一氧化氮与结肠炎模型急性期损伤
作者：白爱平 沈志祥 于皆平 余保平 罗莺
单位：白爱平 沈志祥 于皆平 余保平 罗莺 湖北医科大学附属一医院消化内科 湖北省武汉市 430060;白爱平 广东省番禺市何贤纪念医院 511400
关键词：结肠炎；一氧化氮；疾病模型，动物
世界华人消化杂志991027 中国图书馆分类号 R574.62
Subject headings colitis; nitric oxide; disease models, animal
炎症性肠病(inflammative bowel diseases, IBD)的病因和发病机制尚不清楚. 1993年Middlefon et al[1]发现IBD活动期患者病变肠段产生NO的量明显高于正常对照组，推测NO可能参与IBD的发病. 但NO如何参与IBD的发病机制目前尚缺详尽报道. 我们探讨NO参与IBD的可能机制及与组织损伤间的关系.
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1 材料和方法
1.1 材料 硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、三硝基苯磺酸(TNB)：美国Sigma公司产品；地塞米松、戊巴比妥纳：广州桥制药厂产品；检测MDA、GSH的试剂；北京邦定生物公司产品；752紫外光珊分光光度计：上海分析仪器厂生产；BS60恒温水浴箱：北京医疗设备厂生产. 成年♂SD大白鼠，由湖北医科大学实验动物中心提供，置于温度为23℃±2℃的清洁实验室内饲养.
1.2 方法 实验拟分为对照组、损伤对照组、NAME(四种剂量：N1、N2、N3、N4)组和地塞米松组(Dex组). 将体质量约220g～250g大白鼠随机分为7组，每组10只，予标准饮食2d后制备模型. 以戊巴比妥纳轻度麻醉大白鼠后，以外径0.3mm细管插入鼠肛内约7cm，再经细管内注入TNB 30mg+生理盐水0.25mL(对照组). TNB 30mg+50%乙醇0.25mL(损伤对照组、NAME组和Dex组)，5min注完. NAME组中，取4种剂量的NAME 10，30，50，70mg/(kg.d)，即N1，N2，N3，N4组，溶于5mL饮水中，在制备模型同时开始让鼠饮用，5mL水饮完后再提供30mL～40mL水(内不含药物)，以上每日重复用药至实验结束. Dex组，取2mg/kg地塞米松予大鼠腹腔注射，制备模型前3h进行，以后每日重复至实验结束. 实验后7d处死鼠，分离结肠，自距肛门9cm处沿长轴剖开结肠，冰生理盐水反复冲洗肠腔，除去肠表面水分后分离出距肛门6cm～8cm处肠组织，称重后剪碎，加pH 7.4 PBS溶液后制成100g/L的组织匀浆，4000r/min离心5min取上清进行以下检测：NO的检测采用萘乙烯二乙胺盐酸法[2]，MDA采用TBA显色法[3]，GSH活性测定采用二硫对二硝基苯甲酸法[4].
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统计学处理 实验数据以均数±标准差(
±s)表示. 数据间比较和相关性分析应用SAS统计软件内方差检验和相关分析.
2 结果
2.1 各组NO，MDA和GSH值. NO值：NAME组、Dex组与损伤组、对照组有显著性差异(P<0.01，表1)，N1，N2组与N3，N4，Dex组有差异(P<0.05). MDA，GSH值：NAME组，Dex组与损伤组，对照组有显著性差异(P<0.01).
表1 实验性结肠炎NO，MDA和GSH值 组别
NO(μmol/g)
MDA(nmol/g)
GSH(nmol/g)
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损伤组
548.3±102.9
34.8±6.7
21.1±1.6
对照组
199.3±30.2
6.9±2.8
54.6±5.8
N1组
438.0±61.5
30.9±5.9
24.7±4.0
, 百拇医药
N2组
405.0±37.5
29.0±4.9
26.9±3.1
N3组
357.3±40.2
22.8±1.68
31.5±2
N4组
314.7±19.7
3.2±3.5
32.1±3.6
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Dex组
311.7±42.8
17.8±3.3
36.7±4.1
2.2 每组NO，MDA，GSH间的相关性，其中，NO与MDA存在正相关(R=0.848，P<0.01，图1)，与GSH存在负相关关系(R=-0.734，P<0.01，图2). MDA与GSH存在负相关关系(R=-0.828，P<0.01，图3).
图1 NO与MDA间相关分析.
图2 NO与GSH间相关分析.
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图3 MDA与GSH间相关分析.
3 讨论
本实验中，我们选择了TNB+乙醇制备免疫性结肠炎模型，该模型与IBD尤其克隆病在临床病理、免疫等方面十分相似[5]. 我们用不同剂量的NAME加入鼠饮水中，抑制NOS酶的活性，以控制炎症肠段NO的生成量. 实验7d，损伤组NO值为548.3μmol/g，丙二醛(MDA)为34.8nmol/g，随着NAME剂量加大，NO值由N1的438.0μmol/g降至N4的314.7μmol/g，MDA值也由N1的30.9nmol/g降至N3的22.8nmol/g和N4的23.2nmol/g. 相关分析显示NO与MDA值存在正的直线相关关系. 实验结果显示结肠炎急性期时有大量NO生成，且NO生成量与结肠炎性损伤程度有密切关系.
谷胱甘肽(GSH)是一种存在于胞质和线粒体的非蛋白巯基化合物，具催化分解体内H2O2和脂质过氧化物、清除过多的活性氧的功能[6]. 目前NO参与炎症反应的机制尚未完全明了，许多学者倾向于如下机制[7]，即NO生成过程中，有大量具有很强的生物氧化功能的自由基生成，这些自由基使巯基蛋白和脂质氧化，并影响线粒体电子传递功能，造成组织细胞损伤. 同时NO介导激活中性粒细胞和单核细胞，使炎症反应进一步扩大. 本实验中，损伤组GSH值为21.1nmol/g，随着NAME剂量加大，GSH值随NO水平下降而上升，由N1的24.7nmol/g升至N4的32.1nmol/g，接近Dex组(36.7nmol/g). 说明随着炎症反应的进展，NO大量生成，大量自由基产生，造成还原型GSH的耗竭，组织GSH水平的下降与结肠组织的损伤也有着密切联系.
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NO是机体组织细胞内一氧化氮合酶(NO synthase, NOS)，催化L-精氨酸所生成，现常把NOS分为两型[8]：原生酶(constitutive NO synthase, CNOS)和诱生酶(inducible NO synthase, iNOS). CNOS主要分布于内皮细胞、神经细胞、平滑肌细胞等，其在体内仅存在几分钟，生成NO量较少. iNOS主要分布于巨噬细胞，中性粒细胞、胃肠粘膜细胞等，炎症反应时iNOS大量生成，且其存在时间可长达5d，由iNOS催化产生的NO量比CNOS要多. 地塞米松能选择性地抑制iNOS的表达，对CNOS活性无影响. NAME为精氨酸类似物，能竞争性抑制NOS活性，对iNOS和CNOS均有抑制作用. 实验中，随着NAME剂量加大，结肠组织生成NO的量减少，MDA值相应减小，GSH值增高. 以NAME 50，70mg/(kg.d)的量给鼠摄取，在急性期鼠结肠炎的炎性损伤控制方面有较明显的作用，其MDA，GSH值接近Dex组，说明NAME对鼠结肠炎具有一定的药物治疗作用，在今后用于治疗人类炎症性肠病方面具有药物研究价值.
, 百拇医药
通讯作者：白爱平
参考文献
1 Middlefon SJ, Shorthouse M, Hunter JO. Increased nitcic oxide synthesis in ulcerative colitis. LANCET, 1993;134:465-466
2 Stuehr DJ, Marletta MA. Mammalian nitrite biosynthesis: mouse macrophages produce nitrite and nitrate in response to escherichia coli lipopolysaccharide. Proc Natl Acad Sci Usa, 1985;82:7738-7742
3 Asakawa T. Thiobabituric acid test for detection lipid peroxides. Lipids, 1979;14:401-408
, http://www.100md.com
4 黄家琛，郑国珊. 鼻咽癌患者血中谷胱甘肽过氧化酶水平的初步研究. 癌症，1989；8:310-312
5 Morris GP, Beck PI, Herridge MS. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology, 1989;96:795-803
6 Mehta A, Singh S, Ganguly NK. Impairment of intestinal mucosal antioxidant defensive system during solmonella typhimurium infection. Dig Dis Sci, 1998;43:646-651
7 Vladutiu AO. Role of nitric oxide in antoimmunity. Clin Immunol Immunophathol, 1995;76:1-11
8 Jattrey SR, Snyder SH. Nitric oxide: a neural messenger. Annu Rev Cell Dev Biol, 1995;11:417-440
收稿日期 1999-05-19 修回日期 1999-08-06, 百拇医药
单位：白爱平 沈志祥 于皆平 余保平 罗莺 湖北医科大学附属一医院消化内科 湖北省武汉市 430060;白爱平 广东省番禺市何贤纪念医院 511400
关键词：结肠炎；一氧化氮；疾病模型，动物
世界华人消化杂志991027 中国图书馆分类号 R574.62
Subject headings colitis; nitric oxide; disease models, animal
炎症性肠病(inflammative bowel diseases, IBD)的病因和发病机制尚不清楚. 1993年Middlefon et al[1]发现IBD活动期患者病变肠段产生NO的量明显高于正常对照组，推测NO可能参与IBD的发病. 但NO如何参与IBD的发病机制目前尚缺详尽报道. 我们探讨NO参与IBD的可能机制及与组织损伤间的关系.
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1 材料和方法
1.1 材料 硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、三硝基苯磺酸(TNB)：美国Sigma公司产品；地塞米松、戊巴比妥纳：广州桥制药厂产品；检测MDA、GSH的试剂；北京邦定生物公司产品；752紫外光珊分光光度计：上海分析仪器厂生产；BS60恒温水浴箱：北京医疗设备厂生产. 成年♂SD大白鼠，由湖北医科大学实验动物中心提供，置于温度为23℃±2℃的清洁实验室内饲养.
1.2 方法 实验拟分为对照组、损伤对照组、NAME(四种剂量：N1、N2、N3、N4)组和地塞米松组(Dex组). 将体质量约220g～250g大白鼠随机分为7组，每组10只，予标准饮食2d后制备模型. 以戊巴比妥纳轻度麻醉大白鼠后，以外径0.3mm细管插入鼠肛内约7cm，再经细管内注入TNB 30mg+生理盐水0.25mL(对照组). TNB 30mg+50%乙醇0.25mL(损伤对照组、NAME组和Dex组)，5min注完. NAME组中，取4种剂量的NAME 10，30，50，70mg/(kg.d)，即N1，N2，N3，N4组，溶于5mL饮水中，在制备模型同时开始让鼠饮用，5mL水饮完后再提供30mL～40mL水(内不含药物)，以上每日重复用药至实验结束. Dex组，取2mg/kg地塞米松予大鼠腹腔注射，制备模型前3h进行，以后每日重复至实验结束. 实验后7d处死鼠，分离结肠，自距肛门9cm处沿长轴剖开结肠，冰生理盐水反复冲洗肠腔，除去肠表面水分后分离出距肛门6cm～8cm处肠组织，称重后剪碎，加pH 7.4 PBS溶液后制成100g/L的组织匀浆，4000r/min离心5min取上清进行以下检测：NO的检测采用萘乙烯二乙胺盐酸法[2]，MDA采用TBA显色法[3]，GSH活性测定采用二硫对二硝基苯甲酸法[4].
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统计学处理 实验数据以均数±标准差(
±s)表示. 数据间比较和相关性分析应用SAS统计软件内方差检验和相关分析.2 结果
2.1 各组NO，MDA和GSH值. NO值：NAME组、Dex组与损伤组、对照组有显著性差异(P<0.01，表1)，N1，N2组与N3，N4，Dex组有差异(P<0.05). MDA，GSH值：NAME组，Dex组与损伤组，对照组有显著性差异(P<0.01).
表1 实验性结肠炎NO，MDA和GSH值 组别
NO(μmol/g)
MDA(nmol/g)
GSH(nmol/g)
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损伤组
548.3±102.9
34.8±6.7
21.1±1.6
对照组
199.3±30.2
6.9±2.8
54.6±5.8
N1组
438.0±61.5
30.9±5.9
24.7±4.0
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N2组
405.0±37.5
29.0±4.9
26.9±3.1
N3组
357.3±40.2
22.8±1.68
31.5±2
N4组
314.7±19.7
3.2±3.5
32.1±3.6
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Dex组
311.7±42.8
17.8±3.3
36.7±4.1
2.2 每组NO，MDA，GSH间的相关性，其中，NO与MDA存在正相关(R=0.848，P<0.01，图1)，与GSH存在负相关关系(R=-0.734，P<0.01，图2). MDA与GSH存在负相关关系(R=-0.828，P<0.01，图3).
图1 NO与MDA间相关分析.
图2 NO与GSH间相关分析.
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图3 MDA与GSH间相关分析.
3 讨论
本实验中，我们选择了TNB+乙醇制备免疫性结肠炎模型，该模型与IBD尤其克隆病在临床病理、免疫等方面十分相似[5]. 我们用不同剂量的NAME加入鼠饮水中，抑制NOS酶的活性，以控制炎症肠段NO的生成量. 实验7d，损伤组NO值为548.3μmol/g，丙二醛(MDA)为34.8nmol/g，随着NAME剂量加大，NO值由N1的438.0μmol/g降至N4的314.7μmol/g，MDA值也由N1的30.9nmol/g降至N3的22.8nmol/g和N4的23.2nmol/g. 相关分析显示NO与MDA值存在正的直线相关关系. 实验结果显示结肠炎急性期时有大量NO生成，且NO生成量与结肠炎性损伤程度有密切关系.
谷胱甘肽(GSH)是一种存在于胞质和线粒体的非蛋白巯基化合物，具催化分解体内H2O2和脂质过氧化物、清除过多的活性氧的功能[6]. 目前NO参与炎症反应的机制尚未完全明了，许多学者倾向于如下机制[7]，即NO生成过程中，有大量具有很强的生物氧化功能的自由基生成，这些自由基使巯基蛋白和脂质氧化，并影响线粒体电子传递功能，造成组织细胞损伤. 同时NO介导激活中性粒细胞和单核细胞，使炎症反应进一步扩大. 本实验中，损伤组GSH值为21.1nmol/g，随着NAME剂量加大，GSH值随NO水平下降而上升，由N1的24.7nmol/g升至N4的32.1nmol/g，接近Dex组(36.7nmol/g). 说明随着炎症反应的进展，NO大量生成，大量自由基产生，造成还原型GSH的耗竭，组织GSH水平的下降与结肠组织的损伤也有着密切联系.
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NO是机体组织细胞内一氧化氮合酶(NO synthase, NOS)，催化L-精氨酸所生成，现常把NOS分为两型[8]：原生酶(constitutive NO synthase, CNOS)和诱生酶(inducible NO synthase, iNOS). CNOS主要分布于内皮细胞、神经细胞、平滑肌细胞等，其在体内仅存在几分钟，生成NO量较少. iNOS主要分布于巨噬细胞，中性粒细胞、胃肠粘膜细胞等，炎症反应时iNOS大量生成，且其存在时间可长达5d，由iNOS催化产生的NO量比CNOS要多. 地塞米松能选择性地抑制iNOS的表达，对CNOS活性无影响. NAME为精氨酸类似物，能竞争性抑制NOS活性，对iNOS和CNOS均有抑制作用. 实验中，随着NAME剂量加大，结肠组织生成NO的量减少，MDA值相应减小，GSH值增高. 以NAME 50，70mg/(kg.d)的量给鼠摄取，在急性期鼠结肠炎的炎性损伤控制方面有较明显的作用，其MDA，GSH值接近Dex组，说明NAME对鼠结肠炎具有一定的药物治疗作用，在今后用于治疗人类炎症性肠病方面具有药物研究价值.
, 百拇医药
通讯作者：白爱平
参考文献
1 Middlefon SJ, Shorthouse M, Hunter JO. Increased nitcic oxide synthesis in ulcerative colitis. LANCET, 1993;134:465-466
2 Stuehr DJ, Marletta MA. Mammalian nitrite biosynthesis: mouse macrophages produce nitrite and nitrate in response to escherichia coli lipopolysaccharide. Proc Natl Acad Sci Usa, 1985;82:7738-7742
3 Asakawa T. Thiobabituric acid test for detection lipid peroxides. Lipids, 1979;14:401-408
, http://www.100md.com
4 黄家琛，郑国珊. 鼻咽癌患者血中谷胱甘肽过氧化酶水平的初步研究. 癌症，1989；8:310-312
5 Morris GP, Beck PI, Herridge MS. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology, 1989;96:795-803
6 Mehta A, Singh S, Ganguly NK. Impairment of intestinal mucosal antioxidant defensive system during solmonella typhimurium infection. Dig Dis Sci, 1998;43:646-651
7 Vladutiu AO. Role of nitric oxide in antoimmunity. Clin Immunol Immunophathol, 1995;76:1-11
8 Jattrey SR, Snyder SH. Nitric oxide: a neural messenger. Annu Rev Cell Dev Biol, 1995;11:417-440
收稿日期 1999-05-19 修回日期 1999-08-06, 百拇医药