转化生长因子β在主动型Heymann肾炎肾小球中的表达研究
作者：王照明 张建民 电镜室 张东生
单位：王照明 张建民 南京铁道医学院附属医院病理科 邮政编码：210009；张东生 南京铁道医学院附属医院电镜室
关键词：肾小球肾炎 免疫组化 转化生长因子
江苏医药991005 摘要 为探讨转化生长因子β(TGF-β)及三种异构体在不同病变阶段主动型Heymann肾炎(AHN)肾小球中的表达情况，建立AHN模型后，用免疫组化SP法检测了TGF-β三种异构体在不同病变阶段AHN大鼠肾小球内的表达情况。发现自AHN诱发后第4周开始，TGF-β三种异构体即有表达，至第六、第八周随AHN大鼠尿蛋白的增加，TGF-β三种异构体表达亦上调。TGF-β可能介导了AHN病变的发生及发展。
膜性肾病是成人肾病综合征的主要病理类型，大鼠的Heymann肾炎病变与人类的膜性肾病极为相似，是研究人类膜性肾病理想的动物模型。TGF-β是具有多种生物学功能的多肽类生长因子，它在肾小球肾炎及肾小球纤维化发生发展中的介导作用近年来引起了肾病研究者的关注。我们运用免疫组化SP法检测了TGF-β不同的异构体蛋白在不同病变阶段AHN大鼠肾小球中的表达情况。
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材料与方法
一、主动型Heymann肾炎(AHN)模型的建立
抗原物质FxIA的提取参照Edgington[1]的方法。AHN模型诱发参照Penny[2]等的方法，雄性SD大鼠36只(由南京铁道医学院动物中心提供)，重150～180g，随机分为实验组24只，对照组12只。实验组每只大鼠首次经后足垫注射经弗氏完全佐剂充分乳化的FxIA15mg，2周后以原抗原剂量一半经背部皮下加强免疫一次。对照组每次注射相同剂量不含FxIA的乳化的弗氏佐剂。在首次免疫后的第4、6、8、12周将大鼠置代谢笼内留24小时尿，用双缩脲法测尿蛋白总量，每次处死实验组大鼠6只，对照组大鼠3只，取肾脏分别作光镜、免疫荧光、免疫组化及电镜检查。
二、免疫荧光及免疫组化染色法
1.免疫荧光染色法：OCT包埋的大鼠肾皮质，在冰冻切片机上切厚4μm切片，分别滴加1∶8稀释的荧光标记羊抗大鼠IgG及羊抗大鼠C3(Cappel laboratory USA)，37℃孵育30分钟。
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2.免疫组化染色法：10%福尔马林固定的肾组织，常规石蜡包埋，切厚5μm切片，用免疫组化SP法检测TGF-β1、β2、β3蛋白表达(购自福州迈新公司)，染色强度的判断参照Shank-Land[3]等标准：(-)：背景染色，(+)：轻度或散在点状染色，(
)：中度或节段性染色，(
)：重度或弥漫性染色。
三、电镜检查
4%戊二醛固定的1mm3大小的肾皮质，经1%锇酸后固定，丙酮逐级脱水，Epon812包埋，超薄切片，醋酸钠及枸橼酸铅染色，透射电镜观察。
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结 果
一、对照组及AHN大鼠24小时尿蛋白的改变见表1。
表1 两组大鼠24小时尿蛋白总量变化(mg/24h，
±s)
实验组
对照组
P
实验前
1.28±0.65
1.35±0.46
, 百拇医药 >0.05
4周
8.68±6.99
2.46±1.16
<0.01
6周
19.03±8.05
1.51±0.68
<0.01
8周
22.84±11.82
4.24±1.29
, 百拇医药
<0.01
12周
11.53±2.61
3.01±1.52
<0.01
二、光镜检查：第4、6周实验组大鼠肾组织未见明显改变。第8周末实验组大鼠肾小球毛细血管壁有轻度弥漫性增厚。
三、免疫荧光检查：第4周末即可见IgG及C3呈颗粒状免疫荧光沿肾小球毛细血管壁分布。以第8周末羊抗大鼠IgG染色最强(
～
)。
, 百拇医药
四、电镜检查：第4周末在肾小球脏层上皮细胞下、基底膜表面出现散在小丘状电子致密沉积物，至第8周末见沉积物较第4周增多、增大。
五、免疫组化染色：对照组大鼠肾小球内TGF-β三种异构体表达呈(-)或仅见散在点状染色，实验组病变不同阶段肾小球内TGF-β表达情况见表2。表2 TGF-β三种异构体蛋白在不同病变阶段AHN肾小球内的表达(每组n＝6) 抗体
表达强度
4周
6周
8周
12周
TGF-β1
-
, 百拇医药
1
1
0
1
+
3
1
2
4
2
4
, 百拇医药 3
1
0
0
1
0
TGF-β2
-
1
1
0
, 百拇医药
1
+
4
3
3
3
1
2
2
2
, 百拇医药
0
0
1
0
TGF-β3
-
1
1
1
1
+
5
3
4
, 百拇医药
2
0
2
1
3
0
0
0
0
, http://www.100md.com
讨 论
TGF-β是一种分子量为25KD的同源二聚体蛋白，它有五种异构体，在哺乳动物中有TGF-β1、β2及β3三种异构体，这三种异构体生物学功能相似[4]。TGF-β具有多种生物学功能，参与了体内诸如组织发育、增生、血管形成、炎症、凋亡等多种生物学过程的调节[5]。在肾小球内TGF-β主要来源于上皮细胞、内皮细胞、系膜细胞及浸润的单核细胞。在肾脏内它主要发挥调节细胞外基质(ECM)形成，故对肾小球硬化的发生发展起着重要的促进作用[6]。
Yamamoto及Shankland等分别在ATS诱发的系膜增生性肾小球肾炎及糖尿病肾病动物模型中发现TGF-β蛋白、TGF-β mRNA表达明显上调，且以TGF-β1表达为主。这些病变主要涉及肾小球系膜细胞增生并生成大量ECM[7，8]。膜性肾病的病理特征表现为肾小球毛细血管上皮下免疫复合物形成，肾小球毛细血管基底膜增厚伴“钉突”形成，系膜细胞不增生。Shankland[3]在用抗FxIA血清诱发的被动型Heymann肾炎模型中检测了TGF-β三种异构体的表达情况，发现与对照组相比TGF-β3在病变诱发后的第10天表达上调，TGF-β2在不同的病变阶段表达均上调而TGF-β1表达未见明显改变。故他们认为：在以系膜细胞增生为主的肾小球疾病中，TGF-β1可能起主要的介导作用，而在以上皮细胞受损为主的肾小球疾病如膜性肾病中，TGF-β2、β3可能起主要的介导作用。本研究以FxIA作抗原诱发AHN为模型，免疫荧光及电镜检查证明AHN模型诱发是成功的，我们观察到从第4周开始，AHN大鼠肾小球内TGF-β三种异构体即有表达，开始时以(+)者居多，随着AHN大鼠24小时尿蛋白的增加，TGF-β表达也上调，至第6、第8周以(+)及()者居多，第8周有1例TGF-β1及TGF-β2染色呈强阳性。Nakamura[9]在体外培养的肾小球上皮细胞中加入TGF-β1后发现培养的上皮细胞合成纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原明显增多，层粘连蛋白轻度增加，证明TGF-β有刺激肾小球上皮细胞合成过量ECM的能力。Yoshioka[10]等检测了TGF-β在各型人类肾小球肾炎中的表达，2例膜性肾病患者肾小球内TGF-β1均呈()。Honkanen[11]等检测了41例膜性肾病患者尿中TGF-β1含量，膜性肾病患者尿内TGF-β1明显高于健康对照组，且尿内TGF-β1含量与尿内白蛋白含量相关。综合以上人类膜性肾病患者TGF-β1检测结果及本研究对AHN不同病变阶段TGF-β三种异构体的检测结果，笔者不支持Shankland提出的在以上皮细胞受损为主的肾小球肾炎中TGF-β1不起主要作用而以TGF-β2、β3可能起主要介导作用的观点。
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本研究结果显示，TGF-β三种异构体蛋白在AHN不同病变阶段肾小球内均有表达，提示TGF-β在Heymann肾炎的发生发展过程中可能发挥着重要的介导作用。
参考文献
[1] Edgington TS， et al. J Exp Med 1968；127：555.
[2] Penny MJ，et al.Kidney Int 1997；51：1059.
[3] Shankland SJ，et al.Kidney Int 1996；50：116.
[4] Sharma K， et al.Am J Physiol 1994；266：F829.
[5] Munger JS，et al.Kidney Int 1997；51：1376.
, 百拇医药
[6] Border WA，et al.Kidney Int 1997；51：1388.
[7] Yamamoto T，et al.Kidney Int 1994；45：916.
[8] Shankland SJ，et al.Kidney Int 1994；46：430.
[9] Nakamura T，et al.Kidney Int 1992；41：1213.
[10] Yoshioka K， et al.Lab Invest 1993；68：158.
[11] Honkanen E， et al.Nephrol Dial Transpl 1997；12： 2562.
(1998年11月11日收稿 1999年1月12日修回), 百拇医药
单位：王照明 张建民 南京铁道医学院附属医院病理科 邮政编码：210009；张东生 南京铁道医学院附属医院电镜室
关键词：肾小球肾炎 免疫组化 转化生长因子
江苏医药991005 摘要 为探讨转化生长因子β(TGF-β)及三种异构体在不同病变阶段主动型Heymann肾炎(AHN)肾小球中的表达情况，建立AHN模型后，用免疫组化SP法检测了TGF-β三种异构体在不同病变阶段AHN大鼠肾小球内的表达情况。发现自AHN诱发后第4周开始，TGF-β三种异构体即有表达，至第六、第八周随AHN大鼠尿蛋白的增加，TGF-β三种异构体表达亦上调。TGF-β可能介导了AHN病变的发生及发展。
膜性肾病是成人肾病综合征的主要病理类型，大鼠的Heymann肾炎病变与人类的膜性肾病极为相似，是研究人类膜性肾病理想的动物模型。TGF-β是具有多种生物学功能的多肽类生长因子，它在肾小球肾炎及肾小球纤维化发生发展中的介导作用近年来引起了肾病研究者的关注。我们运用免疫组化SP法检测了TGF-β不同的异构体蛋白在不同病变阶段AHN大鼠肾小球中的表达情况。
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材料与方法
一、主动型Heymann肾炎(AHN)模型的建立
抗原物质FxIA的提取参照Edgington[1]的方法。AHN模型诱发参照Penny[2]等的方法，雄性SD大鼠36只(由南京铁道医学院动物中心提供)，重150～180g，随机分为实验组24只，对照组12只。实验组每只大鼠首次经后足垫注射经弗氏完全佐剂充分乳化的FxIA15mg，2周后以原抗原剂量一半经背部皮下加强免疫一次。对照组每次注射相同剂量不含FxIA的乳化的弗氏佐剂。在首次免疫后的第4、6、8、12周将大鼠置代谢笼内留24小时尿，用双缩脲法测尿蛋白总量，每次处死实验组大鼠6只，对照组大鼠3只，取肾脏分别作光镜、免疫荧光、免疫组化及电镜检查。
二、免疫荧光及免疫组化染色法
1.免疫荧光染色法：OCT包埋的大鼠肾皮质，在冰冻切片机上切厚4μm切片，分别滴加1∶8稀释的荧光标记羊抗大鼠IgG及羊抗大鼠C3(Cappel laboratory USA)，37℃孵育30分钟。
, http://www.100md.com
2.免疫组化染色法：10%福尔马林固定的肾组织，常规石蜡包埋，切厚5μm切片，用免疫组化SP法检测TGF-β1、β2、β3蛋白表达(购自福州迈新公司)，染色强度的判断参照Shank-Land[3]等标准：(-)：背景染色，(+)：轻度或散在点状染色，(
)：中度或节段性染色，()：重度或弥漫性染色。三、电镜检查
4%戊二醛固定的1mm3大小的肾皮质，经1%锇酸后固定，丙酮逐级脱水，Epon812包埋，超薄切片，醋酸钠及枸橼酸铅染色，透射电镜观察。
, http://www.100md.com
结 果
一、对照组及AHN大鼠24小时尿蛋白的改变见表1。
表1 两组大鼠24小时尿蛋白总量变化(mg/24h，
±s)实验组
对照组
P
实验前
1.28±0.65
1.35±0.46
, 百拇医药 >0.05
4周
8.68±6.99
2.46±1.16
<0.01
6周
19.03±8.05
1.51±0.68
<0.01
8周
22.84±11.82
4.24±1.29
, 百拇医药
<0.01
12周
11.53±2.61
3.01±1.52
<0.01
二、光镜检查：第4、6周实验组大鼠肾组织未见明显改变。第8周末实验组大鼠肾小球毛细血管壁有轻度弥漫性增厚。
三、免疫荧光检查：第4周末即可见IgG及C3呈颗粒状免疫荧光沿肾小球毛细血管壁分布。以第8周末羊抗大鼠IgG染色最强(
～)。, 百拇医药
四、电镜检查：第4周末在肾小球脏层上皮细胞下、基底膜表面出现散在小丘状电子致密沉积物，至第8周末见沉积物较第4周增多、增大。
五、免疫组化染色：对照组大鼠肾小球内TGF-β三种异构体表达呈(-)或仅见散在点状染色，实验组病变不同阶段肾小球内TGF-β表达情况见表2。表2 TGF-β三种异构体蛋白在不同病变阶段AHN肾小球内的表达(每组n＝6) 抗体
表达强度
4周
6周
8周
12周
TGF-β1
-
, 百拇医药
1
1
0
1
+
3
1
2
4
2
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, 百拇医药 3
1
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TGF-β2
-
1
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, 百拇医药
1
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2
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0
TGF-β3
-
1
1
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, 百拇医药
2
0
2
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讨 论
TGF-β是一种分子量为25KD的同源二聚体蛋白，它有五种异构体，在哺乳动物中有TGF-β1、β2及β3三种异构体，这三种异构体生物学功能相似[4]。TGF-β具有多种生物学功能，参与了体内诸如组织发育、增生、血管形成、炎症、凋亡等多种生物学过程的调节[5]。在肾小球内TGF-β主要来源于上皮细胞、内皮细胞、系膜细胞及浸润的单核细胞。在肾脏内它主要发挥调节细胞外基质(ECM)形成，故对肾小球硬化的发生发展起着重要的促进作用[6]。
Yamamoto及Shankland等分别在ATS诱发的系膜增生性肾小球肾炎及糖尿病肾病动物模型中发现TGF-β蛋白、TGF-β mRNA表达明显上调，且以TGF-β1表达为主。这些病变主要涉及肾小球系膜细胞增生并生成大量ECM[7，8]。膜性肾病的病理特征表现为肾小球毛细血管上皮下免疫复合物形成，肾小球毛细血管基底膜增厚伴“钉突”形成，系膜细胞不增生。Shankland[3]在用抗FxIA血清诱发的被动型Heymann肾炎模型中检测了TGF-β三种异构体的表达情况，发现与对照组相比TGF-β3在病变诱发后的第10天表达上调，TGF-β2在不同的病变阶段表达均上调而TGF-β1表达未见明显改变。故他们认为：在以系膜细胞增生为主的肾小球疾病中，TGF-β1可能起主要的介导作用，而在以上皮细胞受损为主的肾小球疾病如膜性肾病中，TGF-β2、β3可能起主要的介导作用。本研究以FxIA作抗原诱发AHN为模型，免疫荧光及电镜检查证明AHN模型诱发是成功的，我们观察到从第4周开始，AHN大鼠肾小球内TGF-β三种异构体即有表达，开始时以(+)者居多，随着AHN大鼠24小时尿蛋白的增加，TGF-β表达也上调，至第6、第8周以(+)及(
)者居多，第8周有1例TGF-β1及TGF-β2染色呈强阳性。Nakamura[9]在体外培养的肾小球上皮细胞中加入TGF-β1后发现培养的上皮细胞合成纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原明显增多，层粘连蛋白轻度增加，证明TGF-β有刺激肾小球上皮细胞合成过量ECM的能力。Yoshioka[10]等检测了TGF-β在各型人类肾小球肾炎中的表达，2例膜性肾病患者肾小球内TGF-β1均呈()。Honkanen[11]等检测了41例膜性肾病患者尿中TGF-β1含量，膜性肾病患者尿内TGF-β1明显高于健康对照组，且尿内TGF-β1含量与尿内白蛋白含量相关。综合以上人类膜性肾病患者TGF-β1检测结果及本研究对AHN不同病变阶段TGF-β三种异构体的检测结果，笔者不支持Shankland提出的在以上皮细胞受损为主的肾小球肾炎中TGF-β1不起主要作用而以TGF-β2、β3可能起主要介导作用的观点。, http://www.100md.com
本研究结果显示，TGF-β三种异构体蛋白在AHN不同病变阶段肾小球内均有表达，提示TGF-β在Heymann肾炎的发生发展过程中可能发挥着重要的介导作用。
参考文献
[1] Edgington TS， et al. J Exp Med 1968；127：555.
[2] Penny MJ，et al.Kidney Int 1997；51：1059.
[3] Shankland SJ，et al.Kidney Int 1996；50：116.
[4] Sharma K， et al.Am J Physiol 1994；266：F829.
[5] Munger JS，et al.Kidney Int 1997；51：1376.
, 百拇医药
[6] Border WA，et al.Kidney Int 1997；51：1388.
[7] Yamamoto T，et al.Kidney Int 1994；45：916.
[8] Shankland SJ，et al.Kidney Int 1994；46：430.
[9] Nakamura T，et al.Kidney Int 1992；41：1213.
[10] Yoshioka K， et al.Lab Invest 1993；68：158.
[11] Honkanen E， et al.Nephrol Dial Transpl 1997；12： 2562.
(1998年11月11日收稿 1999年1月12日修回), 百拇医药