中药芪龙方抑制实验性胃肿瘤的作用
作者：陈飞松 任蜀兵 李春梅 刘晋生 郭培元 危北海 施波 傅招娣 雷小虹
单位：.陈飞松 任蜀兵 李春梅 刘晋生 郭培元 危北海 北京市中医研究所 北京市 100010; 施波 傅招娣 雷小虹 中国医学科学院药物研究所 北京市 100050
关键词：胃肿瘤/治疗；癌前状态；芪龙方；中医药疗法
中国图书馆分类号 R735中国图书馆分类号 R735.2
Subject headings stomach neoplasms/therapy; precancerous conditions; TCD drug therapy
芪龙方是北京市中医研究所在临床应用治疗胃癌癌前疾病数十年的基础上，不断总结和发展起来的经验方剂. 芪龙方具有健脾益气，清热活血解毒之功效. 临床用于治疗胃癌癌前疾病不仅疗效确切，还未发现毒副作用. 因此我们为了深入研究芪龙方的作用，以期初步阐明芪龙方治疗胃癌癌前疾病的作用机制，为临床更广泛的应用芪龙方，提供理论依据和实验研究的基础. 本文以小鼠Lewis肺癌、前胃癌(FC)为体内移植瘤，探讨芪龙方对实验性肿瘤的抑制作用，并以人胃腺癌BGC-823，BGC-803及MNK-28等细胞株为材料，用MTT法进行芪龙方的提取物体外抑制肿瘤细胞生长作用的研究.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 ♂ 近交系615小鼠及C57小鼠，18g～22g，4wk～6wk. 中国医学科学院医学实验动物研究所提供. 小鼠Lewis肺癌、前胃癌FC瘤株分别由中国医学科学院药物研究所肿瘤药理室及基础医学研究所病理室实验肿瘤组提供. 人胃腺癌BGC-823，BGC-803及MNK-28细胞，北京市肿瘤防治研究所化学病因室惠赠. 中药芪龙方：①水剂为褐色液体. 芪龙方由黄芪，党参，龙葵，黄芩，甘草，丹参等组成. 将芪龙方以5倍水量加热提取3次，合并提取液浓缩至100%(相当于含生药1kg/L). ②芪龙方提取物：上述提取液浓缩，加950mL/L乙醇醇沉3次，回收乙醇至无醇味，低温静止沉淀，过滤. 调pH值和渗透压，加热煮沸活性炭脱色，0.22μm滤膜滤过，灌封，100℃流通蒸汽灭菌30min，低温保存备用. ③化疗药物：速溶型阿霉素，意大利爱宝大药厂生产. 批号：4025BA. RPMI1640培养基：RPMI培养干粉(Gibco产品，双蒸水配制，内含2mmol/L谷氨酞胺，青霉素100U/L，链霉素100mg/L，调pH至7.4，抽滤漏斗过滤，应用时再加入100mL/L灭活的小牛血清. MEN/F12培养基(Gibco产品)：10g干粉加重蒸水和NaHCO3 1.2g，调pH至7.4，抽滤漏斗过滤，应用时再加入100mL/L灭活的小牛血清. 四甲基偶氮哇盐(MTT)：Sigma公司产品. 用0.02mol/L PBS液配制成5g/L贮存液，过滤除菌，4℃冰箱保存备用. 酶标仪(Microplate AUTO Reader)EL311，美国BIO-TEK公司生产.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 对移植性肿瘤的抑瘤作用观察 按常规方法，在无菌条件下，选择生长良好的FC瘤株，通过100目不锈钢筛网研磨成单个瘤细胞悬液，调整计数5×106/L取0.2mL接种于每只615小鼠右腋皮下，24h后称重随机分组：①芪龙方分为高、中、低剂量组：分别灌服2000mg/kg，1000mg/kg，500mg/kg(相当于原生药量)的芪龙方水溶液，1次/d. ②阿霉素组：接种次日起隔日腹腔注射阿霉素稀释液0.2mL (1.5mg/kg). ③芪龙方+阿霉素组：芪龙方中剂量(1000mg/kg)和阿霉素(1.5mg/kg)联合用药，给药方式同①和②. ④对照组：接种24h后每天灌服生理盐水15mL/kg. 接种11d停药，次日处死动物，剥瘤称重，按公式计算抑瘤率，进行统计学处理：抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%[4].
1.2.2 对人胃腺癌细胞的杀伤的作用 于对数生长期的胃腺癌BGC-823，BGC-803和MNK28，经2.5g/L胰酶-0.2g/L EDTA消化脱壁后RPMI-1640(MNK28 MEN/F12)完全培养液调整细胞计数为5×108/L，取100μL及药物溶液(芪龙方提取物4，8，16g/L，阿霉素稀释液2.5，5，10mg/L) RPMI-1640完全培养液80μL依次加入96孔板中. 对照组单纯加入培养液100μL，另设培养液对照孔，每组复孔为6个，置于37℃，50mL/L湿化的CO2培养箱中孵育48h后，沿培养孔边缘轻轻吸出上清100μL，加入MTT储液10μL(5g/L)，继续培养4h，加入100mL/L酸化的十二烷基酸钠(SDS)100μL(pH 7.4)，过夜用EL311测其
(OD)值，测定波长570nm，参考波长630nm，计算芪龙方提取物对细胞的抑制率(%).
, http://www.100md.com
抑制率(%)=对照组平均-(药物组平均-空白组平均)/对照组平均A×100%[3].
2 结果
2.1 对移植性肿瘤的抑瘤作用 见表1.
表1 芪龙方对小鼠前胃癌(FC)的抑瘤作用
(
±s)
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分组
15mL/kg
动物(只)
体重(g)
瘤重(g)
抑瘤率(%)
始
末
疗前
疗后
芪龙方
高剂量
2000mg/kg
, http://www.100md.com
12
12
19.4±0.6
28.4±0.7
0.95±0.48b
49.5
中剂量
1000mg/kg
12
12
19.2±0.5
28.8±0.8
, 百拇医药
1.26±0.64ac
33.0
低剂量
500mg/kg
12
12
19.3±0.7
29.2±0.9
1.48±0.34d
21.3
阿霉素
1.5mg/kg
, 百拇医药
12
10
19.5±0.6
23.6±0.7
0.88±0.52b
53.2
阿霉素+芪龙方
中剂量
12
12
19.3±0.5
27.3±0.7
, http://www.100md.com
0.82±0.49b
56.4
对照
NS
12
12
19.3±0.4
26.3±0.6
1.88±0.72
—
aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组；cP<0.05，dP<0.01，vs 阿霉素组.2.2 对体外培养的胃腺癌细胞生长抑制作用 芪龙方提取物0.4,0.8，1.6g/L等3个剂量组对人胃腺癌BGC-823细胞的平均抑制率分别为32.8%，40.5%，50.0%；对人胃腺癌BGC-803细胞的平均抑制率分别为30.1%，44.7%，49.3%；对人胃腺癌MNK-28细胞的平均抑制率分别为18.7%，29.8%，47.2%(表2). 结果显示芪龙方提取物、阿霉素对胃腺癌BGC-823，BGC-803和MNK-28在体外生长有一定的抑制作用，且抑制作用随药物浓度加大而升高.
, 百拇医药
表2 芪龙方提取物对BGC-823,BGC-803和MNK-28细胞体外的抑制率(MTT法)
(±s)
分组
药物剂量
BGC-823
BGC-803
MNK-28
A(OD)
抑制率(%)
, 百拇医药
A(OD)
抑制率(%)
A(OD)
抑制率(%)
对照
Medium
0.63±0.05
—
0.57±0.06
—
0.56±0.03
—
芪龙方
, 百拇医药
0.4g/L
0.42±0.05
32.8
0.40±0.03
30.1
0.48±0.04
18.7
0.8g/L
0.38±0.05
40.5
0.31±0.02
44.7
, http://www.100md.com
0.40±0.03
29.8
1.6g/L
0.32±0.03
50.0
0.29±0.02
49.3
0.30±0.02
47.2
阿霉素
2.5mg/L
0.33±0.04
, 百拇医药
47.9
0.34±0.03
37.8
0.30±0.03
46.4
5mg/L
0.27±0.03
57.8
0.27±0.03
52.6
0.27±0.02
52.5
, http://www.100md.com
10mg/L
0.20±0.03
69.1
0.19±0.01
67.3
0.22±0.01
61.9
3 讨论
芪龙方有较好的防治胃癌癌前疾病的作用和抗始发突变作用[1，2]. 芪龙方的提取物对人胃腺癌BGC-823,BGC-803和MNK-28细胞株的体外生长有抑制作用，随着剂量的增加，其抑制作用亦明显增强. 同样，这种直接的抑制作用没有阿霉素强. 因此，对人胃腺癌BGC-823,BGC-803和MNK-28细胞株的体外生长有抑制作用也弱于阿霉素. 阿霉素是细胞毒型的药物，其对肿瘤细胞(也包括部分正常细胞)的直接杀伤作用强，这正是阿霉素治疗肿瘤的作用. 因其可能杀伤正常细胞，会出现明显的毒副作用. 尽管芪龙方对肿瘤细胞的直接杀伤作用明显弱于阿霉素，芪龙方的细胞毒作用并不强，芪龙方除了具有一定的细胞毒作用外，可能是通过其他途径对肿瘤细胞和肿瘤组织的生长具有明显的抑制作用. 因此应用芪龙方的各组动物及阿霉素加芪龙方组的动物的体重无减轻. 芪龙方在临床和实验研究中，没有毒副作用出现. 我们将在未来的研究(论文)中进一步探讨芪龙方的作用及其机制.
, 百拇医药
国家自然科学基金资助，No.9500188，北京市科委，科技新星计划资助，No.854871300
通讯作者：陈飞松
参考文献
1 陈飞松，施波，危北海，车建途，任蜀兵，刘晋生. 芪龙方(胃平2号)防治MNNG诱发的新生大鼠胃癌癌前病变的作用. 肿瘤生物学进展. 第1版. 北京：军事医学科学出版社，1997：176
2 施波，陈飞松，符招娣，刘晋生，任蜀兵，李燕，徐春军. 芪龙方的抗始发突变作用. 中草药，1998；30：46-48
3 韩锐. 抗癌药物研究与实验技术. 第1版. 北京：北京医科大学 中国协和医科大学联合出版社，1997：284
4 Carmichael J, DeGraff WC, Gazdar AF, Andosn GT. Evaluation of a terazolium-based semiautomated colorimetri assay: assessment of chemosensitivity. Cancer Res, 1987;47:936-942
收稿日期 1999-01-24, http://www.100md.com
单位：.陈飞松 任蜀兵 李春梅 刘晋生 郭培元 危北海 北京市中医研究所 北京市 100010; 施波 傅招娣 雷小虹 中国医学科学院药物研究所 北京市 100050
关键词：胃肿瘤/治疗；癌前状态；芪龙方；中医药疗法
中国图书馆分类号 R735中国图书馆分类号 R735.2
Subject headings stomach neoplasms/therapy; precancerous conditions; TCD drug therapy
芪龙方是北京市中医研究所在临床应用治疗胃癌癌前疾病数十年的基础上，不断总结和发展起来的经验方剂. 芪龙方具有健脾益气，清热活血解毒之功效. 临床用于治疗胃癌癌前疾病不仅疗效确切，还未发现毒副作用. 因此我们为了深入研究芪龙方的作用，以期初步阐明芪龙方治疗胃癌癌前疾病的作用机制，为临床更广泛的应用芪龙方，提供理论依据和实验研究的基础. 本文以小鼠Lewis肺癌、前胃癌(FC)为体内移植瘤，探讨芪龙方对实验性肿瘤的抑制作用，并以人胃腺癌BGC-823，BGC-803及MNK-28等细胞株为材料，用MTT法进行芪龙方的提取物体外抑制肿瘤细胞生长作用的研究.
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1 材料和方法
1.1 材料 ♂ 近交系615小鼠及C57小鼠，18g～22g，4wk～6wk. 中国医学科学院医学实验动物研究所提供. 小鼠Lewis肺癌、前胃癌FC瘤株分别由中国医学科学院药物研究所肿瘤药理室及基础医学研究所病理室实验肿瘤组提供. 人胃腺癌BGC-823，BGC-803及MNK-28细胞，北京市肿瘤防治研究所化学病因室惠赠. 中药芪龙方：①水剂为褐色液体. 芪龙方由黄芪，党参，龙葵，黄芩，甘草，丹参等组成. 将芪龙方以5倍水量加热提取3次，合并提取液浓缩至100%(相当于含生药1kg/L). ②芪龙方提取物：上述提取液浓缩，加950mL/L乙醇醇沉3次，回收乙醇至无醇味，低温静止沉淀，过滤. 调pH值和渗透压，加热煮沸活性炭脱色，0.22μm滤膜滤过，灌封，100℃流通蒸汽灭菌30min，低温保存备用. ③化疗药物：速溶型阿霉素，意大利爱宝大药厂生产. 批号：4025BA. RPMI1640培养基：RPMI培养干粉(Gibco产品，双蒸水配制，内含2mmol/L谷氨酞胺，青霉素100U/L，链霉素100mg/L，调pH至7.4，抽滤漏斗过滤，应用时再加入100mL/L灭活的小牛血清. MEN/F12培养基(Gibco产品)：10g干粉加重蒸水和NaHCO3 1.2g，调pH至7.4，抽滤漏斗过滤，应用时再加入100mL/L灭活的小牛血清. 四甲基偶氮哇盐(MTT)：Sigma公司产品. 用0.02mol/L PBS液配制成5g/L贮存液，过滤除菌，4℃冰箱保存备用. 酶标仪(Microplate AUTO Reader)EL311，美国BIO-TEK公司生产.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 对移植性肿瘤的抑瘤作用观察 按常规方法，在无菌条件下，选择生长良好的FC瘤株，通过100目不锈钢筛网研磨成单个瘤细胞悬液，调整计数5×106/L取0.2mL接种于每只615小鼠右腋皮下，24h后称重随机分组：①芪龙方分为高、中、低剂量组：分别灌服2000mg/kg，1000mg/kg，500mg/kg(相当于原生药量)的芪龙方水溶液，1次/d. ②阿霉素组：接种次日起隔日腹腔注射阿霉素稀释液0.2mL (1.5mg/kg). ③芪龙方+阿霉素组：芪龙方中剂量(1000mg/kg)和阿霉素(1.5mg/kg)联合用药，给药方式同①和②. ④对照组：接种24h后每天灌服生理盐水15mL/kg. 接种11d停药，次日处死动物，剥瘤称重，按公式计算抑瘤率，进行统计学处理：抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%[4].
1.2.2 对人胃腺癌细胞的杀伤的作用 于对数生长期的胃腺癌BGC-823，BGC-803和MNK28，经2.5g/L胰酶-0.2g/L EDTA消化脱壁后RPMI-1640(MNK28 MEN/F12)完全培养液调整细胞计数为5×108/L，取100μL及药物溶液(芪龙方提取物4，8，16g/L，阿霉素稀释液2.5，5，10mg/L) RPMI-1640完全培养液80μL依次加入96孔板中. 对照组单纯加入培养液100μL，另设培养液对照孔，每组复孔为6个，置于37℃，50mL/L湿化的CO2培养箱中孵育48h后，沿培养孔边缘轻轻吸出上清100μL，加入MTT储液10μL(5g/L)，继续培养4h，加入100mL/L酸化的十二烷基酸钠(SDS)100μL(pH 7.4)，过夜用EL311测其
(OD)值，测定波长570nm，参考波长630nm，计算芪龙方提取物对细胞的抑制率(%)., http://www.100md.com
抑制率(%)=对照组平均
-(药物组平均-空白组平均)/对照组平均A×100%[3].2 结果
2.1 对移植性肿瘤的抑瘤作用 见表1.
表1 芪龙方对小鼠前胃癌(FC)的抑瘤作用
(
±s), http://www.100md.com
分组
15mL/kg
动物(只)
体重(g)
瘤重(g)
抑瘤率(%)
始
末
疗前
疗后
芪龙方
高剂量
2000mg/kg
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12
12
19.4±0.6
28.4±0.7
0.95±0.48b
49.5
中剂量
1000mg/kg
12
12
19.2±0.5
28.8±0.8
, 百拇医药
1.26±0.64ac
33.0
低剂量
500mg/kg
12
12
19.3±0.7
29.2±0.9
1.48±0.34d
21.3
阿霉素
1.5mg/kg
, 百拇医药
12
10
19.5±0.6
23.6±0.7
0.88±0.52b
53.2
阿霉素+芪龙方
中剂量
12
12
19.3±0.5
27.3±0.7
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0.82±0.49b
56.4
对照
NS
12
12
19.3±0.4
26.3±0.6
1.88±0.72
—
aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组；cP<0.05，dP<0.01，vs 阿霉素组.2.2 对体外培养的胃腺癌细胞生长抑制作用 芪龙方提取物0.4,0.8，1.6g/L等3个剂量组对人胃腺癌BGC-823细胞的平均抑制率分别为32.8%，40.5%，50.0%；对人胃腺癌BGC-803细胞的平均抑制率分别为30.1%，44.7%，49.3%；对人胃腺癌MNK-28细胞的平均抑制率分别为18.7%，29.8%，47.2%(表2). 结果显示芪龙方提取物、阿霉素对胃腺癌BGC-823，BGC-803和MNK-28在体外生长有一定的抑制作用，且抑制作用随药物浓度加大而升高.
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表2 芪龙方提取物对BGC-823,BGC-803和MNK-28细胞体外的抑制率(MTT法)
(
±s)分组
药物剂量
BGC-823
BGC-803
MNK-28
A(OD)
抑制率(%)
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A(OD)
抑制率(%)
A(OD)
抑制率(%)
对照
Medium
0.63±0.05
—
0.57±0.06
—
0.56±0.03
—
芪龙方
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0.4g/L
0.42±0.05
32.8
0.40±0.03
30.1
0.48±0.04
18.7
0.8g/L
0.38±0.05
40.5
0.31±0.02
44.7
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0.40±0.03
29.8
1.6g/L
0.32±0.03
50.0
0.29±0.02
49.3
0.30±0.02
47.2
阿霉素
2.5mg/L
0.33±0.04
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47.9
0.34±0.03
37.8
0.30±0.03
46.4
5mg/L
0.27±0.03
57.8
0.27±0.03
52.6
0.27±0.02
52.5
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10mg/L
0.20±0.03
69.1
0.19±0.01
67.3
0.22±0.01
61.9
3 讨论
芪龙方有较好的防治胃癌癌前疾病的作用和抗始发突变作用[1，2]. 芪龙方的提取物对人胃腺癌BGC-823,BGC-803和MNK-28细胞株的体外生长有抑制作用，随着剂量的增加，其抑制作用亦明显增强. 同样，这种直接的抑制作用没有阿霉素强. 因此，对人胃腺癌BGC-823,BGC-803和MNK-28细胞株的体外生长有抑制作用也弱于阿霉素. 阿霉素是细胞毒型的药物，其对肿瘤细胞(也包括部分正常细胞)的直接杀伤作用强，这正是阿霉素治疗肿瘤的作用. 因其可能杀伤正常细胞，会出现明显的毒副作用. 尽管芪龙方对肿瘤细胞的直接杀伤作用明显弱于阿霉素，芪龙方的细胞毒作用并不强，芪龙方除了具有一定的细胞毒作用外，可能是通过其他途径对肿瘤细胞和肿瘤组织的生长具有明显的抑制作用. 因此应用芪龙方的各组动物及阿霉素加芪龙方组的动物的体重无减轻. 芪龙方在临床和实验研究中，没有毒副作用出现. 我们将在未来的研究(论文)中进一步探讨芪龙方的作用及其机制.
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国家自然科学基金资助，No.9500188，北京市科委，科技新星计划资助，No.854871300
通讯作者：陈飞松
参考文献
1 陈飞松，施波，危北海，车建途，任蜀兵，刘晋生. 芪龙方(胃平2号)防治MNNG诱发的新生大鼠胃癌癌前病变的作用. 肿瘤生物学进展. 第1版. 北京：军事医学科学出版社，1997：176
2 施波，陈飞松，符招娣，刘晋生，任蜀兵，李燕，徐春军. 芪龙方的抗始发突变作用. 中草药，1998；30：46-48
3 韩锐. 抗癌药物研究与实验技术. 第1版. 北京：北京医科大学 中国协和医科大学联合出版社，1997：284
4 Carmichael J, DeGraff WC, Gazdar AF, Andosn GT. Evaluation of a terazolium-based semiautomated colorimetri assay: assessment of chemosensitivity. Cancer Res, 1987;47:936-942
收稿日期 1999-01-24, http://www.100md.com