粟米草毛状根的研究
作者：许铁峰 张汉明 丁如贤 李博华 张巧艳 郑汉臣
单位：第二军医大学药学院生药学教研室，上海，200433
关键词：粟米草；毛状根；发根农杆菌
第二军医大学学报991018 摘要 目的：建立粟米草(Mollugo pentaphylla L.)的毛状根培养系统并研究毛状根的生长特性。方法：分别用发根农杆菌R1601，ATCC 15834和A4感染粟米草无菌苗的子叶，获得毛状根，并筛选优质株系；用高压纸电泳法对毛状根进行甘露碱检测；测定其生长曲线；比较不同基本培养液、不同pH值对毛状根生长的影响。结果：高压纸电泳结果显示，所获毛状根中均含有甘露碱，表明毛状根中确已转入发根农杆菌的T-DNA；1/2 MS0培养液 pH 5.4～5.8最适合粟米草毛状根的生长。结论：快速生长的粟米草毛状根在药用活性成分的生产上将具有较大潜力。
, 百拇医药
中图分类号 R 567.21； R 282.2 文献标识码：A
Study on hairy roots of Mollugo pentaphylla L.
Xu Tiefeng, Zhang Hanming, Ding Ruxian, Li Bohua, Zhang Qiaoyan, Zheng Hanchen
(Department of Pharmacognosy, College of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai,200433)
ABSTRACT Objective: To establish the culture system of hairy roots of Mollugo pentaphylla L.and to study the growth character of hairy roots. Methods: Hairy roots of Mollugo pentaphylla L.were obtained from the colyleden explants infected by Agrobacterium rhizogenes R1601,ATCC15834 and A4.The better lines were selected. Mannopine was examined through paper electrophoresis. The growth curve was obtained and extrinsic factors (different pH and different medium ) affecting the growth of hairy roots were investigated. Results: The results of paper electrophoresis showed that the hairy roots contained mannopine, this evidenced the integration of Ri T-DNA in the transformed plants; 1/2 MS0 liquid medium and pH 5.4～5.8 are suitable for the growth of hairy roots of Mollugo pentaphylla L. Conclusion: The fast-growing hairy roots of Mollugo pentaphylla L. have great potential on the production of active component.
, 百拇医药
KEY WORDS Mollugo pentaphylla L.;hairy roots; Agrobacterium rhizogenes
粟米草(Mollugo pentaphylla L.)为粟米草属(Mollugo L.)一年生草本植物，在我国广东、广西、海南、云南有分布[1]，其有效成分为粟米草皂甙A(mollugogenol-A),具抗真菌作用，最近研究表明它还具有较强的杀精子作用[2]，是一味有开发潜力的避孕药。
毛状根培养是80年代在植物细胞培养技术领域发展起来的一项新技术，毛状根培养系统具有生长迅速、不需要外源生长激素、产生次生代谢产物稳定等优点[3]。由于粟米草野生资源极其有限，因此利用毛状根培养生产药用活性成分将是解决资源短缺问题的一条途径。我们对毛状根的诱导、最佳培养条件的选择进行了研究，建立了粟米草的毛状根培养系统。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 发根农杆菌的保存 将中科院北京遗传所提供的3种发根农杆菌ATCC 15834,R1601,A4接种于YEB固体培养基，于25℃ 培养48 h后，置4℃冰箱保存，每两个月转接1次[4]。临用前于YEB固体培养基、25℃活化3次，然后转至YEB培养液(R1601的培养液中加入200 mg/L卡那霉素)于黑暗、25℃，100 r/min振荡培养，12 h后用于感染外植体。
1.2 植物材料 取粟米草种子用清水洗净，在75%乙醇中浸泡1 min，再用0.1% HgCl2消毒10 min，无菌水冲洗5次，置于MS0培养基上，9 d后萌发。取生长10 d的子叶及下胚轴作为外植体，于MS0培养基上预培养24 d后用于转化。
1.3 外植体的转化 将上述预培养的外植体分别浸于处于对数生长期的农杆菌R1601，ATCC 15834，A4菌液中，共培养20 min，取出，用无菌滤纸吸干多余的菌液，置于MS0培养基上培养24 h后移至含300 mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基上培养，25℃，光照12 h/d，并以未经感染的粟米草子叶和下胚轴为对照。
, 百拇医药
1.4 毛状根的除菌 将感染后外植体上长出的毛状根剪下移到新的含抗生素的培养基上，每周转接1次，转接3次以后，将培养瓶放入39.5℃的恒温箱中除菌，48 h后取出移到不含抗生素的MS0培养基上。
1.5 毛状根优质株系的筛选 将MS0培养基上的毛状根逐一分开，挑取长2 cm左右者移入1/2 MS0培养液中，50 ml三角锥瓶，每瓶一根，35 ml培养液，20 d后观察生长情况，挑取生长迅速的进行继代培养。
1.6 甘露碱的检出 分别取3种农杆菌感染获得的毛状根各100 mg置于1 ml Eppendorf管，加入0.1 mol/L HCl 100 μl ,捣成匀浆，4℃浸提2 h，1.5×104 r/min离心5 min，取上清液10 μl 点样于Whatman 3 MM滤纸上进行高压纸电泳(400 V，30 mA)，电泳缓冲液为HCOOH∶CH3COOH∶H2O(5∶15∶80)。40 min后将滤纸取出晾干，均匀浸入碱性硝酸银溶液(0.625 g AgNO3溶于50 ml丙酮)中染色1 min，晾干后再浸入10 ml 20% NaOH+90 ml 95%乙醇混合液中显影5 min，最后再经5%硫代硫酸钠溶液中退色20 min[5]，晾干后拍照。以试管苗的正常根为阴性对照，甘露碱标准品(1 mg/ml)为阳性对照。
, 百拇医药
1.7 毛状根生长曲线的测定 取生长快速的株系MR4在1/2 MS0培养液中进行测定，每50 ml锥形瓶接种毛状根鲜质量0.43 g(干质量0.047 g)，35 ml培养液，共30瓶。每3 d测1次鲜质量与干质量，每次测3瓶，以平均质量为指标绘制生长曲线。鲜质量系用布氏漏斗抽滤至无水滴下时测得，干质量系60℃ 烘12 h后测得。
1.8 毛状根最佳生长条件的筛选
1.8.1 不同基本培养液对生长的影响 配制MS0, 1/2 MS0, B5，GB5， WS等5种不同的培养液，方法同“生长曲线测定”项，18 d后称质量。
1.8.2 不同pH值对生长的影响 配制pH值分别为5.0，5.4，5.8，6.2，6.6，7.0等6种1/2 MS0培养液，方法同“生长曲线测定”项，18 d后称质量。
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2 结 果
2.1 毛状根的获得 子叶外植体经3种农杆菌感染7 d后陆续有毛状根长出，长出的毛状根具白色根毛，向上、贴壁向上或沿培养基平长，失去向地性(见图1)，而对照子叶出根率较低，并且向下长入培养基中，3种农杆菌中以A4感染效率最高。下胚轴作为外植体无根长出。感染后第14天时出根情况统计见表1。
图1 A4感染10 d后的子叶外植体
Fig 1 Cotyledon explants 10 days after inoculation with A4
表1 3种农杆菌对子叶外植体感染的结果
Tab 1 The results of cotyledon explants infected by
, http://www.100md.com
3 kinds of Agrobacterium rhizogenes
Number of
explants
Number of root-
ed explants
Induction
rate(%)
Control
30
5
16.7
, http://www.100md.com A4
30
14
46.7
R1601
30
7
23.3
ATCC 15834
30
8
26.7
2.2 快速生长的优质株系的筛选 在1/2 MS0培养液中培养20 d后，观察各瓶中毛状根生长情况，选出生长最快的二个株系MR1和MR4，均系子叶经A4感染后长出，以后各项实验均以MR4为材料(图2，3)。
, http://www.100md.com
图2 固体培养基上的毛状根
Fig 2 Hairy roots on MS0 solid medium
图3 液体培养基上的毛状根
Fig 3 Hairy roots on 1/2 MS0 liquid medium
2.3 甘露碱的检出 高压纸电泳法检测结果显示，在3种农杆菌感染后获得的粟米草毛状根中均含有甘露碱，表明毛状根确已转入农杆菌的T-DNA。正常根无甘露碱斑点(图4)。
图4 纸电泳图谱
, 百拇医药
Fig 4 Paper electrophoresis
1: Negative control; 2,3: Hairy roots; 4: Standard of oppine
2.4 生长速率测定 实验结果见表2，从表中可以看出，毛状根生长量随时间而快速增加，约18 d时质量达最大(增长倍数以干质量求得)，以后毛状根生长量随时间而下降。
表2 毛状根生长速率测定
Tab 2 The growth rate of the hairy roots (
) Time
(t/d)
Fresh mass
, 百拇医药
(m/g)
Dry mass
(m/g)
Increased
multiples
0
0.28±0.03
0.024±0.004
3
0.33±0.02
0.032±0.004
1.33
, http://www.100md.com
6
0.54±0.02
0.049±0.003
2.04
9
1.03±0.13
0.099±0.008
4.13
12
1.79±0.19
0.176±0.010
7.33
, 百拇医药
15
3.45±0.22
0.333±0.018
13.88
18
5.90±0.20
0.588±0.018
24.50
21
5.87±0.13
0.583±0.022
24.29
, 百拇医药
24
5.83±0.18
0.571±0.040
23.79
27
5.29±0.22
0.530±0.039
22.08
2.5 毛状根最佳生长条件的筛选
2.5.1 不同培养液对毛状根生长的影响 结果见表3，可见1/2 MS0培养液最佳。
表3 不同培养液对毛状根生长的影响
, http://www.100md.com
Tab 3 The effect of different liquid medium on growth of hairy roots ()
MS0
1/2 MS0
B5
GB5
WS0
Fresh mass(m/g)
6.73±0.18
, 百拇医药 7.52±0.24
5.48±0.31
4.07±0.10
0.88±0.06
Dry mass (m/g)
0.60±0.03
0.68±0.03
0.49±0.02
0.36±0.02
0.08±0.004
Increased multiples
, 百拇医药
23
26
19
14
3
2.5.2 不同pH值对毛状根生长的影响 结果见表4，可见pH值为5.4～5.8时最佳。表4 不同pH值对毛状根生长的影响
Tab 4 The effect of different pH on growth of hairy roots () pH
Fresh mass(m/g)
Dry mass(m/g)
, 百拇医药
5.0
6.48±0.20
0.60±0.04
5.4
7.88±0.23
0.75±0.02
5.8
7.45±0.33
0.71±0.04
6.2
6.38±0.21
0.58±0.04
, http://www.100md.com
6.6
6.10±0.34
0.57±0.03
7.0
6.21±0.42
0.60±0.05
7.4
5.51±0.50
0.53±0.05
3 讨 论
不同的菌株，不同的外植体材料，毛状根的诱导率均不相同，我们采用R1601，ATCC 15834，A4三种菌株均诱导成功，但以A4的效率最高。
, 百拇医药
由于整合进植物基因组中的T-DNA片段上有冠瘿碱合成酶基因，该基因可以在植物细胞中表达，产生冠瘿碱合成酶，使植物能够合成原来本身并不存在的冠瘿碱，所以我们以高压纸电泳检测冠瘿碱的方法来验证T-DNA是否在毛状根中整合和表达[6]。
由于一条毛状根起源于一个细胞，所以我们把外植体上的每条毛状根逐一分开，作为单克隆进行培养，这样的培养物性能稳定，有利于提供稳定的次生代谢产物[3]。
来源不同的毛状根具有不同的生长速度，我们通过筛选得到了生长快速的优质株系MR1和MR4。
发根农杆菌感染植物的方法通常有3种[7]，即共培养法、叶圆盘法和活体接种法，本实验采用叶圆盘法，结果成功诱导出了粟米草的毛状根。
文章编号：0258-879X(1999)10-0764-03
, 百拇医药
参考文献
1 陶德定. 国产粟米草属的分类研究[J]. 云南植物研究, 1990，12(2):129
2 Rajasekaran M, Nair AGR, Hellstrom WJG, et al. Spermicidal activity of an antifungal saponin obtained from the tropical herb Mollugo pentaphylla[J]. Contraception,1993,47(4):401
3 王关林. 发根农杆菌Ri质粒载体转化. 见:王关林，方宏筠主编. 植物基因工程原理与技术[M]. 北京：科学出版社，1998. 237～238
4 谷正男，谷古力，芮和恺. 甘草毛状根的研究[J]. 中药材, 1992，15(10)：3
5 Morgan AJ, Cox PN, Turner DA, et al. Transformation of tomato using an Ri plasmid vector[J]. Plant Sci,1987,49(1):37
6 黄菊辉，周长久，秦凤琴. 发根农杆菌的Ri T-DNA对茎用芥菜的遗传转化[J]. 植物学报 , 1994，36(12)：911
7 路铁钢,孙敬三. 细胞转化技术. 见：孙敬三，桂耀林主编. 植物细胞工程实验技术[M]. 北京：科学出版社, 1995. 241～268 (1999-06-04收稿，1999-08-27修回), 百拇医药
单位：第二军医大学药学院生药学教研室，上海，200433
关键词：粟米草；毛状根；发根农杆菌
第二军医大学学报991018 摘要 目的：建立粟米草(Mollugo pentaphylla L.)的毛状根培养系统并研究毛状根的生长特性。方法：分别用发根农杆菌R1601，ATCC 15834和A4感染粟米草无菌苗的子叶，获得毛状根，并筛选优质株系；用高压纸电泳法对毛状根进行甘露碱检测；测定其生长曲线；比较不同基本培养液、不同pH值对毛状根生长的影响。结果：高压纸电泳结果显示，所获毛状根中均含有甘露碱，表明毛状根中确已转入发根农杆菌的T-DNA；1/2 MS0培养液 pH 5.4～5.8最适合粟米草毛状根的生长。结论：快速生长的粟米草毛状根在药用活性成分的生产上将具有较大潜力。
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中图分类号 R 567.21； R 282.2 文献标识码：A
Study on hairy roots of Mollugo pentaphylla L.
Xu Tiefeng, Zhang Hanming, Ding Ruxian, Li Bohua, Zhang Qiaoyan, Zheng Hanchen
(Department of Pharmacognosy, College of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai,200433)
ABSTRACT Objective: To establish the culture system of hairy roots of Mollugo pentaphylla L.and to study the growth character of hairy roots. Methods: Hairy roots of Mollugo pentaphylla L.were obtained from the colyleden explants infected by Agrobacterium rhizogenes R1601,ATCC15834 and A4.The better lines were selected. Mannopine was examined through paper electrophoresis. The growth curve was obtained and extrinsic factors (different pH and different medium ) affecting the growth of hairy roots were investigated. Results: The results of paper electrophoresis showed that the hairy roots contained mannopine, this evidenced the integration of Ri T-DNA in the transformed plants; 1/2 MS0 liquid medium and pH 5.4～5.8 are suitable for the growth of hairy roots of Mollugo pentaphylla L. Conclusion: The fast-growing hairy roots of Mollugo pentaphylla L. have great potential on the production of active component.
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KEY WORDS Mollugo pentaphylla L.;hairy roots; Agrobacterium rhizogenes
粟米草(Mollugo pentaphylla L.)为粟米草属(Mollugo L.)一年生草本植物，在我国广东、广西、海南、云南有分布[1]，其有效成分为粟米草皂甙A(mollugogenol-A),具抗真菌作用，最近研究表明它还具有较强的杀精子作用[2]，是一味有开发潜力的避孕药。
毛状根培养是80年代在植物细胞培养技术领域发展起来的一项新技术，毛状根培养系统具有生长迅速、不需要外源生长激素、产生次生代谢产物稳定等优点[3]。由于粟米草野生资源极其有限，因此利用毛状根培养生产药用活性成分将是解决资源短缺问题的一条途径。我们对毛状根的诱导、最佳培养条件的选择进行了研究，建立了粟米草的毛状根培养系统。
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1 材料和方法
1.1 发根农杆菌的保存 将中科院北京遗传所提供的3种发根农杆菌ATCC 15834,R1601,A4接种于YEB固体培养基，于25℃ 培养48 h后，置4℃冰箱保存，每两个月转接1次[4]。临用前于YEB固体培养基、25℃活化3次，然后转至YEB培养液(R1601的培养液中加入200 mg/L卡那霉素)于黑暗、25℃，100 r/min振荡培养，12 h后用于感染外植体。
1.2 植物材料 取粟米草种子用清水洗净，在75%乙醇中浸泡1 min，再用0.1% HgCl2消毒10 min，无菌水冲洗5次，置于MS0培养基上，9 d后萌发。取生长10 d的子叶及下胚轴作为外植体，于MS0培养基上预培养24 d后用于转化。
1.3 外植体的转化 将上述预培养的外植体分别浸于处于对数生长期的农杆菌R1601，ATCC 15834，A4菌液中，共培养20 min，取出，用无菌滤纸吸干多余的菌液，置于MS0培养基上培养24 h后移至含300 mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基上培养，25℃，光照12 h/d，并以未经感染的粟米草子叶和下胚轴为对照。
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1.4 毛状根的除菌 将感染后外植体上长出的毛状根剪下移到新的含抗生素的培养基上，每周转接1次，转接3次以后，将培养瓶放入39.5℃的恒温箱中除菌，48 h后取出移到不含抗生素的MS0培养基上。
1.5 毛状根优质株系的筛选 将MS0培养基上的毛状根逐一分开，挑取长2 cm左右者移入1/2 MS0培养液中，50 ml三角锥瓶，每瓶一根，35 ml培养液，20 d后观察生长情况，挑取生长迅速的进行继代培养。
1.6 甘露碱的检出 分别取3种农杆菌感染获得的毛状根各100 mg置于1 ml Eppendorf管，加入0.1 mol/L HCl 100 μl ,捣成匀浆，4℃浸提2 h，1.5×104 r/min离心5 min，取上清液10 μl 点样于Whatman 3 MM滤纸上进行高压纸电泳(400 V，30 mA)，电泳缓冲液为HCOOH∶CH3COOH∶H2O(5∶15∶80)。40 min后将滤纸取出晾干，均匀浸入碱性硝酸银溶液(0.625 g AgNO3溶于50 ml丙酮)中染色1 min，晾干后再浸入10 ml 20% NaOH+90 ml 95%乙醇混合液中显影5 min，最后再经5%硫代硫酸钠溶液中退色20 min[5]，晾干后拍照。以试管苗的正常根为阴性对照，甘露碱标准品(1 mg/ml)为阳性对照。
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1.7 毛状根生长曲线的测定 取生长快速的株系MR4在1/2 MS0培养液中进行测定，每50 ml锥形瓶接种毛状根鲜质量0.43 g(干质量0.047 g)，35 ml培养液，共30瓶。每3 d测1次鲜质量与干质量，每次测3瓶，以平均质量为指标绘制生长曲线。鲜质量系用布氏漏斗抽滤至无水滴下时测得，干质量系60℃ 烘12 h后测得。
1.8 毛状根最佳生长条件的筛选
1.8.1 不同基本培养液对生长的影响 配制MS0, 1/2 MS0, B5，GB5， WS等5种不同的培养液，方法同“生长曲线测定”项，18 d后称质量。
1.8.2 不同pH值对生长的影响 配制pH值分别为5.0，5.4，5.8，6.2，6.6，7.0等6种1/2 MS0培养液，方法同“生长曲线测定”项，18 d后称质量。
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2 结 果
2.1 毛状根的获得 子叶外植体经3种农杆菌感染7 d后陆续有毛状根长出，长出的毛状根具白色根毛，向上、贴壁向上或沿培养基平长，失去向地性(见图1)，而对照子叶出根率较低，并且向下长入培养基中，3种农杆菌中以A4感染效率最高。下胚轴作为外植体无根长出。感染后第14天时出根情况统计见表1。
图1 A4感染10 d后的子叶外植体
Fig 1 Cotyledon explants 10 days after inoculation with A4
表1 3种农杆菌对子叶外植体感染的结果
Tab 1 The results of cotyledon explants infected by
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3 kinds of Agrobacterium rhizogenes
Number of
explants
Number of root-
ed explants
Induction
rate(%)
Control
30
5
16.7
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30
14
46.7
R1601
30
7
23.3
ATCC 15834
30
8
26.7
2.2 快速生长的优质株系的筛选 在1/2 MS0培养液中培养20 d后，观察各瓶中毛状根生长情况，选出生长最快的二个株系MR1和MR4，均系子叶经A4感染后长出，以后各项实验均以MR4为材料(图2，3)。
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图2 固体培养基上的毛状根
Fig 2 Hairy roots on MS0 solid medium
图3 液体培养基上的毛状根
Fig 3 Hairy roots on 1/2 MS0 liquid medium
2.3 甘露碱的检出 高压纸电泳法检测结果显示，在3种农杆菌感染后获得的粟米草毛状根中均含有甘露碱，表明毛状根确已转入农杆菌的T-DNA。正常根无甘露碱斑点(图4)。
图4 纸电泳图谱
, 百拇医药
Fig 4 Paper electrophoresis
1: Negative control; 2,3: Hairy roots; 4: Standard of oppine
2.4 生长速率测定 实验结果见表2，从表中可以看出，毛状根生长量随时间而快速增加，约18 d时质量达最大(增长倍数以干质量求得)，以后毛状根生长量随时间而下降。
表2 毛状根生长速率测定
Tab 2 The growth rate of the hairy roots (
) Time(t/d)
Fresh mass
, 百拇医药
(m/g)
Dry mass
(m/g)
Increased
multiples
0
0.28±0.03
0.024±0.004
3
0.33±0.02
0.032±0.004
1.33
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6
0.54±0.02
0.049±0.003
2.04
9
1.03±0.13
0.099±0.008
4.13
12
1.79±0.19
0.176±0.010
7.33
, 百拇医药
15
3.45±0.22
0.333±0.018
13.88
18
5.90±0.20
0.588±0.018
24.50
21
5.87±0.13
0.583±0.022
24.29
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24
5.83±0.18
0.571±0.040
23.79
27
5.29±0.22
0.530±0.039
22.08
2.5 毛状根最佳生长条件的筛选
2.5.1 不同培养液对毛状根生长的影响 结果见表3，可见1/2 MS0培养液最佳。
表3 不同培养液对毛状根生长的影响
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Tab 3 The effect of different liquid medium on growth of hairy roots (
)MS0
1/2 MS0
B5
GB5
WS0
Fresh mass(m/g)
6.73±0.18
, 百拇医药 7.52±0.24
5.48±0.31
4.07±0.10
0.88±0.06
Dry mass (m/g)
0.60±0.03
0.68±0.03
0.49±0.02
0.36±0.02
0.08±0.004
Increased multiples
, 百拇医药
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2.5.2 不同pH值对毛状根生长的影响 结果见表4，可见pH值为5.4～5.8时最佳。表4 不同pH值对毛状根生长的影响
Tab 4 The effect of different pH on growth of hairy roots (
) pHFresh mass(m/g)
Dry mass(m/g)
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5.0
6.48±0.20
0.60±0.04
5.4
7.88±0.23
0.75±0.02
5.8
7.45±0.33
0.71±0.04
6.2
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0.58±0.04
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6.6
6.10±0.34
0.57±0.03
7.0
6.21±0.42
0.60±0.05
7.4
5.51±0.50
0.53±0.05
3 讨 论
不同的菌株，不同的外植体材料，毛状根的诱导率均不相同，我们采用R1601，ATCC 15834，A4三种菌株均诱导成功，但以A4的效率最高。
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由于整合进植物基因组中的T-DNA片段上有冠瘿碱合成酶基因，该基因可以在植物细胞中表达，产生冠瘿碱合成酶，使植物能够合成原来本身并不存在的冠瘿碱，所以我们以高压纸电泳检测冠瘿碱的方法来验证T-DNA是否在毛状根中整合和表达[6]。
由于一条毛状根起源于一个细胞，所以我们把外植体上的每条毛状根逐一分开，作为单克隆进行培养，这样的培养物性能稳定，有利于提供稳定的次生代谢产物[3]。
来源不同的毛状根具有不同的生长速度，我们通过筛选得到了生长快速的优质株系MR1和MR4。
发根农杆菌感染植物的方法通常有3种[7]，即共培养法、叶圆盘法和活体接种法，本实验采用叶圆盘法，结果成功诱导出了粟米草的毛状根。
文章编号：0258-879X(1999)10-0764-03
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参考文献
1 陶德定. 国产粟米草属的分类研究[J]. 云南植物研究, 1990，12(2):129
2 Rajasekaran M, Nair AGR, Hellstrom WJG, et al. Spermicidal activity of an antifungal saponin obtained from the tropical herb Mollugo pentaphylla[J]. Contraception,1993,47(4):401
3 王关林. 发根农杆菌Ri质粒载体转化. 见:王关林，方宏筠主编. 植物基因工程原理与技术[M]. 北京：科学出版社，1998. 237～238
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5 Morgan AJ, Cox PN, Turner DA, et al. Transformation of tomato using an Ri plasmid vector[J]. Plant Sci,1987,49(1):37
6 黄菊辉，周长久，秦凤琴. 发根农杆菌的Ri T-DNA对茎用芥菜的遗传转化[J]. 植物学报 , 1994，36(12)：911
7 路铁钢,孙敬三. 细胞转化技术. 见：孙敬三，桂耀林主编. 植物细胞工程实验技术[M]. 北京：科学出版社, 1995. 241～268 (1999-06-04收稿，1999-08-27修回), 百拇医药