bFGF对缺血再灌注后肠道内源性bFGF和TGF β表达的影响
作者：杨银辉 付小兵 孙同柱 蒋礼先 顾小曼
单位：中国人民解放军304医院创伤研究室 北京市 100037
关键词：成纤维细胞生长因子，碱性；转化生长因子β；肠缺血再灌注损伤
中国图书馆分类号 R 574中国图书馆分类号 R 574
Subject headings fibroblast growth factor, basic; transforming growth factor beta; gut ischimia-reperfusion injury
缺血再灌注是严重创伤、烧伤休克救治过程中发生的一个共同的病理过程，其中肠道是缺血性损伤打击的主要器官，其受损后结构与功能恢复的好坏将直接影响多脏器功能障碍综合征(MODS)甚至多器官功能衰竭(MSOF)的发生[1]. 研究发现，某些生长因子不仅能够促进和加速体表创面的修复，而且也可明显减轻和改善内脏缺血后的损伤程度[2，3]，表明生长因子在促进缺血性内脏损伤的修复中起重要作用. 我们观察缺血-再灌注损伤后肠道自身碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β(TGF β)表达的变化规律，以及外源性应用bFGF治疗后对内源性bFGF和TGF β表达量的影响，探讨生长因子促进内脏损伤修复的分子机制及其与器官功能恢复的关系.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 健康♂Wistar大鼠(军事医学科学院动物中心提供)64只，体重200 g～250 g，随机分为假手术组(A组)、缺血-再灌注组(B组)和bFGF治疗组(C组). 其中，B组根据时间不同分为缺血45min即刻、再灌注6 h，24 h和48 h四组，C组依缺血45min后再灌注时间的不同分为再灌注6 h，24 h，48 h，三组，每组8只动物. 大鼠腹腔注射20 g/ L戊巴比妥纳麻醉后，无菌条件下分离肠系膜上动脉(SMA)，用无创血管夹夹闭SMA根部，完全阻断血流45min后放松血管夹，使肠道血流恢复，形成再灌注. 假手术组只分离SMA，但不夹闭，45min后关腹.
1.2 方法 C组动物依B组动物方法夹闭SMA后，于再灌注发生即刻从右颈静脉注射0.15 mL bFGF肝素生理盐水(bFGF 4 μg/ 只)，然后关闭腹腔，皮下注射3 mL生理盐水抗休克. 所有动物在不同时间点活杀，取小肠组织，100 mL/ L福尔马林固定. 不同时间点取动物小肠组织，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察. 组织中bFGF和TGF β表达的检测采用免疫组织化学SP方法. bFGF，TGF β抗体及SP试剂盒均购自Santa Cruz公司，实验按试剂盒说明书进行. 石蜡包埋切片，行抗原热修复，一抗用抗体稀释液1∶100稀释，光镜下观察， 胞质或(和)胞膜为棕色者为阳性染色，用PBS代替一抗作阴性对照. 免疫组化结果在光镜下观察，以胞质或(和)胞膜染成棕褐色者为阳性细胞，400倍镜下随机选取5个视野，计数阳性细胞数，数据以x±s表示，进行χ2检验，相关分析等.2 结果
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光镜下可见缺血45min再灌注6 h时，肠道结构损伤最严重，有明显的组织水肿，粘膜 脱落，大量中性粒细胞浸润，部分粘膜细胞变性、坏死，呈均质状. 再灌流24 h时肠粘膜结构部分恢复，48 h已基本恢复. bFGF治疗组肠道损伤减轻，再灌流6 h时仅少量粘膜细胞呈局灶性变性、脱落.
2.1 内源性bFGF与TGF β在小肠组织的分布 bFGF主要分布于肠绒毛固有层的中性粒细胞、淋巴细胞以及粘膜下层的血管内皮细胞等. 而TGF β主要分布于肠绒毛固有层的淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等，以及粘膜下层结缔组织中. 再灌注6 h则大量分布于脱落的粘膜细胞以及释放入管腔的中性粒细胞等.
2.2 外源性bFGF对肠道bFGF与TGF β表达水平变化的影响 正常小肠组织(假手术组)中，bFGF与TGF β均存在少量表达. 缺血45min即刻，bFGF与TGF β表达量均有所增加，而TGF β增高更明显(P<0.01) . 再灌注后6 h， 24 h，48 h bFGF与TGF β水平显著增高(P<0.01) ，与假手术组相比，差异极显著，分别于再灌注24 h和6 h达峰值，约为假手术组的3.4倍和3.3倍. 在再灌注后48 h表达水平开始降低，但bFGF与假手术组相比，差异仍有显著性意义(P<0.05). 外源性给予bFGF治疗后，bFGF与TGF β表达水平在再灌注后6 h和24 h有所提高，但与B组相比，只有bFGF在再灌注6 h达到差异显著水平(P<0.05).
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表1 小肠组织内源性bFGF与TGF β表达的变化 (n=8)
分组
bFGF阳性细胞数
TGFβ阳性细胞数
B组
C组
B组
C组
假手术
35±5
37±4
缺血即刻
, http://www.100md.com
45±5
59±4a
再灌注6h
105±4a
116±6
122±6a
141±5
再灌注24h
119±4a
136±5b
82±3a
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92±8
再灌注48h
71±5a
84±7
45±5
38±6
aP<0.01，vs假手术组；bP<0.05，vsB组.
3 讨论
大量研究证实，bFGF，PDGF，TGF β，EGF等生长因子在体表创面中具有明显的促修复作用，并基本阐明了其作用机制. 同时也发现某些生长因子具有促进内脏损伤修复的作用[2，4]. 但对肠、肝等内脏修复的研究较少，且只停留在观察外源性应用生长因子对脏器功能影响的量效关系上，对其促进修复作用的分子机制仍不了解. 因此我们探讨外源性应用bFGF促进肠缺血-再灌注损伤修复的分子机制，为应用生长因子促进内脏损伤修复、减少临床烧、创伤休克后严重并发症的发生提供理论基础.
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bFGF是由血管内皮细胞、成纤维细胞等分泌的一种单链多肽[5]，具有显著的促进血管生成，刺激表皮细胞、成纤维细胞等生长，趋化内皮细胞迁移、加速肉芽组织的生成等作用. 而TGF β的作用随靶细胞类型及局部浓度的不同而不同[6]，它是单核细胞、淋巴细胞等的趋化剂，同时又能刺激成纤维细胞合成细胞外基质等. 本实验发现在再灌注6 h后，肠道bFGF和TGF β表达量增高，持续到24 h，到48 h时开始降低，这与bFGF和TGF β mRNA在肠道缺血再灌注后表达变化的趋势一致[7]，表明肠道损伤同时诱导了bFGF和TGFβ mRNA和蛋白的表达. 由于bFGF没有信号肽序列，其分泌途径仍在探讨中，我们的实验结果发现再灌注6 h和24 h，bFGF表达量显著提高，而组织学观察也发现，此时肠道结构损伤最严重，出现了粘膜细胞的变性、坏死. 因此，bFGF在肠道缺血性损伤后的分泌可能通过原生质膜的破坏，从胞质中直接释放到周围组织，符合Muthukrishnan et al[8]的设想.
, http://www.100md.com
实验结果还发现，外源性给予bFGF后，肠道缺血再灌注的损伤减轻，组织学破坏得到改善，但与非治疗组比较，只有bFGF在再灌注6 h表达量有显著性增加(P<0.05)，其余改变均未达到显著性水平(P>0.05). 有研究报道，bFGF蛋白可正向调节其自身mRNA的表达，与我们的实验结果对照，推测外源性应用bFGF可能上调肠道自身bFGF的表达，但对TGF β的表达量无明显的调节作用. 表明外源性bFGF对肠道损伤的修复作用的一部分可能是通过上调肠道自身bFGF的表达水平而实现的.
注：国家杰出青年科学基金资助项目，No.39525024
通讯作者 杨银辉
4 参考文献
1 Sheng ZY, Dong YL, Wang XH. Bacterial translocation and multiple system organ failure in bowel ischemia and reperfusion. J Trauma, 1992;32:148-153
, http://www.100md.com
2 付小兵，王亚平，叶一秀，孙同柱，马诺山，常国友，许明火，周宝桐，盛志勇. 碱性成纤维细胞生长因子对肠道和肝缺血性损伤的影响. 解放军医学杂志，1996；21：121-122
3 Fu XB, Sheng ZY, Wang YP, Ye YX, Xu MH, Sun TZ, Zhou BT. Basic fibroblast growth factor reduces the gut and liver morphologic and functional injuries after ischemia and reperfusion. J Trauma, 1997;42:1080-1087
4 Fu XB, Cuevas P, Gimenez-Gallego G, Tian HM, Sheng ZY. Acidic fibroblast growth factor reduces renal morpgologic and functional indicators of injury caused by ischemia and reperfusion. Wound Rep Reg, 1996;4:297-303
, 百拇医药
5 Thompson WD, Harvey JA, Kazmi MA, Stout AJ. Fibrolysis and angiogenesis in wound healing. J Pathol, 1991;165:311-318
6 Sporn MB, Roberts AB. Transforming growth factor-beta: recent progress and new challenges. J Cell Biol, 1992;119:1017-1021
7 付小兵，杨银辉，孙同柱，蒋礼先，王亚平，周宝桐. 缺血再灌注对大鼠肠道组织碱性成纤维细胞生长因子和TGF β基因表达的影响. 中国危重病急救医学，1998；10：459-462
8 Muthukrishnan L, Warder E, McNeil PL. Basic fibroblast growth factor is efficiently released from a cytosolic storage site through plasma memberane disruptions of endothelial cells. J Cell Physiol, 1991;148:1-16
收稿日期 1999-04-08 修回日期 1999-06-03, http://www.100md.com
单位：中国人民解放军304医院创伤研究室 北京市 100037
关键词：成纤维细胞生长因子，碱性；转化生长因子β；肠缺血再灌注损伤
中国图书馆分类号 R 574中国图书馆分类号 R 574
Subject headings fibroblast growth factor, basic; transforming growth factor beta; gut ischimia-reperfusion injury
缺血再灌注是严重创伤、烧伤休克救治过程中发生的一个共同的病理过程，其中肠道是缺血性损伤打击的主要器官，其受损后结构与功能恢复的好坏将直接影响多脏器功能障碍综合征(MODS)甚至多器官功能衰竭(MSOF)的发生[1]. 研究发现，某些生长因子不仅能够促进和加速体表创面的修复，而且也可明显减轻和改善内脏缺血后的损伤程度[2，3]，表明生长因子在促进缺血性内脏损伤的修复中起重要作用. 我们观察缺血-再灌注损伤后肠道自身碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β(TGF β)表达的变化规律，以及外源性应用bFGF治疗后对内源性bFGF和TGF β表达量的影响，探讨生长因子促进内脏损伤修复的分子机制及其与器官功能恢复的关系.
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1 材料和方法
1.1 材料 健康♂Wistar大鼠(军事医学科学院动物中心提供)64只，体重200 g～250 g，随机分为假手术组(A组)、缺血-再灌注组(B组)和bFGF治疗组(C组). 其中，B组根据时间不同分为缺血45min即刻、再灌注6 h，24 h和48 h四组，C组依缺血45min后再灌注时间的不同分为再灌注6 h，24 h，48 h，三组，每组8只动物. 大鼠腹腔注射20 g/ L戊巴比妥纳麻醉后，无菌条件下分离肠系膜上动脉(SMA)，用无创血管夹夹闭SMA根部，完全阻断血流45min后放松血管夹，使肠道血流恢复，形成再灌注. 假手术组只分离SMA，但不夹闭，45min后关腹.
1.2 方法 C组动物依B组动物方法夹闭SMA后，于再灌注发生即刻从右颈静脉注射0.15 mL bFGF肝素生理盐水(bFGF 4 μg/ 只)，然后关闭腹腔，皮下注射3 mL生理盐水抗休克. 所有动物在不同时间点活杀，取小肠组织，100 mL/ L福尔马林固定. 不同时间点取动物小肠组织，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察. 组织中bFGF和TGF β表达的检测采用免疫组织化学SP方法. bFGF，TGF β抗体及SP试剂盒均购自Santa Cruz公司，实验按试剂盒说明书进行. 石蜡包埋切片，行抗原热修复，一抗用抗体稀释液1∶100稀释，光镜下观察， 胞质或(和)胞膜为棕色者为阳性染色，用PBS代替一抗作阴性对照. 免疫组化结果在光镜下观察，以胞质或(和)胞膜染成棕褐色者为阳性细胞，400倍镜下随机选取5个视野，计数阳性细胞数，数据以x±s表示，进行χ2检验，相关分析等.2 结果
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光镜下可见缺血45min再灌注6 h时，肠道结构损伤最严重，有明显的组织水肿，粘膜 脱落，大量中性粒细胞浸润，部分粘膜细胞变性、坏死，呈均质状. 再灌流24 h时肠粘膜结构部分恢复，48 h已基本恢复. bFGF治疗组肠道损伤减轻，再灌流6 h时仅少量粘膜细胞呈局灶性变性、脱落.
2.1 内源性bFGF与TGF β在小肠组织的分布 bFGF主要分布于肠绒毛固有层的中性粒细胞、淋巴细胞以及粘膜下层的血管内皮细胞等. 而TGF β主要分布于肠绒毛固有层的淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等，以及粘膜下层结缔组织中. 再灌注6 h则大量分布于脱落的粘膜细胞以及释放入管腔的中性粒细胞等.
2.2 外源性bFGF对肠道bFGF与TGF β表达水平变化的影响 正常小肠组织(假手术组)中，bFGF与TGF β均存在少量表达. 缺血45min即刻，bFGF与TGF β表达量均有所增加，而TGF β增高更明显(P<0.01) . 再灌注后6 h， 24 h，48 h bFGF与TGF β水平显著增高(P<0.01) ，与假手术组相比，差异极显著，分别于再灌注24 h和6 h达峰值，约为假手术组的3.4倍和3.3倍. 在再灌注后48 h表达水平开始降低，但bFGF与假手术组相比，差异仍有显著性意义(P<0.05). 外源性给予bFGF治疗后，bFGF与TGF β表达水平在再灌注后6 h和24 h有所提高，但与B组相比，只有bFGF在再灌注6 h达到差异显著水平(P<0.05).
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表1 小肠组织内源性bFGF与TGF β表达的变化 (n=8)
分组
bFGF阳性细胞数
TGFβ阳性细胞数
B组
C组
B组
C组
假手术
35±5
37±4
缺血即刻
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45±5
59±4a
再灌注6h
105±4a
116±6
122±6a
141±5
再灌注24h
119±4a
136±5b
82±3a
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92±8
再灌注48h
71±5a
84±7
45±5
38±6
aP<0.01，vs假手术组；bP<0.05，vsB组.
3 讨论
大量研究证实，bFGF，PDGF，TGF β，EGF等生长因子在体表创面中具有明显的促修复作用，并基本阐明了其作用机制. 同时也发现某些生长因子具有促进内脏损伤修复的作用[2，4]. 但对肠、肝等内脏修复的研究较少，且只停留在观察外源性应用生长因子对脏器功能影响的量效关系上，对其促进修复作用的分子机制仍不了解. 因此我们探讨外源性应用bFGF促进肠缺血-再灌注损伤修复的分子机制，为应用生长因子促进内脏损伤修复、减少临床烧、创伤休克后严重并发症的发生提供理论基础.
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bFGF是由血管内皮细胞、成纤维细胞等分泌的一种单链多肽[5]，具有显著的促进血管生成，刺激表皮细胞、成纤维细胞等生长，趋化内皮细胞迁移、加速肉芽组织的生成等作用. 而TGF β的作用随靶细胞类型及局部浓度的不同而不同[6]，它是单核细胞、淋巴细胞等的趋化剂，同时又能刺激成纤维细胞合成细胞外基质等. 本实验发现在再灌注6 h后，肠道bFGF和TGF β表达量增高，持续到24 h，到48 h时开始降低，这与bFGF和TGF β mRNA在肠道缺血再灌注后表达变化的趋势一致[7]，表明肠道损伤同时诱导了bFGF和TGFβ mRNA和蛋白的表达. 由于bFGF没有信号肽序列，其分泌途径仍在探讨中，我们的实验结果发现再灌注6 h和24 h，bFGF表达量显著提高，而组织学观察也发现，此时肠道结构损伤最严重，出现了粘膜细胞的变性、坏死. 因此，bFGF在肠道缺血性损伤后的分泌可能通过原生质膜的破坏，从胞质中直接释放到周围组织，符合Muthukrishnan et al[8]的设想.
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实验结果还发现，外源性给予bFGF后，肠道缺血再灌注的损伤减轻，组织学破坏得到改善，但与非治疗组比较，只有bFGF在再灌注6 h表达量有显著性增加(P<0.05)，其余改变均未达到显著性水平(P>0.05). 有研究报道，bFGF蛋白可正向调节其自身mRNA的表达，与我们的实验结果对照，推测外源性应用bFGF可能上调肠道自身bFGF的表达，但对TGF β的表达量无明显的调节作用. 表明外源性bFGF对肠道损伤的修复作用的一部分可能是通过上调肠道自身bFGF的表达水平而实现的.
注：国家杰出青年科学基金资助项目，No.39525024
通讯作者 杨银辉
4 参考文献
1 Sheng ZY, Dong YL, Wang XH. Bacterial translocation and multiple system organ failure in bowel ischemia and reperfusion. J Trauma, 1992;32:148-153
, http://www.100md.com
2 付小兵，王亚平，叶一秀，孙同柱，马诺山，常国友，许明火，周宝桐，盛志勇. 碱性成纤维细胞生长因子对肠道和肝缺血性损伤的影响. 解放军医学杂志，1996；21：121-122
3 Fu XB, Sheng ZY, Wang YP, Ye YX, Xu MH, Sun TZ, Zhou BT. Basic fibroblast growth factor reduces the gut and liver morphologic and functional injuries after ischemia and reperfusion. J Trauma, 1997;42:1080-1087
4 Fu XB, Cuevas P, Gimenez-Gallego G, Tian HM, Sheng ZY. Acidic fibroblast growth factor reduces renal morpgologic and functional indicators of injury caused by ischemia and reperfusion. Wound Rep Reg, 1996;4:297-303
, 百拇医药
5 Thompson WD, Harvey JA, Kazmi MA, Stout AJ. Fibrolysis and angiogenesis in wound healing. J Pathol, 1991;165:311-318
6 Sporn MB, Roberts AB. Transforming growth factor-beta: recent progress and new challenges. J Cell Biol, 1992;119:1017-1021
7 付小兵，杨银辉，孙同柱，蒋礼先，王亚平，周宝桐. 缺血再灌注对大鼠肠道组织碱性成纤维细胞生长因子和TGF β基因表达的影响. 中国危重病急救医学，1998；10：459-462
8 Muthukrishnan L, Warder E, McNeil PL. Basic fibroblast growth factor is efficiently released from a cytosolic storage site through plasma memberane disruptions of endothelial cells. J Cell Physiol, 1991;148:1-16
收稿日期 1999-04-08 修回日期 1999-06-03, http://www.100md.com