加用中药各剂量组及地塞米松组均可显著抑制IL-6刺激MC异常增殖的作用(P<0.01),中药高、中、低剂量组之间有一定量效关系。
, 百拇医药
2.4 利肾口服液拮抗TNF刺激GMC的增殖作用 见表4。表4 利肾口服液拮抗TNF刺激GMC增殖的作用(±s) 组别
n
剂量
CPM
抑制率
(%)
空白组
6
Ⅱ号液20μl
1988.5±153.45
, 百拇医药 TNF组
6
100u
2949.0±595.76※※
-48.30
+地米组
6
10μg/ml
1522.3±170.34※※△△
48.38
+利肾高
6
, http://www.100md.com
7.5mg/ml
1362.8±47.28※※△△#
53.79
+利肾中
6
5mg/ml
2003.8±201.98△△#
32.05
+利肾低
6
2.5mg/ml
2435.8±89.41※※△##
, 百拇医药
17.40
注:△与TNF组比较P<0.05,△△与TNF组比较P<0.01
从表4可以看出:在TNF培养皿中加用中药各剂量组及地塞米松组均可显著抑制TNF刺激MC异常增殖的作用(P<0.05~0.01)。
3 讨论
多种肾小球疾病发生发展的结果均可导致肾小球硬化,虽引起其硬化的因素很多,但其中IL-1、IL-6、TNF作用于GMC使其异常增生是主因之一。人类多种肾小球疾病,如IgA肾病、膜增生性肾炎、狼疮性肾炎、局灶性肾小球硬化等主要病变均与GMC增生密切相关。IL-1、IL-6、TNF等因子可由GMC分泌产生,且也与GMC膜上相应的受体结合,刺激GMC增殖,并使GMC产生大量的超氧阴离子损伤肾小球,以及GMC增生而致使肾小球基底膜损伤出现大量蛋白尿。因此,阻断这些因子可以防止肾小球疾病的发生发展〔1〕。虽糖皮质激素是治疗肾病的常用药之一,但疗效仍不理想。国内尚未见有关探讨中医药复方对细胞因子影响的报道。
, http://www.100md.com
本病中医学多从“水肿”论治。一因外感湿热,困阻上中下三焦,气机不利,水湿内停,发为水肿;二因临床长期应用糖皮质激素,也致“药源性湿热证”。湿热内蕴,则阻碍血行。故湿热夹瘀是导致肾病缠绵难愈原因之一。方中石韦清热利湿,木贼清热止血,益母草活血祛瘀,利尿消肿,诸药共奏清热利湿,化瘀消肿之功。本实验表明外源性IL-1、IL-6、TNF可刺激GMC DNA合成增加。并进一步证实利肾口服液除能直接抑制GMC的增殖外,尚可显著拮抗IL-1、IL-6、TNF刺激GMC DNA合成作用,且这种抑制作用随剂量增加呈增强趋势。可见,直接抑制GMC和拮抗外源性上述因子对GMC的刺激作用是利肾口服液防治肾小球硬化发生发展的机理之一。
(本文承蒙华西医科大学第一附属医院肾内科许国章教授、樊均明博士和基础医学院免疫研究室魏大鹏技师的大力帮助,特此表示谢意)。
★四川省教委资助课题(97035)
参考文献
1 王海燕.肾脏病学.北京∶人民卫生出版社,1996.2
2 谌贻璞,高 进.肾小球系膜细胞培养.北京医科大学学报,1989,24(4)∶335
3 杨景山.医学细胞生物技术.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1990.6,444
4 赵志辉,王海燕.地塞米松、降钙素基因相关肽、THP对系膜细胞与IL-1相互作用的影响.中华肾脏病杂志,1994,10(5)∶262
(修回日期:1999-02-07), 百拇医药(钟柏松* 石锦萍* 常克* 吴巍* 荣晓凤* 指导 吴康衡*)