原发性肝癌中Bax及c-myc蛋白表达与凋亡指数的关系
作者：徐洪雨 毕莉 宋光 关希丽 梅唤林
单位：宋光 徐洪雨 哈尔滨医科大学第一临床医学院消化内科，150001 毕莉 检验科 关希丽 梅唤林 病理科
关键词：肝细胞癌；凋亡；凋亡调控蛋白
中国急救医学991007 摘要 目的 检测Bcl-2、Bax及c-myc在肝细胞癌中的表达，探讨肝细胞癌中二者表达与凋亡指数的关系。方法 对22例人肝细胞癌及癌旁组织分别进行Bax及c-myc的免疫组织化学研究和TUNEL技术标记，计数阳性细胞数。结果 在肝细胞癌中Bax蛋白呈低表达，表达率为45.45%，与癌旁组织相比有显著差异(P<0.01)；c-myc在肝细胞癌及癌旁组织中均呈高表达，表达率分别为81.82%和72.73%，但二者无差异(P>0.05)；肝癌组织中凋亡指数为9.55%，低于癌旁组织15.68%，二者有显著差异(P<0.01)。结论 肝细胞癌的发生与细胞凋亡受到抑制有关，Bax起到更关键的作用；Bcl-2/Bax异二聚体能更准确地反映凋亡发生的程度；凋亡指数有可能成为判定细胞癌变的指标。
, 百拇医药
中图分类号 R 735.7；Q 255；Q 786 文献标识码 A 文章编号 1002-1949(1999)10-595-02
Relationship between Bax and c-myc and apoptosis index in human hepatocellular carcinoma
XU Hong-yu,BI LI,SONG Guang,et al.The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Digestion Department,Harbin,Heilongjiang,150001，China
Abstract Objective To investigate the expression of Bax and c-myc in human hepatoellular carcinoma and paracancerous tissues.To evaluate the relationship between Bax and c-myc apoptosis index in human hepatocellular carcinoma.Method We observed the expression of Bax,c-myc and apoptosis index using immunohistochemical staining and terminal deoxynuleotidyl transferase nick and labelling technique in 22 human hepatocellular carcinoma and paracancerous tissues.Result The rate of Bax protein positive expression in hepatocellular carinoma was 45.45% and it was 77.27% in paracancerous tissues.This was statisticant as compared with each other (P<0.01) The rate of c-myc protein expression in hepatocellular carcinoma was higher than that in paracancerous tissues,being 81.82% and 72.73%,respectively.But no difference was found.The apoptosis index in hepatocellular carcinoma was 9.55% and was lower than that in paracancerous tissues(P<0.01).Conclusions There were relationship between the occurrence of hepatocellular carcinoma and the apotosis.Bcl-2/Bax could reflect the degree of apoptosis accurately.Bax protein play an important role in the occurence of hepatocellular carcinoma.The apoptosis index would become an croial value to evaluate malignancy change of cells.
, 百拇医药
Key words Hepatocellular carcinoma； Apoptosis； Apoptosis index
研究表明，程序性细胞死亡(细胞凋亡)信号传递系统的紊乱在肿瘤形成的过程中起重要作用，而且细胞凋亡受相关基因调控[1]。Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated Xprotein,Bax)可与抗凋亡蛋白Bcl-2形成异源二聚体，具有抑制Bcl-2，促进细胞凋亡的作用，是细胞凋亡的重要调控基因。而对于c-myc作用目前一致的结论是它既能促进细胞的增殖反应，也能诱导细胞的凋亡。已有学者研究肝细胞癌中Bcl-2及c-myc的蛋白表达[2～5]，但有关肝细胞癌中Bax及c-myc与凋亡指数的关系的研究未见报导。我们采用免疫组织化学方法和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)技术测定肝细胞癌及其相应的癌旁组织中Bax、c-myc蛋白的表达和原位凋亡细胞的检测，以探讨它们在肝细胞癌中的作用。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 肝细胞癌标本
22例标本均为本院1994～1998年间外科手术切除标本，经病理检查证实为肝细胞癌。其中男17例，女5例，平均年龄50.26岁，术前未经过任何化疗和放疗，每例均带有癌旁组织。标本经福尔马林固定，常规脱水包埋，5 μm连续切片，分别用于常规HE染色和不同的免疫组织化学及原位杂交染色。
1.2 染色方法
1.2.1 免疫组织化学染色 采用ABC法。ABC试剂盒、Bax、c-myc抗体及各阳性对照片均购自武汉博士德生物工程有限公司。染色步骤按产品说明书进行。阴性对照设PBS替代一抗的空白对照和正常兔血清(1∶50)替代一抗的替代对照。
1.2.2 原位细胞凋亡检查 采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法，试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。染色步骤按产品说明书进行。
, http://www.100md.com
1.2.3 观察指标 光学显微镜下观察，Bax、及c-myc蛋白染色呈棕黄色颗粒，位于细胞浆内。TUNEL染色切片亦呈棕黄色颗粒，位于细胞核内。计数5个以上高倍视野，不少于1000个细胞，阳性细胞数以百分数表示，分别作为Bax及c-myc阳性反应细胞密度及凋亡细胞指数。Bax及c-myc蛋白表达强度依照阳性产物着色深浅及阳性细胞数的多少分为4级：(-)无阳性反应细胞，阳性细胞<25%或背景同空白对照；(+)有25%～50%细胞明显阳性，(++)50%～75%的细胞明显阳性；(+++)>75%的细胞明显阳性。相关数据分别用t检验，χ2检验或等级资料秩和检验进行统计学分析。
2 结果
2.1 Bax、c-myc及凋亡指数在肝细胞癌及癌旁组织中的表达
有肝细胞癌中Bax蛋白在肝细胞癌中的表达率及表达强度低于在癌旁组织中的表达率，且P<0.01；c-myc蛋白在肝细胞癌及癌旁组织中的表达率及表达强度均很高，肝癌组织的表达率高于癌旁组织，但P>0.05；凋亡指数在肝细胞癌及癌旁组织中的表达率分别为9.55%和15.68%，有显著差别P<0.01，见表1。
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表1 肝细胞及癌旁组织中Bcl-2，Bax，c-myc及凋亡指数的表达
例数
Bax
c-myc
凋亡指数%
-
+
阳性率%
-
+
阳性率%
肝细胞癌
22
, http://www.100md.com
12
10
45.45*
6
16
81.82
9.55±5.32*
癌旁组织
22
5
17
77.27
4
, http://www.100md.com
18
72.73
15.68±5.83
*与癌旁组织相比P<0.01
2.2 肝细胞癌及癌旁组织中Bax蛋白的表达与凋亡指数的关系
在肝细胞癌及癌旁组织中Bax蛋白表达阳性组凋亡指数均高于Bax蛋白表达阴性组(P<0.01)，见表2。
表2 肝细胞癌及癌旁组织Bax的表达与细胞凋亡的关系
例 数
凋亡指数%
肝细胞癌
, http://www.100md.com
Bax-
12
5.83±1.95*
Bax+
10
14.00±4.59
癌旁组织
Bax-
5
10.00±3.54*
Bax+
17
17.35±5.62
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*与Bax阳性组比较P<0.01
2.3 肝细胞癌的分化程度与Bax、c-myc蛋白表达的关系
肝细胞癌高、中、低分化与Bax、c-myc的表达无显著差异(P>0.05)，见表3。
表3 原发性肝癌各级分化中Bax及c-myc蛋白的表达
c-myc
Bax
+
阳性率
+
阳性率
高分化
, http://www.100md.com
6
33.33*
3
30.00*
中分化
5
27.78*
3
30.00*
低分化
7
38.89*
4
, http://www.100md.com
40.00*
*各组相比较P>0.05
3 讨论
恶性肿瘤的发生不仅与肿瘤细胞的增殖有关，而且与其细胞凋亡的减少有密切关系。细胞凋亡受相关基因的调控。目前，将细胞凋亡的相关基因分成生存基因和死亡基因两大类。生存基因又分为促进细胞增殖的基因如c-myc和促进细胞存活的基因如Bcl-2。死亡基因也分为细胞增殖的抑制基因如P53和促进细胞死亡基因如Bax。已有研究发现，Bax在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌及胃癌等肿瘤的凋亡调控中发挥重要作用[6，7]。但有关肝细胞癌中Bax表达与凋亡指数的关系的研究未见报导。
我们采用免疫组织化学方法检测了肝癌组织及癌旁组织中Bax及c-myc蛋白的表达，结果发现Bax在肝癌组织中的表达率为45.45%，明显低于癌旁组织的表达率77.72%，由此可推测Bax在肝癌的发生过程中发挥了作用。Bax的低表达使细胞凋亡受到抑制，从而使细胞的增殖和凋亡失衡，导致肿瘤的发生，而且Bax起到了更关键的作用。c-myc在肝癌组织及癌旁组织中的表达无差异，此结果与杨少波的报导相似[2]。我们认为，c-myc在癌旁组织中的过表达仍表现为促进细胞增殖，此癌旁组织可能已处于癌前状态，但由于细胞凋亡调控机制尚完整，因此细胞增殖与死亡的平衡尚未被打破，细胞仍保持正常状态。随着细胞增殖的加强或凋亡调控机制的失衡，此癌旁组织可以癌变。本研究22例肝细胞癌中各分化程度间Bax及c-myc均无显著差异。我们分析有两种可能，第一是病例数所限，不能全面地反映出各级分化间的差别；另一种可能是细胞凋亡的抑制只在肿瘤的发生过程中发挥重要的作用，而对肿瘤的发展影响较小。
, 百拇医药
目前关于细胞凋亡的检测手段有很多，但有学者认为3′-羟基DNA断裂点原位标记法结合了组织化学的方法，定位准确，有利于发现凋亡发生中早期的DNA断裂，可更准确地反映凋亡发生的程度[8]。采用此方法发现癌旁组织的细胞凋亡率为15.68%，明显高于肝癌组织的细胞凋亡率9.55%，Bax蛋白表达阳性或阴性组间，凋亡指数却有显著差异。因此我们推测Bax通过与Bcl-2形成异二聚体来决定具有活性功能的Bcl-2蛋白质分子数，使Bcl-2对细胞凋亡的过程具有不同的甚至是相反的作用。因此，Bcl-2/Bax异二聚体能更确切地反映凋亡发生的程度。在肝癌组织和癌旁组织中凋亡指数有不同的表达，且二者有显著差别，因此，凋亡指数是否可成为判定细胞癌变的指标值得进一步研究。
总之，我们的研究认为，肝细胞癌的发生与细胞凋亡的抑制有关，Bcl-2/Bax异二聚体能更准确地反映凋亡发生的程度，凋亡指数是反映细胞凋亡的更准确的指标，有可能成为判定细胞癌变的指标。
, 百拇医药 参考文献
[1]成军.程序性细胞死亡与疾病[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997.40-45.
[2]杨少波.人肝细胞癌c-myc和P53基因的过度表达[J].中华肿瘤杂志，1995，17：415.
[3]郎振为.病毒性肝炎患者肝组织中Bcl-2蛋白的表达[J].中华肝脏病杂志，1998，6：128.
[4]Charlotte F,L， Hermine A,Martin N,et al.Immuno histo chemical detection of bcl-2 protein in normal and pathological human liver[J].Am J Pathol,1994,144:460-465.
[5]Evan GI,Lewis GK,Ramsay G,et al.Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product[J].Mol Cell Biol,1985,5:3610.
[6]邹高德.肾细胞癌抗凋亡基因Bcl-2的免疫组化研究[J].中华泌尿外科杂志，1997，18：329.
[7]刘海峰.胃癌和癌旁组织中Bax蛋白表达及其与细胞凋亡的关系[J].中华消化杂志，1998，18：325.
[8]郭玉庆.细胞凋亡的检测方法[J].国外医学内科学分册，1997，24(4)：145.
收稿：1998-10-17
修回：1999-03-10, http://www.100md.com
单位：宋光 徐洪雨 哈尔滨医科大学第一临床医学院消化内科，150001 毕莉 检验科 关希丽 梅唤林 病理科
关键词：肝细胞癌；凋亡；凋亡调控蛋白
中国急救医学991007 摘要 目的 检测Bcl-2、Bax及c-myc在肝细胞癌中的表达，探讨肝细胞癌中二者表达与凋亡指数的关系。方法 对22例人肝细胞癌及癌旁组织分别进行Bax及c-myc的免疫组织化学研究和TUNEL技术标记，计数阳性细胞数。结果 在肝细胞癌中Bax蛋白呈低表达，表达率为45.45%，与癌旁组织相比有显著差异(P<0.01)；c-myc在肝细胞癌及癌旁组织中均呈高表达，表达率分别为81.82%和72.73%，但二者无差异(P>0.05)；肝癌组织中凋亡指数为9.55%，低于癌旁组织15.68%，二者有显著差异(P<0.01)。结论 肝细胞癌的发生与细胞凋亡受到抑制有关，Bax起到更关键的作用；Bcl-2/Bax异二聚体能更准确地反映凋亡发生的程度；凋亡指数有可能成为判定细胞癌变的指标。
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中图分类号 R 735.7；Q 255；Q 786 文献标识码 A 文章编号 1002-1949(1999)10-595-02
Relationship between Bax and c-myc and apoptosis index in human hepatocellular carcinoma
XU Hong-yu,BI LI,SONG Guang,et al.The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Digestion Department,Harbin,Heilongjiang,150001，China
Abstract Objective To investigate the expression of Bax and c-myc in human hepatoellular carcinoma and paracancerous tissues.To evaluate the relationship between Bax and c-myc apoptosis index in human hepatocellular carcinoma.Method We observed the expression of Bax,c-myc and apoptosis index using immunohistochemical staining and terminal deoxynuleotidyl transferase nick and labelling technique in 22 human hepatocellular carcinoma and paracancerous tissues.Result The rate of Bax protein positive expression in hepatocellular carinoma was 45.45% and it was 77.27% in paracancerous tissues.This was statisticant as compared with each other (P<0.01) The rate of c-myc protein expression in hepatocellular carcinoma was higher than that in paracancerous tissues,being 81.82% and 72.73%,respectively.But no difference was found.The apoptosis index in hepatocellular carcinoma was 9.55% and was lower than that in paracancerous tissues(P<0.01).Conclusions There were relationship between the occurrence of hepatocellular carcinoma and the apotosis.Bcl-2/Bax could reflect the degree of apoptosis accurately.Bax protein play an important role in the occurence of hepatocellular carcinoma.The apoptosis index would become an croial value to evaluate malignancy change of cells.
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Key words Hepatocellular carcinoma； Apoptosis； Apoptosis index
研究表明，程序性细胞死亡(细胞凋亡)信号传递系统的紊乱在肿瘤形成的过程中起重要作用，而且细胞凋亡受相关基因调控[1]。Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated Xprotein,Bax)可与抗凋亡蛋白Bcl-2形成异源二聚体，具有抑制Bcl-2，促进细胞凋亡的作用，是细胞凋亡的重要调控基因。而对于c-myc作用目前一致的结论是它既能促进细胞的增殖反应，也能诱导细胞的凋亡。已有学者研究肝细胞癌中Bcl-2及c-myc的蛋白表达[2～5]，但有关肝细胞癌中Bax及c-myc与凋亡指数的关系的研究未见报导。我们采用免疫组织化学方法和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)技术测定肝细胞癌及其相应的癌旁组织中Bax、c-myc蛋白的表达和原位凋亡细胞的检测，以探讨它们在肝细胞癌中的作用。
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1 资料与方法
1.1 肝细胞癌标本
22例标本均为本院1994～1998年间外科手术切除标本，经病理检查证实为肝细胞癌。其中男17例，女5例，平均年龄50.26岁，术前未经过任何化疗和放疗，每例均带有癌旁组织。标本经福尔马林固定，常规脱水包埋，5 μm连续切片，分别用于常规HE染色和不同的免疫组织化学及原位杂交染色。
1.2 染色方法
1.2.1 免疫组织化学染色 采用ABC法。ABC试剂盒、Bax、c-myc抗体及各阳性对照片均购自武汉博士德生物工程有限公司。染色步骤按产品说明书进行。阴性对照设PBS替代一抗的空白对照和正常兔血清(1∶50)替代一抗的替代对照。
1.2.2 原位细胞凋亡检查 采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法，试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。染色步骤按产品说明书进行。
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1.2.3 观察指标 光学显微镜下观察，Bax、及c-myc蛋白染色呈棕黄色颗粒，位于细胞浆内。TUNEL染色切片亦呈棕黄色颗粒，位于细胞核内。计数5个以上高倍视野，不少于1000个细胞，阳性细胞数以百分数表示，分别作为Bax及c-myc阳性反应细胞密度及凋亡细胞指数。Bax及c-myc蛋白表达强度依照阳性产物着色深浅及阳性细胞数的多少分为4级：(-)无阳性反应细胞，阳性细胞<25%或背景同空白对照；(+)有25%～50%细胞明显阳性，(++)50%～75%的细胞明显阳性；(+++)>75%的细胞明显阳性。相关数据分别用t检验，χ2检验或等级资料秩和检验进行统计学分析。
2 结果
2.1 Bax、c-myc及凋亡指数在肝细胞癌及癌旁组织中的表达
有肝细胞癌中Bax蛋白在肝细胞癌中的表达率及表达强度低于在癌旁组织中的表达率，且P<0.01；c-myc蛋白在肝细胞癌及癌旁组织中的表达率及表达强度均很高，肝癌组织的表达率高于癌旁组织，但P>0.05；凋亡指数在肝细胞癌及癌旁组织中的表达率分别为9.55%和15.68%，有显著差别P<0.01，见表1。
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表1 肝细胞及癌旁组织中Bcl-2，Bax，c-myc及凋亡指数的表达
例数
Bax
c-myc
凋亡指数%
-
+
阳性率%
-
+
阳性率%
肝细胞癌
22
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12
10
45.45*
6
16
81.82
9.55±5.32*
癌旁组织
22
5
17
77.27
4
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18
72.73
15.68±5.83
*与癌旁组织相比P<0.01
2.2 肝细胞癌及癌旁组织中Bax蛋白的表达与凋亡指数的关系
在肝细胞癌及癌旁组织中Bax蛋白表达阳性组凋亡指数均高于Bax蛋白表达阴性组(P<0.01)，见表2。
表2 肝细胞癌及癌旁组织Bax的表达与细胞凋亡的关系
例 数
凋亡指数%
肝细胞癌
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Bax-
12
5.83±1.95*
Bax+
10
14.00±4.59
癌旁组织
Bax-
5
10.00±3.54*
Bax+
17
17.35±5.62
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*与Bax阳性组比较P<0.01
2.3 肝细胞癌的分化程度与Bax、c-myc蛋白表达的关系
肝细胞癌高、中、低分化与Bax、c-myc的表达无显著差异(P>0.05)，见表3。
表3 原发性肝癌各级分化中Bax及c-myc蛋白的表达
c-myc
Bax
+
阳性率
+
阳性率
高分化
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6
33.33*
3
30.00*
中分化
5
27.78*
3
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低分化
7
38.89*
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*各组相比较P>0.05
3 讨论
恶性肿瘤的发生不仅与肿瘤细胞的增殖有关，而且与其细胞凋亡的减少有密切关系。细胞凋亡受相关基因的调控。目前，将细胞凋亡的相关基因分成生存基因和死亡基因两大类。生存基因又分为促进细胞增殖的基因如c-myc和促进细胞存活的基因如Bcl-2。死亡基因也分为细胞增殖的抑制基因如P53和促进细胞死亡基因如Bax。已有研究发现，Bax在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌及胃癌等肿瘤的凋亡调控中发挥重要作用[6，7]。但有关肝细胞癌中Bax表达与凋亡指数的关系的研究未见报导。
我们采用免疫组织化学方法检测了肝癌组织及癌旁组织中Bax及c-myc蛋白的表达，结果发现Bax在肝癌组织中的表达率为45.45%，明显低于癌旁组织的表达率77.72%，由此可推测Bax在肝癌的发生过程中发挥了作用。Bax的低表达使细胞凋亡受到抑制，从而使细胞的增殖和凋亡失衡，导致肿瘤的发生，而且Bax起到了更关键的作用。c-myc在肝癌组织及癌旁组织中的表达无差异，此结果与杨少波的报导相似[2]。我们认为，c-myc在癌旁组织中的过表达仍表现为促进细胞增殖，此癌旁组织可能已处于癌前状态，但由于细胞凋亡调控机制尚完整，因此细胞增殖与死亡的平衡尚未被打破，细胞仍保持正常状态。随着细胞增殖的加强或凋亡调控机制的失衡，此癌旁组织可以癌变。本研究22例肝细胞癌中各分化程度间Bax及c-myc均无显著差异。我们分析有两种可能，第一是病例数所限，不能全面地反映出各级分化间的差别；另一种可能是细胞凋亡的抑制只在肿瘤的发生过程中发挥重要的作用，而对肿瘤的发展影响较小。
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目前关于细胞凋亡的检测手段有很多，但有学者认为3′-羟基DNA断裂点原位标记法结合了组织化学的方法，定位准确，有利于发现凋亡发生中早期的DNA断裂，可更准确地反映凋亡发生的程度[8]。采用此方法发现癌旁组织的细胞凋亡率为15.68%，明显高于肝癌组织的细胞凋亡率9.55%，Bax蛋白表达阳性或阴性组间，凋亡指数却有显著差异。因此我们推测Bax通过与Bcl-2形成异二聚体来决定具有活性功能的Bcl-2蛋白质分子数，使Bcl-2对细胞凋亡的过程具有不同的甚至是相反的作用。因此，Bcl-2/Bax异二聚体能更确切地反映凋亡发生的程度。在肝癌组织和癌旁组织中凋亡指数有不同的表达，且二者有显著差别，因此，凋亡指数是否可成为判定细胞癌变的指标值得进一步研究。
总之，我们的研究认为，肝细胞癌的发生与细胞凋亡的抑制有关，Bcl-2/Bax异二聚体能更准确地反映凋亡发生的程度，凋亡指数是反映细胞凋亡的更准确的指标，有可能成为判定细胞癌变的指标。
, 百拇医药 参考文献
[1]成军.程序性细胞死亡与疾病[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997.40-45.
[2]杨少波.人肝细胞癌c-myc和P53基因的过度表达[J].中华肿瘤杂志，1995，17：415.
[3]郎振为.病毒性肝炎患者肝组织中Bcl-2蛋白的表达[J].中华肝脏病杂志，1998，6：128.
[4]Charlotte F,L， Hermine A,Martin N,et al.Immuno histo chemical detection of bcl-2 protein in normal and pathological human liver[J].Am J Pathol,1994,144:460-465.
[5]Evan GI,Lewis GK,Ramsay G,et al.Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product[J].Mol Cell Biol,1985,5:3610.
[6]邹高德.肾细胞癌抗凋亡基因Bcl-2的免疫组化研究[J].中华泌尿外科杂志，1997，18：329.
[7]刘海峰.胃癌和癌旁组织中Bax蛋白表达及其与细胞凋亡的关系[J].中华消化杂志，1998，18：325.
[8]郭玉庆.细胞凋亡的检测方法[J].国外医学内科学分册，1997，24(4)：145.
收稿：1998-10-17
修回：1999-03-10, http://www.100md.com