以Ⅰ型胶原为基底的表皮细胞培养法
作者：梁佩红 李 芳 马福广 沈 雁 钟灿灿 刘锡麟
单位：广州市红十字会医院 广州市创伤外科研究所(510220)
关键词：表皮；胶原；细胞，培养的；烧伤
实用医学杂志991014 摘 要 目的：介绍以Ⅰ型胶原为基底的表皮细胞培养法的优点。方法：从鼠尾中提取Ⅰ型胶原蛋白，制备胶原膜作培养皿基底，进行表皮细胞培养，并比较4种不同基底的培养方法。结果：以胶原膜作基底培养的表皮细胞无论是单细胞或组织块都生长最好，在第14天均能开始汇合成片，且无毒副作用。结论：该培养法改进了过去培养表皮细胞膜片过薄、韧性欠佳、刮取皮片时造成皮片回缩等缺点，方便了创面移植，且胶原膜本身也能促进创面愈合，可大量地应用于烧伤创面覆盖。
表皮细胞培养的技术及应用已有较多文献报道，但采用Ⅰ型胶原膜作基底，进行表皮细胞的培养，国内报道较少。现将这种方法与其他方法作比较，探讨其优点。
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1 材料与方法
1.1 材料 胶原膜来源及制备方法：无菌下分离SD大白鼠尾肌腱，采用酸溶法提取鼠尾肌腱可溶胶原，方法见马福广介绍的提取法[1]。提取液透析纯化成外观清晰、pH中性的透明胶态液体，然后盐析成膜，37℃干燥脱盐，保鲜袋包装，环氧乙烷灭菌后备用。使用时在无菌操作下将胶原膜平铺于玻璃培养皿底，将单个细胞或组织块接种于其上，慢慢注入细胞培养液，按常规方法换液及观察细胞生长情况。
1.2 表皮细胞培养
1.2.1 单细胞悬液培养法 将无菌手术切取的包皮，用含100 mg/L青霉素和150 mg/L链霉素PBS液洗3次，然后去除皮下脂肪，剪成约3 mm×1.5 mm的皮块，于0.125%胰酶中，4℃消化16～18小时后，将表皮分离，悬于培养液中(含DMEM培养基、F12培养基、10%～20%小牛血清、胰岛素、氢化可的松、三碘甲状腺原氨酸、霍乱毒素、丝裂霉素、表皮生长因子)，轻轻吹打，尽量分离成单细胞，过滤、离心收集，调整细胞浓度为109/L，用点滴法[2]分别接种。24小时后换液，并加入10μg/L的表皮因子，以后隔天换液。
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1.2.2 组织块培养法 将无菌手术切取的包皮，用含100mg/L青霉素和150mg/L链霉素PBS液洗3次，然后去除皮下脂肪，剪成皮浆，均匀地贴于各种平皿内，待干燥30分钟后，加入培养液，24小时后换液，加生长因子，隔天换液。
1.3 4种不同基底培养方法的操作步骤 按上述的方法将准备好的表皮细胞和组织块分别接种于用胶原膜作基底的玻璃平皿，直接用裸壁为基底的塑料平皿，直接用裸壁为基底的玻璃平皿，用3T3细胞饲养层作基底的玻璃平皿。并在每次换液前用倒置显微镜观察细胞贴壁、集落形成及成膜的情况，用显微镜标尺测量集落成膜片的面积。
2 结果
2.1 4种方法比较观察
2.1.1 胶原膜作基底的表皮组织块在接种后4天开始生长，单细胞在1周后开始生长，11～14天生长良好。
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2.1.2 玻璃平皿裸壁作基底的表皮细胞，无论是单细胞或组织块都不生长。
2.1.3 塑料平皿裸壁作基底的表皮组织块，4天后开始生长，11～14天生长良好。但单细胞不生长。
2.1.4 3T3细胞饲养层作基底培养的表皮单细胞在接种后4天开始生长，11～14天生长良好，但组织块不长。
2.2 四种培养方法比较，其结果见表1 从表1可见，以胶原膜作基底培养的表皮细胞无论是单细胞或组织块都生长最好。
表1 表皮细胞在不同基底上的生长株数和生长情况 4种不同
基底
n
4天
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7天
14天
单细胞
组织块
单细胞
组织块
单细胞
组织块
+
++
+++
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胶原膜平皿
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3
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玻璃平皿
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塑料平皿
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3T3饲养层平皿
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2
18
0
0
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注：+生长开始，++生长良好，+++汇合成片 3 讨论
表皮细胞必须粘附于培养皿的基底才能存活和分裂。文献指出：胶原蛋白对表皮细胞更具有粘附能力，维持细胞的活力状态时间也较长，并能保持和诱导细胞的分化。
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从本实验看到：表皮细胞在裸壁塑料平皿上不能贴壁生长，且价格昂贵，清洗消毒也较麻烦。在裸壁玻璃平皿上的生长状态极差。而在胶原膜底上，无论是表皮单细胞或组织块，都能生长良好。虽然3T3细胞是表皮细胞生长、繁殖较好的饲养层，是经典的培养方法，但其培养及处理过程繁琐，且毒副作用现在尚不完全清楚。所以，以胶原膜为基底的表皮细胞培养方法较为实际、简易。
用胶原膜作基底培养表皮细胞国内报道较少。本所建立的胶原提取方法简易，可大批量生产，用盐析法制备的胶原膜保持了胶原蛋白纤维的完整性，同时由于胶原膜为半透明膜，不影响倒置显微镜观察细胞生长情况，且胶原膜有一定厚度、拉力和韧度，能使培养的表皮可连同胶原膜直接覆盖于烧伤创面上，对创面感染及修复能力也起到很好的作用[2]。
胶原膜作基底的培养方法省去了传统培养方法需从培养皿分离表皮细胞的操作，改进了单纯用表皮细胞片过薄、韧性欠佳、刮取皮片时成片回缩的缺点，而且繁殖的细胞片存活率高[3]。
, 百拇医药
从我所以往实验分析可知，胶原膜是一种生物制品，为含18种氨基酸的Ⅰ型胶原。动物实验证明无毒副作用，它能直接向组织提供Ⅰ型胶原蛋白，更好地促进伤口的愈合[1]。因此，我们认为用胶原膜作基底培养表皮细胞的方法简易可行，价格便宜，有一定的发展前景。
4 参考文献
1 马福广，李 芳，彭燕豪，等.医用胶原膜研制及临床应用.中华创伤杂志，1995，11(3)：149～150.
2 马福广.医用胶原膜对烧伤创面的疗效观察.实用医学杂志，1994，10(4)：372.
3 李考建.胶原在烧伤创面的应用.国外医学创伤与外科基本问题分册，1995，16(1)：28～29., 百拇医药
单位：广州市红十字会医院 广州市创伤外科研究所(510220)
关键词：表皮；胶原；细胞，培养的；烧伤
实用医学杂志991014 摘 要 目的：介绍以Ⅰ型胶原为基底的表皮细胞培养法的优点。方法：从鼠尾中提取Ⅰ型胶原蛋白，制备胶原膜作培养皿基底，进行表皮细胞培养，并比较4种不同基底的培养方法。结果：以胶原膜作基底培养的表皮细胞无论是单细胞或组织块都生长最好，在第14天均能开始汇合成片，且无毒副作用。结论：该培养法改进了过去培养表皮细胞膜片过薄、韧性欠佳、刮取皮片时造成皮片回缩等缺点，方便了创面移植，且胶原膜本身也能促进创面愈合，可大量地应用于烧伤创面覆盖。
表皮细胞培养的技术及应用已有较多文献报道，但采用Ⅰ型胶原膜作基底，进行表皮细胞的培养，国内报道较少。现将这种方法与其他方法作比较，探讨其优点。
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1 材料与方法
1.1 材料 胶原膜来源及制备方法：无菌下分离SD大白鼠尾肌腱，采用酸溶法提取鼠尾肌腱可溶胶原，方法见马福广介绍的提取法[1]。提取液透析纯化成外观清晰、pH中性的透明胶态液体，然后盐析成膜，37℃干燥脱盐，保鲜袋包装，环氧乙烷灭菌后备用。使用时在无菌操作下将胶原膜平铺于玻璃培养皿底，将单个细胞或组织块接种于其上，慢慢注入细胞培养液，按常规方法换液及观察细胞生长情况。
1.2 表皮细胞培养
1.2.1 单细胞悬液培养法 将无菌手术切取的包皮，用含100 mg/L青霉素和150 mg/L链霉素PBS液洗3次，然后去除皮下脂肪，剪成约3 mm×1.5 mm的皮块，于0.125%胰酶中，4℃消化16～18小时后，将表皮分离，悬于培养液中(含DMEM培养基、F12培养基、10%～20%小牛血清、胰岛素、氢化可的松、三碘甲状腺原氨酸、霍乱毒素、丝裂霉素、表皮生长因子)，轻轻吹打，尽量分离成单细胞，过滤、离心收集，调整细胞浓度为109/L，用点滴法[2]分别接种。24小时后换液，并加入10μg/L的表皮因子，以后隔天换液。
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1.2.2 组织块培养法 将无菌手术切取的包皮，用含100mg/L青霉素和150mg/L链霉素PBS液洗3次，然后去除皮下脂肪，剪成皮浆，均匀地贴于各种平皿内，待干燥30分钟后，加入培养液，24小时后换液，加生长因子，隔天换液。
1.3 4种不同基底培养方法的操作步骤 按上述的方法将准备好的表皮细胞和组织块分别接种于用胶原膜作基底的玻璃平皿，直接用裸壁为基底的塑料平皿，直接用裸壁为基底的玻璃平皿，用3T3细胞饲养层作基底的玻璃平皿。并在每次换液前用倒置显微镜观察细胞贴壁、集落形成及成膜的情况，用显微镜标尺测量集落成膜片的面积。
2 结果
2.1 4种方法比较观察
2.1.1 胶原膜作基底的表皮组织块在接种后4天开始生长，单细胞在1周后开始生长，11～14天生长良好。
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2.1.2 玻璃平皿裸壁作基底的表皮细胞，无论是单细胞或组织块都不生长。
2.1.3 塑料平皿裸壁作基底的表皮组织块，4天后开始生长，11～14天生长良好。但单细胞不生长。
2.1.4 3T3细胞饲养层作基底培养的表皮单细胞在接种后4天开始生长，11～14天生长良好，但组织块不长。
2.2 四种培养方法比较，其结果见表1 从表1可见，以胶原膜作基底培养的表皮细胞无论是单细胞或组织块都生长最好。
表1 表皮细胞在不同基底上的生长株数和生长情况 4种不同
基底
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单细胞
组织块
单细胞
组织块
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组织块
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胶原膜平皿
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玻璃平皿
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注：+生长开始，++生长良好，+++汇合成片 3 讨论
表皮细胞必须粘附于培养皿的基底才能存活和分裂。文献指出：胶原蛋白对表皮细胞更具有粘附能力，维持细胞的活力状态时间也较长，并能保持和诱导细胞的分化。
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从本实验看到：表皮细胞在裸壁塑料平皿上不能贴壁生长，且价格昂贵，清洗消毒也较麻烦。在裸壁玻璃平皿上的生长状态极差。而在胶原膜底上，无论是表皮单细胞或组织块，都能生长良好。虽然3T3细胞是表皮细胞生长、繁殖较好的饲养层，是经典的培养方法，但其培养及处理过程繁琐，且毒副作用现在尚不完全清楚。所以，以胶原膜为基底的表皮细胞培养方法较为实际、简易。
用胶原膜作基底培养表皮细胞国内报道较少。本所建立的胶原提取方法简易，可大批量生产，用盐析法制备的胶原膜保持了胶原蛋白纤维的完整性，同时由于胶原膜为半透明膜，不影响倒置显微镜观察细胞生长情况，且胶原膜有一定厚度、拉力和韧度，能使培养的表皮可连同胶原膜直接覆盖于烧伤创面上，对创面感染及修复能力也起到很好的作用[2]。
胶原膜作基底的培养方法省去了传统培养方法需从培养皿分离表皮细胞的操作，改进了单纯用表皮细胞片过薄、韧性欠佳、刮取皮片时成片回缩的缺点，而且繁殖的细胞片存活率高[3]。
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从我所以往实验分析可知，胶原膜是一种生物制品，为含18种氨基酸的Ⅰ型胶原。动物实验证明无毒副作用，它能直接向组织提供Ⅰ型胶原蛋白，更好地促进伤口的愈合[1]。因此，我们认为用胶原膜作基底培养表皮细胞的方法简易可行，价格便宜，有一定的发展前景。
4 参考文献
1 马福广，李 芳，彭燕豪，等.医用胶原膜研制及临床应用.中华创伤杂志，1995，11(3)：149～150.
2 马福广.医用胶原膜对烧伤创面的疗效观察.实用医学杂志，1994，10(4)：372.
3 李考建.胶原在烧伤创面的应用.国外医学创伤与外科基本问题分册，1995，16(1)：28～29., 百拇医药