鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基诱导SGC-7901胃癌细胞的凋亡
作者：范如英 马力
单位：范如英 中国人民解放军北京军区总医院消化内科 北京市 100700；马力 兰州医学院第二附属医院消化内科 甘肃省兰州市 730030
关键词：鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基；胃肿瘤；凋亡
世界华人消化杂志990932 中国图书馆分类号 R 735.2
Subject headings podophyllic acid piperidyl hydrazone hitroxide radical; Stomach neoplasms; Apoptosis
鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基(GP1)是从中草药桃儿七(采自青海民和)中提取的有效抗癌成分鬼臼脂毒素的衍生物. 它比鬼臼脂毒素抗癌活性强且毒性低[1]. GP1对小鼠移植肿瘤有抑制作用[2]. 它对小鼠白血病细胞DNA RNA及蛋白质均有抑制作用，其ID50小于VP16[3]. GP1对人类胃癌细胞的增长影响如何，它是否具有诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用尚未见报道，现对GP1作初步探讨.
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1 材料和方法
1.1 材料 GP1由兰州大学化学系合成提供，用100 mL/ L丙二醇配制成1 g/ L过滤除菌-20℃保存. RPMI1640为美国Gibco公司产品. 小牛血清由兰州医学院血液病研究所提供. MTT试剂为Sigma公司产品，用0.01 mol/ L，pH=7.20 PBS液配成5 g/ L的储存液-20℃保存. 人胃癌细胞SGC-7901引自第四军医大学西京医院. 细胞用含100 mL/ L的小牛血清的RPMI1640完全培养基培养，培养液里另加谷氨酰胺300 mg/ L青霉素100 kU/ L，链霉素100 mg/ L pH 7.20细胞置于37℃，50 mL/ L CO2培养箱中培养.
1.2 方法
1.2.1 MTT法实验参考Mosmann[4]方法 取对数生长期细胞，每孔5×103细胞接种于96孔培养板中，培养24 h. 实验孔分别加入不同浓度的GP1. 每孔设3个复孔，培养48 h，每孔加入5 g/ L的MTT液10 μL，继续培养4 h，再加入100 μL SDS溶液终止反应，37℃培养箱中过夜以使甲簪彻底溶解. 在酶联免疫检测仪570 nm波长处测吸光度A. 每个GP1浓度计算出A均值，按以下公式计算相对抑制率(IR).
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1.2.2 细胞形态学观察 普通光镜HE及荧光染片：将已消毒的盖玻片分别放入24孔板中，每孔加入对数生长期的细胞培养24 h，各孔分别加入不同浓度的GP1，每个药物浓度设立3个复孔. 按设定时间取出盖玻片并迅速投入950 mL/ L(4℃)乙醇中，固定20min取出凉干，常规HE及荧光染色. 分别采用普通光镜及荧光显微镜观察. 再将6×105经GP1作用后的SGC-7901细胞用40 mL/ L戊二醛固定；10 g/ L四氧化锇后固定；梯度酒精脱水；环氧树脂Epon-812包埋；超薄切片观察；醋酸铀和柠檬酸铅双染；JEM100CX透射电镜观察.
2 结果
2.1 GP1对SGC-7901细胞生长的抑制作用(图1) 各种药物浓度GP1作用于SGC-7901细胞48 h用MTT法测试结果表明，GP1对SGC-7901细胞有明显的抑制作用，且其相对抑制率与药物浓度之间呈显著直线相关(图1)，(相关系数γ=0.992，P<0.01).
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图1 GP1对SGC-7901细胞生长的抑制作用.
2.2 细胞形态学观察 加GP1后，倒置显微镜下可见到细胞膜皱缩，体积变小，变圆，细胞间失去联系，原来贴壁生长的细胞脱离生长面，呈悬浮状态. 有的细胞有伪足样突起，核仁消失，苔盼兰染色呈拒染性. HE染色后光镜下可见凋亡细胞形态特征性变化，凋亡细胞体积变小，变圆，胞质浓染，胞膜皱缩，染色质致密，有的细胞致密核分布在核膜下，呈月牙状或腰带状，核仁消失. 有的细胞核膜消失，核碎片分布在胞质中，胞膜伸出伪足样突起(芽生). 有的视野可见体积小，胞质成分少，含有或不含致密染色质碎片的小体样结构，即凋亡小体. 高倍镜下随机计数1000个细胞，计算出凋亡指数AI(%)与GP1浓度呈显著正相关(γ=0.988，P<0.05). 凋亡指数在作用24 h内随时间的延长而增长，经统计学处理，凋亡指数与作用时间呈显著正相关(γ=0.987，P<0.05). 口 丫啶噔染色荧光显微镜下凋亡细胞呈致密浓染颗粒或块状荧光，可见芽生现象. 透射显微镜下可见凋亡细胞胞膜表面微绒毛减少或消失，胞体体积缩小，胞质致密度增高，线粒体结构基本清晰，有些内质网空泡变形. 胞核染色质固缩沿核膜分布，有的核膜清晰可见，有的核膜部分消失. 形成凋亡小体(图2).
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图2 电镜下SGC-7901细胞凋亡小体形成.
3 讨论
GP1是从我国中草药桃儿七中提取的鬼臼脂毒素的衍生物，它能抑制小鼠移植瘤的生长，但它具有诱导人类胃癌细胞凋亡作用尚未见报道. 本实验表明，GP1能够诱导人类胃癌细胞SGC-7901出现凋亡的特征性形态学变化证实诱导细胞凋亡是GP1抗肿瘤作用的重要机制. 传统认为肿瘤是由于细胞过度增长导致，对于肿瘤的基础研究主要是肿瘤细胞过度增生的生物学行为，相应临床上也主要围绕如何抑制肿瘤细胞增长来进行治疗. 近年来随着凋亡研究的深入，认识到肿瘤是由于局部组织增生与凋亡失衡而形成，如何诱导肿瘤细胞凋亡为抗癌治疗提供了新途径[5]，能否诱导细胞凋亡也已成为筛选有效抗癌药物的重要指标. 本实验表明，GP1能够诱导胃癌细胞凋亡，为GP1治疗胃癌提供了直接实验依据，为中药桃儿七的开发利用提供了一定的线索.
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注：作者现系第三军医大学消化内科专业在读博士生
通讯作者 范如英
4 参考文献
1 陈耀祖，张长久，田喧. 具抗癌活性的鬼臼毒自旋标记物衍生物. 中国科学(B)，1986：1205-1211
2 王达纬，张培琰，梁重栋. 鬼臼酰乙基肼和鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基(GP1)对小鼠移植性肿瘤作用的实验观察. 兰州医学院学报，1984：19-20
3 王志军，毛小娟，张培琰，梁重栋，田喧. GP1与VP16对体外白血病L7712细胞DNA与蛋白质代谢的影响. 中国药理学报，1989；10：377-380
4 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survial: application to proliferation and cytotoxity assays. J Immunal Methods, 1983;65:55-63
5 朱海青，尹兆红. 与凋亡相关的基因及其在血液系统恶性病中的作用. 国外医学输血与血液学分册， 1995；18：196-198
收稿日期 1999-04-08 收回日期 1999-06-03, http://www.100md.com
单位：范如英 中国人民解放军北京军区总医院消化内科 北京市 100700；马力 兰州医学院第二附属医院消化内科 甘肃省兰州市 730030
关键词：鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基；胃肿瘤；凋亡
世界华人消化杂志990932 中国图书馆分类号 R 735.2
Subject headings podophyllic acid piperidyl hydrazone hitroxide radical; Stomach neoplasms; Apoptosis
鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基(GP1)是从中草药桃儿七(采自青海民和)中提取的有效抗癌成分鬼臼脂毒素的衍生物. 它比鬼臼脂毒素抗癌活性强且毒性低[1]. GP1对小鼠移植肿瘤有抑制作用[2]. 它对小鼠白血病细胞DNA RNA及蛋白质均有抑制作用，其ID50小于VP16[3]. GP1对人类胃癌细胞的增长影响如何，它是否具有诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用尚未见报道，现对GP1作初步探讨.
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1 材料和方法
1.1 材料 GP1由兰州大学化学系合成提供，用100 mL/ L丙二醇配制成1 g/ L过滤除菌-20℃保存. RPMI1640为美国Gibco公司产品. 小牛血清由兰州医学院血液病研究所提供. MTT试剂为Sigma公司产品，用0.01 mol/ L，pH=7.20 PBS液配成5 g/ L的储存液-20℃保存. 人胃癌细胞SGC-7901引自第四军医大学西京医院. 细胞用含100 mL/ L的小牛血清的RPMI1640完全培养基培养，培养液里另加谷氨酰胺300 mg/ L青霉素100 kU/ L，链霉素100 mg/ L pH 7.20细胞置于37℃，50 mL/ L CO2培养箱中培养.
1.2 方法
1.2.1 MTT法实验参考Mosmann[4]方法 取对数生长期细胞，每孔5×103细胞接种于96孔培养板中，培养24 h. 实验孔分别加入不同浓度的GP1. 每孔设3个复孔，培养48 h，每孔加入5 g/ L的MTT液10 μL，继续培养4 h，再加入100 μL SDS溶液终止反应，37℃培养箱中过夜以使甲簪彻底溶解. 在酶联免疫检测仪570 nm波长处测吸光度A. 每个GP1浓度计算出A均值，按以下公式计算相对抑制率(IR).
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1.2.2 细胞形态学观察 普通光镜HE及荧光染片：将已消毒的盖玻片分别放入24孔板中，每孔加入对数生长期的细胞培养24 h，各孔分别加入不同浓度的GP1，每个药物浓度设立3个复孔. 按设定时间取出盖玻片并迅速投入950 mL/ L(4℃)乙醇中，固定20min取出凉干，常规HE及荧光染色. 分别采用普通光镜及荧光显微镜观察. 再将6×105经GP1作用后的SGC-7901细胞用40 mL/ L戊二醛固定；10 g/ L四氧化锇后固定；梯度酒精脱水；环氧树脂Epon-812包埋；超薄切片观察；醋酸铀和柠檬酸铅双染；JEM100CX透射电镜观察.
2 结果
2.1 GP1对SGC-7901细胞生长的抑制作用(图1) 各种药物浓度GP1作用于SGC-7901细胞48 h用MTT法测试结果表明，GP1对SGC-7901细胞有明显的抑制作用，且其相对抑制率与药物浓度之间呈显著直线相关(图1)，(相关系数γ=0.992，P<0.01).
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图1 GP1对SGC-7901细胞生长的抑制作用.
2.2 细胞形态学观察 加GP1后，倒置显微镜下可见到细胞膜皱缩，体积变小，变圆，细胞间失去联系，原来贴壁生长的细胞脱离生长面，呈悬浮状态. 有的细胞有伪足样突起，核仁消失，苔盼兰染色呈拒染性. HE染色后光镜下可见凋亡细胞形态特征性变化，凋亡细胞体积变小，变圆，胞质浓染，胞膜皱缩，染色质致密，有的细胞致密核分布在核膜下，呈月牙状或腰带状，核仁消失. 有的细胞核膜消失，核碎片分布在胞质中，胞膜伸出伪足样突起(芽生). 有的视野可见体积小，胞质成分少，含有或不含致密染色质碎片的小体样结构，即凋亡小体. 高倍镜下随机计数1000个细胞，计算出凋亡指数AI(%)与GP1浓度呈显著正相关(γ=0.988，P<0.05). 凋亡指数在作用24 h内随时间的延长而增长，经统计学处理，凋亡指数与作用时间呈显著正相关(γ=0.987，P<0.05). 口 丫啶噔染色荧光显微镜下凋亡细胞呈致密浓染颗粒或块状荧光，可见芽生现象. 透射显微镜下可见凋亡细胞胞膜表面微绒毛减少或消失，胞体体积缩小，胞质致密度增高，线粒体结构基本清晰，有些内质网空泡变形. 胞核染色质固缩沿核膜分布，有的核膜清晰可见，有的核膜部分消失. 形成凋亡小体(图2).
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图2 电镜下SGC-7901细胞凋亡小体形成.
3 讨论
GP1是从我国中草药桃儿七中提取的鬼臼脂毒素的衍生物，它能抑制小鼠移植瘤的生长，但它具有诱导人类胃癌细胞凋亡作用尚未见报道. 本实验表明，GP1能够诱导人类胃癌细胞SGC-7901出现凋亡的特征性形态学变化证实诱导细胞凋亡是GP1抗肿瘤作用的重要机制. 传统认为肿瘤是由于细胞过度增长导致，对于肿瘤的基础研究主要是肿瘤细胞过度增生的生物学行为，相应临床上也主要围绕如何抑制肿瘤细胞增长来进行治疗. 近年来随着凋亡研究的深入，认识到肿瘤是由于局部组织增生与凋亡失衡而形成，如何诱导肿瘤细胞凋亡为抗癌治疗提供了新途径[5]，能否诱导细胞凋亡也已成为筛选有效抗癌药物的重要指标. 本实验表明，GP1能够诱导胃癌细胞凋亡，为GP1治疗胃癌提供了直接实验依据，为中药桃儿七的开发利用提供了一定的线索.
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注：作者现系第三军医大学消化内科专业在读博士生
通讯作者 范如英
4 参考文献
1 陈耀祖，张长久，田喧. 具抗癌活性的鬼臼毒自旋标记物衍生物. 中国科学(B)，1986：1205-1211
2 王达纬，张培琰，梁重栋. 鬼臼酰乙基肼和鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基(GP1)对小鼠移植性肿瘤作用的实验观察. 兰州医学院学报，1984：19-20
3 王志军，毛小娟，张培琰，梁重栋，田喧. GP1与VP16对体外白血病L7712细胞DNA与蛋白质代谢的影响. 中国药理学报，1989；10：377-380
4 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survial: application to proliferation and cytotoxity assays. J Immunal Methods, 1983;65:55-63
5 朱海青，尹兆红. 与凋亡相关的基因及其在血液系统恶性病中的作用. 国外医学输血与血液学分册， 1995；18：196-198
收稿日期 1999-04-08 收回日期 1999-06-03, http://www.100md.com