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编号:10236979
PCR-ELISA法检测消化道恶性肿瘤端粒酶活性
http://www.100md.com 《广东医学》 1999年第10期
     作者:赵家明 叶锋 王旭光 关惠军

    单位:赵家明 叶锋 王旭光 广东医学院附属医院中心实验室 关惠军 手术室(524001)

    关键词:端粒酶;消化道肿瘤;聚合酶链反应;酶联免疫吸附测定

    广东医学991016 【摘要】 目的 探讨端粒酶在各种消化道恶性肿瘤中的活性表达情况。方法 利用非放射性的PCR-ELISA反应试剂盒检测76例消化道恶性肿瘤(包括食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌)及10例患者的正常及癌旁组织的端粒酶活性。结果 经过一次PCR-ELISA反应,76例恶性肿瘤中31例呈阳性,正常及癌旁组织均阴性;对一次PCR反应呈阴性的肿瘤组织23例、正常及癌旁组织各10例的PCR产物再次进行PCR-ELISA检测,发现前者有17例反应为强阳性,后两者中仅2例癌旁组织呈强阳性,其余全为阴性;没有发现不同消化道恶性肿瘤之间、不同分化程度之间、不同组织类型之间及不同性别之间端粒酶活性有显著差异。结论 非放射性的PCR-ELISA法检测肿瘤组织端粒酶活性敏感性较低,原因在于肿瘤中存在着PCR反应抑制剂,利用两次PCR可以提高端粒酶活性检出率。
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    端粒酶是合成染色体端粒DNA的一种特殊反转录酶,其活性与肿瘤的恶性密切相关。在大多数恶性肿瘤中端粒酶活性呈阳性,而大多数正常、癌旁及良性组织中端粒酶活性呈阴性[1,2]。端粒酶活性是迄今发现的最显著的肿瘤恶性标志,通过端粒酶进行肿瘤的诊断、治疗、预后判断是端粒酶研究的重要目的之一。在恶性肿瘤中消化道肿瘤居第一位,但在不同地区,不同的消化道恶性肿瘤的发病情况并不相同。本文利用非放射性标记的PCR-ELISA方法[3],检测几种主要恶性消化道肿瘤的端粒酶活性,探讨利用端粒酶活性进行癌症诊断治疗的前景。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂 76例消化道恶性肿瘤标本(包括17例食管癌、33例胃癌、10例结肠癌、16例直肠癌)及癌旁与正常组织取自本院手术室,先在液氮中速冻,然后转入-80℃中保存备用。所有标本都经病理证实。端粒酶活性测定采用PCR-ELISA法,试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。
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    1.2 端粒酶活性测定 将冰冻组织制成约12 μm厚的切片,取50片收集于离心管中,加入200 μL裂解液充分混匀,冰浴30 min,16 000 r/min离心20 min,收集上清。取裂解上清3 μL,PCR反应混合液25 μL,DEPC处理的水22 μL于PCR反应管中充分混匀,加入石蜡油后置于PCR仪进行反应。首先在25℃孵育30 min,经94℃灭活5 min进入PCR循环:94℃ 30 s,50℃30 s,72℃90 s,32个循环,72℃延伸10 min后终止反应。阳性对照为239细胞株裂解上清,阴性对照为经70℃10 min灭活的293细胞株裂解上清。取5 μL PCR反应产物加20 μL变性液室温放置10 min,然后加入225 μL杂交液混匀,吸取100 μL加入到亲和素包被的反应孔中,于37℃ 300 r/min振荡2 h,弃去液体用洗液洗3次,加100 μL过氧化物酶标记的抗地高辛抗体于37℃ 300 r/min反应30 min,弃去液体,以洗液洗5次,加入100 μL四甲基联苯胺显色液室温20 min,加入100 μL终止液终止反应,于30 min内用酶标仪测定450 nm处的吸光度值(对照波长为655 nm)。以二者之差ΔΑ(A450-A655)来判断端粒酶活性是否阳性。
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    1.3 统计学分析 采用χ2检验和四格表确切概率法进行统计学分析。

    2 结果

    2.1 一次PCR后各种组织端粒酶活性检测情况 在一次PCR-ELISA反应后,76例消化道恶性肿瘤端粒酶活性阳性率分别为:食管癌8/17(47.0%),胃癌13/33(39.4%),结肠癌5/10(50.0%),直肠癌5/16(31.2%)。男女阳性率分别为:男20/53(37.7%),女性11/23(47.8%)。从组织学角度看:17例食管癌全为鳞状上皮癌(阳性率47.0%),其他59例均为腺状上皮癌(阳性率39.0%)。从分化程度看,高分化13/30(43.3%),中分化8/21(38.1),低分化7/17(41.2%),粘液印戒2/6(33.3%)。总的阳性率为40.8%(31/76)。10例正常组织及10例癌旁组织均未检测出端粒酶活性。恶性肿瘤分别与正常组织和癌旁组织之间端粒酶活性检出率差异有显著意义(P<0.05),而恶性肿瘤各组之间端粒酶活性检出率差异无显著意义(P>0.05)。与文献报道(用Kim的TRAP法)[2]相比,本实验用PCR-ELISA法检测端粒酶活性的阳性检出率明显偏低。
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    2.2 二次PCR后各种组织端粒酶活性检测情况 由于上述一次PCR-ELISA阳性率较低,所以对未检测出端粒酶活性的组织抽样做了第2次PCR扩增(将第1次PCR的反应产物稀释1 000倍,从中吸取3 μL和25 μL PCR反应混合液(即试剂盒中溶液2)、22 μL DEPC处理的水混合,反应条件与第1次PCR相比,少了第1步25℃ 30 min,其他全同),其中23例恶性肿瘤中有17例ELISA反应呈强阳性,6例仍为阴性。10例正常组织、8例癌旁组 织及阴性对照呈阴性,两例癌旁组织ELISA反应呈强性。由于担心第2次PCR出现假阳性,我们多次对阴性对照和加热灭活的端粒酶阳性恶性肿瘤进行两次PCR,结果均呈阴性。说明第2次PCR-ELISA反应阳性是由于本身端粒酶活性所引起。综合两次PCR结果,76例恶性肿瘤总的PCR-ELISA反应阳性率约为80%,与文献报道的端粒酶活性阳性率一致[2]

    3 讨论

    虽然人们普遍认为端粒酶活性与肿瘤恶性程度相关,但相关程度如何,不同研究者得出的结论差别很大。本文研究消化道各部位恶性肿瘤的端粒酶活性,但从结果看不出各部位恶性肿瘤之间、不同分化程度和组织类型之间以及不同性别之间有显著差异。
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    现在测定端粒酶活性的方法主要分TRAP法和非TRAP法两大类。两者都包括端粒酶合成反应和反应产物的检测,但前者中间增加了PCR扩增反应。TRAP法根据对反应物的检测方法不同,又可分为放射自显影法、荧光法[4]、ELISA法[3]等。与非TRAP法相比,TRAP法灵敏度高,但往往出现假阴性,原因在于样品中可能存在PCR抑制物。这在本实验中可得到验证。本实验一次PCR-ELISA阳性率较低,但对部分一次PCR阴性样品进行第2次PCR后,绝大多数ELISA反应呈阳性。为了探究该现象的原因,我们分别将:(a)一次PCR呈阳性,(b)第1次PCR呈阴性且第2次PCR呈阳性,(c)两次PCR均阴性的样品的原组织裂解液与阳性对照的PCR产物混合,再次进行PCR-ELISA反应,结果:(a)为阳性,(b)为阴性,(c)中有阴性有阳性。上述结果表明,在(b)样品及(c)中出现阴性结果的样品中存在PCR反应抑制物。但是这种抑制物并不完全抑制PCR,只是使PCR反应效率降低,所以当样品存在端粒酶活性时,一次PCR的反应液中仍然存在大量PCR反应产物,只是ELISA反应检测不出来。当将该反应液稀释后进行第2次PCR,反应产物检测出强阳性。
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    研究端粒酶的重要目的之一是通过检测端粒酶活性进行肿瘤的早期诊断,但现在离实现该愿望还为时过早。首先其检测灵敏度需要进一步提高;其次,现在没有很好的组织取样方法,不能有效通过人群普查来早期发现恶性肿瘤;其三,大量文献报道,很多正常组织也存在较低的端粒酶活性,而不少恶性肿瘤却测不出端粒酶活性,这为肿瘤诊断带来了复杂性。但是展望未来,端粒酶在这方面的应用还是很有前景的。

    4 参考文献

    1 Rhyu MS. Telomeres, telomerse, and immortality. J Natl Cancer Inst, 1997, 87:884

    2 Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, 266:2011

    3 Wada Y, Yagihashi A, Kameshima H, et al. Nonradioisotopic telomeric repeat amplification protocol (TRAP) using digoxigenin labeled probe. Immunopharmacol Immunotoxicol, 1997, 19:451

    4 Aldous WK, Grabill NR. A fluorescent method for detection of telomerase activity. Diagn Mol Pathol, 1997, 6:102, 百拇医药