依布硒及其类似物对大鼠血小板花生四烯酸代谢的影响
作者：张晓冬 姜远英 曾华武 殷 明
单位：第二军医大学药学院药理学教研室，上海，200433；曾华武：海军第411医院药物研究中心
关键词：依布硒；花生四烯酸；血小板
第二军医大学学报991046 花生四烯酸(AA)是一组含有4个烯键的二十碳不饱和脂肪酸的总称，它的代谢产物中有很多成分具有强烈的生物学活性。其中，TXA2是目前发现的最强的缩血管物质和最强的血小板聚集剂之一。LTB4是一种重要的炎症介质，在10-10～10-9 mol/L浓度就有明显的药理作用。在沙土鼠与大鼠缺血后再灌注的实验已观察到脑实质中的LTD4含量增多，同时脂氧酶的另一代谢产物12-羟基-(5,8,10,14)-二十碳四烯酸(12-HETE)的含量也有增加。用基因打靶方法敲除12-脂氧酶基因小鼠的血小板对ADP的敏感性增强[1,2]。
, http://www.100md.com
依布硒(ebselen)是一种低毒的人工合成的含硒有机物,具有谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)样活性,能还原脂质过氧化物[3],也能抑制脂氧酶[4]并影响花生四烯酸代谢。α-甲基-4-(3-氧-2H-1,3-苯并异硒唑-2-基)苯乙酸(MBBA)为根据构效关系合成的依布硒的类似物。为了进一步探讨MBBA和依布硒的药理作用,本实验采用放射性薄层层析法观察了MBBA和依布硒对大鼠血小板AA代谢产物生成的影响。
1 材料和方法
1.1 动物和材料 Wistar大鼠,雄性,体质量(250±20)g。TXB2,LTD4,12-HETE分别由Pike(Upjohn药厂,USA)和Rokach博士(Merck Frosst公司,Canada)惠赠,14C-AA为Amersham公司产品, 硅胶G为青岛海洋化工厂产品, 依布硒,MBBA由本院陈卫平副教授惠赠,其余试剂为国产分析纯。800型离心机(上海手术器械厂)，液体闪烁计数仪FJ-2107，SH2-82水浴恒温振荡器(江苏医疗器械厂)，XW80型旋涡混合器，高速离心机(德国 Heraeus)。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 大鼠洗涤血小板的制备 大鼠用戊巴比妥钠30 mg/kg ip麻醉，颈动脉放血，全血用ACD溶液(柠檬酸 65 mmol/L，柠檬酸三钠85 mmol/L,葡萄糖 110 mmol/L)按6∶1 (v∶v)的比例混匀抗凝,室温下离心制备富含血小板血浆(PRP),并参照Ardlie等的方法洗涤血小板。最后用含有1 mmol/L CaCl2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液(NaCl 145,KCl 5,MgSO4 1,HEPES 10,葡萄糖10 mmol/L，pH 7.4)制成血小板悬液,并根据实验要求调整血小板计数为1.71×109/ml。
1.2.2 大鼠血小板中AA代谢产物的提取 取上述大鼠血小板悬液0.5 ml，加入药物或相应溶剂对照液，37℃振荡温育20 min,再加入14C-AA 5.55 kBq继续温育5 min，随后加入10%甲酸，pH 3.5，置冰浴中终止反应。用4倍体积的乙酸乙酯提取2次，收集2次提取的有机相，用N2吹干，残留物-30℃保存，备做薄层层析。
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1.2.3 AA代谢产物的TLC分离及测定 向上述血小板提取的残留物中加入AA,TXB2,LTD4,LTB4,12-HETE各5 μg,并用甲醇充分溶解后行TLC。层析条件:硅胶G板20 cm×6 cm,展开剂中氯仿∶甲醇∶乙酸∶水的体积比为90∶8∶1∶0.8,展开距离16 cm,用10%磷钼酸显色,按文献[5]方法确定TXB2,LTD4,LTB4,12-HETE和残留AA在板上的位置。将各显色斑点收集后,在液体闪烁计数仪上测定每5×108血小板中放射性活度。
1.3 统计学处理 实验数据用
表示，显著性测定采用t检验。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 药物对大鼠血小板环氧酶代谢产物的影响 TXB2的含量以每5×108血小板计算，对照组为(0.67±0.02) μBq；依布硒、MBBA在2，10 μmol/L浓度下使TXB2含量增加，分别为[(0.95±0.03) μBq, P<0.05]，(0.88±0.03) μBq; (0.75±0.04) μBq, [(1.20±0.03) μBq, P<0.01]。当浓度增加到50 μmol/L时，TXB2的含量却减少为[0.38±0.03) μBq, P<0.05]，[(0.23±0.02) μBq, P<0.01]。 阿司匹林 50 μmol/L也使TXB2的含量明显减少[(0.36±0.05) μBq, P<0.05]。
2.2 药物对大鼠血小板脂氧酶代谢产物的影响 MBBA,依布硒均使LTB4,LTD4,12-HETE的含量剂量依赖性减少, 阿司匹林使其中LTB4,LTD4,12-HETE的含量增加(表1)。
, 百拇医药
表1 依布硒和MBBA对血小板脂氧酶代谢产物的影响 (n=5,, A/Bq×10-5) 组别
(cB/μmol.L-1)
LTB4
LTD4
12-HETE
对照
19.8±0.9
12.9±0.5
, 百拇医药
36.6±4.2
阿司匹林
50
32.7±1.6**
25.6±1.0**
42.5±4.9**
依布硒
2
19.0±0.3
12.2±0.8
24.0±2.3**
, 百拇医药
10
15.8±1.0**
7.1±0.6**
15.1±1.7**
50
8.5±0.8**
4.5±0.8**
7.8±2.4**
MBBA
2
18.6±1.0*
, 百拇医药
11.1±1.0**
29.4±3.1**
10
12.2±1.2**
7.1±1.0**
16.2±4.4**
50
8.2±0.3**
4.7±0.5**
9.6±1.2**
, 百拇医药
*P<0.05,**P<0.01和对照组比较
3 讨 论
AA一般以磷脂的形式存在于细胞膜中，多种刺激因子、激素、血氧张力过低或组织损伤都可激活磷脂酶A2，使AA从膜磷脂中游离出来，经环氧酶或脂氧酶途径进一步代谢。各种细胞的不同脂氧化酶途径可形成一系列不同的有生物活性的代谢产物。此外细胞之间的AA代谢物在功能与作用方面也相互影响，共同参与了机体各种生理与病理过程。脂氧酶在氧化修饰低密度脂蛋白中起到了重要的作用，低密度脂蛋白的氧化过程中，不仅需要单核细胞和超氧化离子的作用，还需脂氧酶的参与[6]。环氧酶与5-脂氧酶抑制剂能够增强阿片类物质对GABA介导的突触传递的抑制作用[7]。本实验结果表明:MBBA,依布硒在较低的浓度下,对脂氧酶有较强的抑制作用。当浓度达到50 μmol/L 时，对环氧酶也有抑制作用。这对预防和治疗动脉粥样硬化可能有积极的意义。其中，在低浓度下环氧酶产物含量的增加，是否是因为抑制脂氧酶通路而使环氧酶通路代谢增强，还有待进一步研究。
, 百拇医药
中图分类号 R 558.9 文献标识码：B
文章编号：0258-879X(1999)10-0818-02
参考文献
1 Johnson EN, Brass LF, Funk CD. Increased platelet sensitivity to ADP in mice lacking platelet-type 12-lipoxygenase[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(6):3100
2 王 尧，杜子威 主编. 神经生物化学与分子生物学[M]. 北京：人民卫生出版社，1997,231～235
3 Wendel A, Fausel M, Safayhi H,et al. A novel biologically active seleno-organic compound-II: activity of PZ 51 in relation to glutathione peroxidase[J]. Biochem Pharmacol,1984, 33(20):3241
, 百拇医药
4 Schewe C, Schewe T, Wendel A. Strong inhibition of mammalian lipoxygenases by the antiinflammatory seleno-organic compound ebselen in the absence of glutathione[J]. Biochem Pharmacol, 1994,48(1): 65
5 岳天立，佟 丽，陈新生，等.薄层层析法分离前列腺素及白三烯[J]. 第二军医大学学报，1988,9(4):365
6 McNally AK, Chisolm GM3 d, Morel DW, et al. Activated human monocytes oxidize low-density lipoprotein by a lipoxygenase-dependent pathway[J]. J Immunol，1990,145(1):254
7 Vaughan CW, Ingram SL, Connor MA, et al. How opinoids inhibit GABA-mediated neurotransmission[J]. Nature,1997,390(6660):611
(1999-03-12收稿，1999-08-31修回), 百拇医药
单位：第二军医大学药学院药理学教研室，上海，200433；曾华武：海军第411医院药物研究中心
关键词：依布硒；花生四烯酸；血小板
第二军医大学学报991046 花生四烯酸(AA)是一组含有4个烯键的二十碳不饱和脂肪酸的总称，它的代谢产物中有很多成分具有强烈的生物学活性。其中，TXA2是目前发现的最强的缩血管物质和最强的血小板聚集剂之一。LTB4是一种重要的炎症介质，在10-10～10-9 mol/L浓度就有明显的药理作用。在沙土鼠与大鼠缺血后再灌注的实验已观察到脑实质中的LTD4含量增多，同时脂氧酶的另一代谢产物12-羟基-(5,8,10,14)-二十碳四烯酸(12-HETE)的含量也有增加。用基因打靶方法敲除12-脂氧酶基因小鼠的血小板对ADP的敏感性增强[1,2]。
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依布硒(ebselen)是一种低毒的人工合成的含硒有机物,具有谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)样活性,能还原脂质过氧化物[3],也能抑制脂氧酶[4]并影响花生四烯酸代谢。α-甲基-4-(3-氧-2H-1,3-苯并异硒唑-2-基)苯乙酸(MBBA)为根据构效关系合成的依布硒的类似物。为了进一步探讨MBBA和依布硒的药理作用,本实验采用放射性薄层层析法观察了MBBA和依布硒对大鼠血小板AA代谢产物生成的影响。
1 材料和方法
1.1 动物和材料 Wistar大鼠,雄性,体质量(250±20)g。TXB2,LTD4,12-HETE分别由Pike(Upjohn药厂,USA)和Rokach博士(Merck Frosst公司,Canada)惠赠,14C-AA为Amersham公司产品, 硅胶G为青岛海洋化工厂产品, 依布硒,MBBA由本院陈卫平副教授惠赠,其余试剂为国产分析纯。800型离心机(上海手术器械厂)，液体闪烁计数仪FJ-2107，SH2-82水浴恒温振荡器(江苏医疗器械厂)，XW80型旋涡混合器，高速离心机(德国 Heraeus)。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 大鼠洗涤血小板的制备 大鼠用戊巴比妥钠30 mg/kg ip麻醉，颈动脉放血，全血用ACD溶液(柠檬酸 65 mmol/L，柠檬酸三钠85 mmol/L,葡萄糖 110 mmol/L)按6∶1 (v∶v)的比例混匀抗凝,室温下离心制备富含血小板血浆(PRP),并参照Ardlie等的方法洗涤血小板。最后用含有1 mmol/L CaCl2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液(NaCl 145,KCl 5,MgSO4 1,HEPES 10,葡萄糖10 mmol/L，pH 7.4)制成血小板悬液,并根据实验要求调整血小板计数为1.71×109/ml。
1.2.2 大鼠血小板中AA代谢产物的提取 取上述大鼠血小板悬液0.5 ml，加入药物或相应溶剂对照液，37℃振荡温育20 min,再加入14C-AA 5.55 kBq继续温育5 min，随后加入10%甲酸，pH 3.5，置冰浴中终止反应。用4倍体积的乙酸乙酯提取2次，收集2次提取的有机相，用N2吹干，残留物-30℃保存，备做薄层层析。
, http://www.100md.com
1.2.3 AA代谢产物的TLC分离及测定 向上述血小板提取的残留物中加入AA,TXB2,LTD4,LTB4,12-HETE各5 μg,并用甲醇充分溶解后行TLC。层析条件:硅胶G板20 cm×6 cm,展开剂中氯仿∶甲醇∶乙酸∶水的体积比为90∶8∶1∶0.8,展开距离16 cm,用10%磷钼酸显色,按文献[5]方法确定TXB2,LTD4,LTB4,12-HETE和残留AA在板上的位置。将各显色斑点收集后,在液体闪烁计数仪上测定每5×108血小板中放射性活度。
1.3 统计学处理 实验数据用
表示，显著性测定采用t检验。2 结 果
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2.1 药物对大鼠血小板环氧酶代谢产物的影响 TXB2的含量以每5×108血小板计算，对照组为(0.67±0.02) μBq；依布硒、MBBA在2，10 μmol/L浓度下使TXB2含量增加，分别为[(0.95±0.03) μBq, P<0.05]，(0.88±0.03) μBq; (0.75±0.04) μBq, [(1.20±0.03) μBq, P<0.01]。当浓度增加到50 μmol/L时，TXB2的含量却减少为[0.38±0.03) μBq, P<0.05]，[(0.23±0.02) μBq, P<0.01]。 阿司匹林 50 μmol/L也使TXB2的含量明显减少[(0.36±0.05) μBq, P<0.05]。
2.2 药物对大鼠血小板脂氧酶代谢产物的影响 MBBA,依布硒均使LTB4,LTD4,12-HETE的含量剂量依赖性减少, 阿司匹林使其中LTB4,LTD4,12-HETE的含量增加(表1)。
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表1 依布硒和MBBA对血小板脂氧酶代谢产物的影响 (n=5,
, A/Bq×10-5) 组别(cB/μmol.L-1)
LTB4
LTD4
12-HETE
对照
19.8±0.9
12.9±0.5
, 百拇医药
36.6±4.2
阿司匹林
50
32.7±1.6**
25.6±1.0**
42.5±4.9**
依布硒
2
19.0±0.3
12.2±0.8
24.0±2.3**
, 百拇医药
10
15.8±1.0**
7.1±0.6**
15.1±1.7**
50
8.5±0.8**
4.5±0.8**
7.8±2.4**
MBBA
2
18.6±1.0*
, 百拇医药
11.1±1.0**
29.4±3.1**
10
12.2±1.2**
7.1±1.0**
16.2±4.4**
50
8.2±0.3**
4.7±0.5**
9.6±1.2**
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*P<0.05,**P<0.01和对照组比较
3 讨 论
AA一般以磷脂的形式存在于细胞膜中，多种刺激因子、激素、血氧张力过低或组织损伤都可激活磷脂酶A2，使AA从膜磷脂中游离出来，经环氧酶或脂氧酶途径进一步代谢。各种细胞的不同脂氧化酶途径可形成一系列不同的有生物活性的代谢产物。此外细胞之间的AA代谢物在功能与作用方面也相互影响，共同参与了机体各种生理与病理过程。脂氧酶在氧化修饰低密度脂蛋白中起到了重要的作用，低密度脂蛋白的氧化过程中，不仅需要单核细胞和超氧化离子的作用，还需脂氧酶的参与[6]。环氧酶与5-脂氧酶抑制剂能够增强阿片类物质对GABA介导的突触传递的抑制作用[7]。本实验结果表明:MBBA,依布硒在较低的浓度下,对脂氧酶有较强的抑制作用。当浓度达到50 μmol/L 时，对环氧酶也有抑制作用。这对预防和治疗动脉粥样硬化可能有积极的意义。其中，在低浓度下环氧酶产物含量的增加，是否是因为抑制脂氧酶通路而使环氧酶通路代谢增强，还有待进一步研究。
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中图分类号 R 558.9 文献标识码：B
文章编号：0258-879X(1999)10-0818-02
参考文献
1 Johnson EN, Brass LF, Funk CD. Increased platelet sensitivity to ADP in mice lacking platelet-type 12-lipoxygenase[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(6):3100
2 王 尧，杜子威 主编. 神经生物化学与分子生物学[M]. 北京：人民卫生出版社，1997,231～235
3 Wendel A, Fausel M, Safayhi H,et al. A novel biologically active seleno-organic compound-II: activity of PZ 51 in relation to glutathione peroxidase[J]. Biochem Pharmacol,1984, 33(20):3241
, 百拇医药
4 Schewe C, Schewe T, Wendel A. Strong inhibition of mammalian lipoxygenases by the antiinflammatory seleno-organic compound ebselen in the absence of glutathione[J]. Biochem Pharmacol, 1994,48(1): 65
5 岳天立，佟 丽，陈新生，等.薄层层析法分离前列腺素及白三烯[J]. 第二军医大学学报，1988,9(4):365
6 McNally AK, Chisolm GM3 d, Morel DW, et al. Activated human monocytes oxidize low-density lipoprotein by a lipoxygenase-dependent pathway[J]. J Immunol，1990,145(1):254
7 Vaughan CW, Ingram SL, Connor MA, et al. How opinoids inhibit GABA-mediated neurotransmission[J]. Nature,1997,390(6660):611
(1999-03-12收稿，1999-08-31修回), 百拇医药