乙型肝炎病毒血清学标志物与DNA检测结果的对比分析
作者：王平忠 周永兴
单位：中国人民解放军第四军医大学唐都医院传染科 陕西省西安市 710038
关键词：乙型肝炎病毒；DNA病毒；聚合酶链反应；酶联免疫吸附试验
世界华人消化杂志991047 中国图书馆分类号 R512.62
Subject headings hepatitis B virus; DNA viral; polymerase chain reaction; enzyme-linked immunosorbentassay
我国为乙型肝炎病毒(HBV)感染高发区. 约有1亿人为乙肝表面抗原携带者. HBV感染后血清学检测组合的标志模式多且复杂. 由于PCR方法的引入，可以直接检测病毒核酸(DNA)[1]，所以对患者体内HBV复制及传染性有了更深刻地认识. 然而，由于基层单位开展PCR检测受到条件限制，仅以血清学检测结果作为实验诊断依据，可能会出现漏检. 因此，将HBV-DNA与血清学标志物(HBV-M)进行对比分析，对临床诊断HBV感染及治疗效果的判断具有重要作用. 我们采用聚合酶链反应(PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA)两种方法，同时检测了356份血清，现将结果报告如下.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 1997-01/1998-11来我科同时检测乙肝HBV血清标志物和DNA的356份血清，其中，男208人，女148人，年龄8岁～61岁. ELISA诊断试剂盒由北京万泰生物药业有限公司提供；HBV-DNA PCR检测试剂由华美生物工程公司提供.
1.2 方法 ELISA及HBV-DNA PCR反应操作及结果判断均严格按试剂盒说明书进行.
2 结果
PCR法检测HBV-DNA与ELISA检测HBV-M的结果如下：①PCR检测HBV-DNA总阳性率；在356份血清中共检出HBV-DNA阳性172份，总阳性率为48.3%. 其中，195份HBsAg(+)血清中，DNA阳性率为77.5%(151/195)；161份HBsAg(-)血清中，DNA阳性率为13.0%(21/161)；HBV-M全阴者中DNA阳性率为7.3%；60份HBsAb(+)血清中，DNA阳性率为13.3%(8/60)；HBeAg(+)，HBeAb(+)，HBcAb(+)标志物中DNA阳性率分别为92.4%(61/66)，71.6%(73/102)，65.4%(159/243). ②356例患者血清ELISA和PCR检测结果见表1. 从表中发现，HBsAg和HBeAg同时阳性，DNA阳性率最高，为92.4%. 这从e系统和DNA两方面提示病毒感染与复制，此种血清模式具有最强的传染性. 而HBsAg(+)、HBeAg(-)的组合中，DNA阳性率为45.8%，表明HBeAg(-)不一定表示血清的传染性弱，PCR检测HBV-DNA对HBeAg(-)者具有重要意义.
, 百拇医药
表1 ELISA和PCR法检测HBV血清标志物的结果
(n，%) HBV-M
血 清 份 数
HBV-DNA
阳性数
%
HBsAg(+) HBeAg(+) HBcAb(+)
66
61
92.4
HBsAg(+) HBeAb(+) HBcAb(+)
, 百拇医药
81
68
84.0
HBsAg(+) HBeAg(-) HBcAb(+)/(-)
48〔HBcAb(-)4例〕
22〔HBcAb(-)时，DNA(+)3例〕
45.8
HBsAb(+)
24
2
8.3
HBsAb(+) HBcAb(+)
, 百拇医药
19
4
21.0
HBsAb(+)/(-) HBeAb(+) HBcAb(+)/(-)
21〔HBsAb(-)，4例，HBcAb(-)
5〔HBsAb(-)时，DNA(+)3例,23.8
3例，未出现同时(-)〕
〔HBcAb(-)时，DNA(+)2例〕
HBcAb(+)
15
4
, 百拇医药
26.7
HBV-M全阴
82
6
7.3
合计
356
172
48.3
3 讨论
采用PCR技术对356份血清的HBV不同血清学标志及不同组合进行HBV-DNA检测，结果显示在195份HBsAg(+)血清中，HBV-DNA(+)151例，占77.5%，HBeAg(+)66例中，HBV-DNA(+)61例，阳性率为92.4%，说明用PCR方法检测，绝大多数HBsAg(+)或HBeAg(+)血清中均有HBV-DNA存在. 另有44例HBsAg(+)和5例HBeAg(+)血清中显示HBV-DNA(-)，这可能是HBV-DNA整合于宿主细胞基因组[2]，或基因变异，所用PCR引物不匹配，未能检出，但仍可表达HBsAg. 通常认为HBsAb(+)提示病程进入恢复期，无传染性，但本文结果表明，单项HBsAb(+)者24例，PCR检出2例HBV-DNA(+)，阳性率为8.3%，说明血液中HBsAg向HBsAb转换后，仍有部分患者存在HBV-DNA复制. 此种情况虽然占恢复期乙肝的少数，但仍应引起医生和患者的重视. 其原因可能与HBV亚型的双重感染或病毒自然发生免疫逃避突变有关[3]. HBeAg向HBeAb的转换被认为是肝细胞中活跃复制病毒的清除期，本实验检测HBeAb(+)102例中有61例HBV-DNA(+)，阳性率为71.6%，这可能是HBV C区基因变异，HBeAg不能表达，而HBV-DNA不断复制的结果[4].
, 百拇医药
Zhang et al[5]用定量PCR技术检测慢性乙肝患者血清HBV-DNA含量表明：HBeAb出现并不能表示HBV复制的停止，而只是复制水平的降低. 因此，对HBeAb阳性，DNA也阳性者要慎重对待. HBcAb单项阳性15例中有4例HBV-DNA阳性，阳性率为26%；HBsAb，HBcAb同时阳性者19例，有4例HBV-DNA阳性，阳性率为21%. 说明这部分HBcAb(+)患者仍带毒，其原因可能是HBV感染者HBsAg已消失，也可能是病毒滴度低，ELISA不能检出，而PCR方法灵敏度高，可检出HBV-DNA的存在. 因此，“HBeAb出现，HBeAg转阴，伴随HBsAb出现，即表明患者恢复”这一观点也有例外.
乙肝五项标志物全部阴性者82例，PCR方法检出6例DNA(+)，阳性率为7.3%，这是由于HBV-DNA的出现早于其他血清学指标[6]，受检者可能处于感染早期. 6例HBV-DNA(+)受检者中，2例ALT增高，另4例在1mo～2mo内复查，有2例HBsAg(+). 因此PCR的高灵敏度可为早期诊断HBV感染提供依据. 在临床上对HBV-M均阴性者，宜进一步进行PCR检测HBV-DNA，以确定有无HBV感染，进而，对献血者或血制品或从事幼教及饮食业者须在检测HBV-M的基础上，用PCR法检测HBV-DNA，方可确认有无传染乙肝的可能.
, 百拇医药
本实验结果显示，多种血清学标志模式都有一定的HBV-DNA检出率，DNA(+)表示HBV在体内复制. 许多资料表明，只要有HBV-DNA就可以引起HBV感染[7，8]，这不仅有诊断意义，而且也有流行病学意义. HBV复制时，DNA可出现于肝细胞和血清中，此外，目前国内HBsAg检测试剂盒主要是针对adr亚型，供应我国的Abbott试剂盒也主要用于检测adr和adw亚型. 因此，一些亚型可能被漏检. 那么，仅以HBV-M的检测结果作为判断HBV感染及传染性、治疗效果的指标以及HBV是否在体内复制，有一定的局限性. 只有检测HBV-DNA的存在，才能确证HBV感染后在体内的复制并追踪预后，目前认为HBV-DNA是乙肝传染性的特异性标志，故对HBV-DNA的检测具有重要的临床价值.
通讯作者：王平忠
参考文献
1 Kaneko S, Feinstone SM, Miller RH. Rapid and sensitive method for the detection of serum hepatitis B virus DNA using the polymerase chain reaction technique. J Clin Microbiol, 1989;27:1930-1935
, 百拇医药
2 Pontisso P. Detection of hepatitis B virus DNA in mononuclear blood cell. Br Med J, 1984;288:1563-1567
3 Fan JS, Zhuang H, Li YG, Zhu XJ, Xu DZ, Ma WM, Wang YM, Cheng YJ, Lou GQ, Ma TX. Serotyping and genotyping of hepatitis B virus among HBsAg positive and negative hepatitis B patients in 8 cities of China. Zhonghua Weishengwu He MianyixueZazhi, 1998;18:88-91
4 Wang AL, Zhou YX, Yao ZQ. Gene variation in the pre-C region of hepatitis B virus. Zhonghua Yixue Zazhi, 1994;74:144-146
, http://www.100md.com
5 Zhang FC, Wu WF, Dong HQ, Cai XL, Wei SJ, Xi C. Detection of serum HBV-DNA by quantitative PCR and its clinical application. Zhonghua Chuanranbing Zazhi, 1997;15:24-27
6 Krogsgaard K, Imao M, Ishikawa S, Ohto M. Delta infection and hepatitis B virus replication in Danish patients with fulminant hepatitis B. Scand J Infec Dis, 1988;20:127-132
7 Bond WW, Heritage ID, Fcores GH. Inactivation of hepatitis B virus by intermediate to high level disinfectant chemicals. J Clin Microbiol, 1983;18:535-539
8 Kobayashi H, Suzuki T, Kinoshita N, Sodeyama Y. Susceptibility of hepatitis B virus to disintectants or heat. J Clin Microbiol, 1984;20:214-217
收稿日期 1999-05-25, http://www.100md.com
单位：中国人民解放军第四军医大学唐都医院传染科 陕西省西安市 710038
关键词：乙型肝炎病毒；DNA病毒；聚合酶链反应；酶联免疫吸附试验
世界华人消化杂志991047 中国图书馆分类号 R512.62
Subject headings hepatitis B virus; DNA viral; polymerase chain reaction; enzyme-linked immunosorbentassay
我国为乙型肝炎病毒(HBV)感染高发区. 约有1亿人为乙肝表面抗原携带者. HBV感染后血清学检测组合的标志模式多且复杂. 由于PCR方法的引入，可以直接检测病毒核酸(DNA)[1]，所以对患者体内HBV复制及传染性有了更深刻地认识. 然而，由于基层单位开展PCR检测受到条件限制，仅以血清学检测结果作为实验诊断依据，可能会出现漏检. 因此，将HBV-DNA与血清学标志物(HBV-M)进行对比分析，对临床诊断HBV感染及治疗效果的判断具有重要作用. 我们采用聚合酶链反应(PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA)两种方法，同时检测了356份血清，现将结果报告如下.
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1 材料和方法
1.1 材料 1997-01/1998-11来我科同时检测乙肝HBV血清标志物和DNA的356份血清，其中，男208人，女148人，年龄8岁～61岁. ELISA诊断试剂盒由北京万泰生物药业有限公司提供；HBV-DNA PCR检测试剂由华美生物工程公司提供.
1.2 方法 ELISA及HBV-DNA PCR反应操作及结果判断均严格按试剂盒说明书进行.
2 结果
PCR法检测HBV-DNA与ELISA检测HBV-M的结果如下：①PCR检测HBV-DNA总阳性率；在356份血清中共检出HBV-DNA阳性172份，总阳性率为48.3%. 其中，195份HBsAg(+)血清中，DNA阳性率为77.5%(151/195)；161份HBsAg(-)血清中，DNA阳性率为13.0%(21/161)；HBV-M全阴者中DNA阳性率为7.3%；60份HBsAb(+)血清中，DNA阳性率为13.3%(8/60)；HBeAg(+)，HBeAb(+)，HBcAb(+)标志物中DNA阳性率分别为92.4%(61/66)，71.6%(73/102)，65.4%(159/243). ②356例患者血清ELISA和PCR检测结果见表1. 从表中发现，HBsAg和HBeAg同时阳性，DNA阳性率最高，为92.4%. 这从e系统和DNA两方面提示病毒感染与复制，此种血清模式具有最强的传染性. 而HBsAg(+)、HBeAg(-)的组合中，DNA阳性率为45.8%，表明HBeAg(-)不一定表示血清的传染性弱，PCR检测HBV-DNA对HBeAg(-)者具有重要意义.
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表1 ELISA和PCR法检测HBV血清标志物的结果
(n，%) HBV-M
血 清 份 数
HBV-DNA
阳性数
%
HBsAg(+) HBeAg(+) HBcAb(+)
66
61
92.4
HBsAg(+) HBeAb(+) HBcAb(+)
, 百拇医药
81
68
84.0
HBsAg(+) HBeAg(-) HBcAb(+)/(-)
48〔HBcAb(-)4例〕
22〔HBcAb(-)时，DNA(+)3例〕
45.8
HBsAb(+)
24
2
8.3
HBsAb(+) HBcAb(+)
, 百拇医药
19
4
21.0
HBsAb(+)/(-) HBeAb(+) HBcAb(+)/(-)
21〔HBsAb(-)，4例，HBcAb(-)
5〔HBsAb(-)时，DNA(+)3例,23.8
3例，未出现同时(-)〕
〔HBcAb(-)时，DNA(+)2例〕
HBcAb(+)
15
4
, 百拇医药
26.7
HBV-M全阴
82
6
7.3
合计
356
172
48.3
3 讨论
采用PCR技术对356份血清的HBV不同血清学标志及不同组合进行HBV-DNA检测，结果显示在195份HBsAg(+)血清中，HBV-DNA(+)151例，占77.5%，HBeAg(+)66例中，HBV-DNA(+)61例，阳性率为92.4%，说明用PCR方法检测，绝大多数HBsAg(+)或HBeAg(+)血清中均有HBV-DNA存在. 另有44例HBsAg(+)和5例HBeAg(+)血清中显示HBV-DNA(-)，这可能是HBV-DNA整合于宿主细胞基因组[2]，或基因变异，所用PCR引物不匹配，未能检出，但仍可表达HBsAg. 通常认为HBsAb(+)提示病程进入恢复期，无传染性，但本文结果表明，单项HBsAb(+)者24例，PCR检出2例HBV-DNA(+)，阳性率为8.3%，说明血液中HBsAg向HBsAb转换后，仍有部分患者存在HBV-DNA复制. 此种情况虽然占恢复期乙肝的少数，但仍应引起医生和患者的重视. 其原因可能与HBV亚型的双重感染或病毒自然发生免疫逃避突变有关[3]. HBeAg向HBeAb的转换被认为是肝细胞中活跃复制病毒的清除期，本实验检测HBeAb(+)102例中有61例HBV-DNA(+)，阳性率为71.6%，这可能是HBV C区基因变异，HBeAg不能表达，而HBV-DNA不断复制的结果[4].
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Zhang et al[5]用定量PCR技术检测慢性乙肝患者血清HBV-DNA含量表明：HBeAb出现并不能表示HBV复制的停止，而只是复制水平的降低. 因此，对HBeAb阳性，DNA也阳性者要慎重对待. HBcAb单项阳性15例中有4例HBV-DNA阳性，阳性率为26%；HBsAb，HBcAb同时阳性者19例，有4例HBV-DNA阳性，阳性率为21%. 说明这部分HBcAb(+)患者仍带毒，其原因可能是HBV感染者HBsAg已消失，也可能是病毒滴度低，ELISA不能检出，而PCR方法灵敏度高，可检出HBV-DNA的存在. 因此，“HBeAb出现，HBeAg转阴，伴随HBsAb出现，即表明患者恢复”这一观点也有例外.
乙肝五项标志物全部阴性者82例，PCR方法检出6例DNA(+)，阳性率为7.3%，这是由于HBV-DNA的出现早于其他血清学指标[6]，受检者可能处于感染早期. 6例HBV-DNA(+)受检者中，2例ALT增高，另4例在1mo～2mo内复查，有2例HBsAg(+). 因此PCR的高灵敏度可为早期诊断HBV感染提供依据. 在临床上对HBV-M均阴性者，宜进一步进行PCR检测HBV-DNA，以确定有无HBV感染，进而，对献血者或血制品或从事幼教及饮食业者须在检测HBV-M的基础上，用PCR法检测HBV-DNA，方可确认有无传染乙肝的可能.
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本实验结果显示，多种血清学标志模式都有一定的HBV-DNA检出率，DNA(+)表示HBV在体内复制. 许多资料表明，只要有HBV-DNA就可以引起HBV感染[7，8]，这不仅有诊断意义，而且也有流行病学意义. HBV复制时，DNA可出现于肝细胞和血清中，此外，目前国内HBsAg检测试剂盒主要是针对adr亚型，供应我国的Abbott试剂盒也主要用于检测adr和adw亚型. 因此，一些亚型可能被漏检. 那么，仅以HBV-M的检测结果作为判断HBV感染及传染性、治疗效果的指标以及HBV是否在体内复制，有一定的局限性. 只有检测HBV-DNA的存在，才能确证HBV感染后在体内的复制并追踪预后，目前认为HBV-DNA是乙肝传染性的特异性标志，故对HBV-DNA的检测具有重要的临床价值.
通讯作者：王平忠
参考文献
1 Kaneko S, Feinstone SM, Miller RH. Rapid and sensitive method for the detection of serum hepatitis B virus DNA using the polymerase chain reaction technique. J Clin Microbiol, 1989;27:1930-1935
, 百拇医药
2 Pontisso P. Detection of hepatitis B virus DNA in mononuclear blood cell. Br Med J, 1984;288:1563-1567
3 Fan JS, Zhuang H, Li YG, Zhu XJ, Xu DZ, Ma WM, Wang YM, Cheng YJ, Lou GQ, Ma TX. Serotyping and genotyping of hepatitis B virus among HBsAg positive and negative hepatitis B patients in 8 cities of China. Zhonghua Weishengwu He MianyixueZazhi, 1998;18:88-91
4 Wang AL, Zhou YX, Yao ZQ. Gene variation in the pre-C region of hepatitis B virus. Zhonghua Yixue Zazhi, 1994;74:144-146
, http://www.100md.com
5 Zhang FC, Wu WF, Dong HQ, Cai XL, Wei SJ, Xi C. Detection of serum HBV-DNA by quantitative PCR and its clinical application. Zhonghua Chuanranbing Zazhi, 1997;15:24-27
6 Krogsgaard K, Imao M, Ishikawa S, Ohto M. Delta infection and hepatitis B virus replication in Danish patients with fulminant hepatitis B. Scand J Infec Dis, 1988;20:127-132
7 Bond WW, Heritage ID, Fcores GH. Inactivation of hepatitis B virus by intermediate to high level disinfectant chemicals. J Clin Microbiol, 1983;18:535-539
8 Kobayashi H, Suzuki T, Kinoshita N, Sodeyama Y. Susceptibility of hepatitis B virus to disintectants or heat. J Clin Microbiol, 1984;20:214-217
收稿日期 1999-05-25, http://www.100md.com