川芎嗪和尼莫地平对血管内皮细胞分泌ET和NO的影响
作者：邵国富 张志琳 楚 冰 包仕尧
单位：苏州医学院附属第二医院神经内科邮政编码：215004
关键词：川芎嗪 尼莫地平 内皮细胞 内皮素 一氧化氮
江苏医药991116 摘要 为探讨川芎嗪和尼莫地平在心脑血管疾病防治中的作用机制，我们采用内皮细胞体外培养的方法，观察尼莫地平和川芎嗪对内皮细胞分泌内皮素(ET)和一氧化氮(NO)的影响。实验结果发现，两药均能不同程度地抑制正常体外培养的内皮细胞产生内皮素，改变ET和NO的比例，从而起到防治心脑血管疾病的作用。
血管内皮细胞在心脑血管疾病中的作用越来越受到重视，内皮细胞的功能改变与疾病的发生和发展密切相关。本实验采用内皮细胞体外培养的方法，观察临床广泛应用于心脑血管疾病治疗的药物尼莫地平和川芎嗪对内皮细胞分泌内皮素(ET)和一氧化氮(NO)的影响，探讨两药在心脑血管疾病治疗中的作用机制。
, 百拇医药
材料和方法
一、材料
1.尼莫地平(简称NM)，为德国拜耳(Bayer)公司制造的尼莫通注射液(批号：00519885M-D)，每瓶50ml，含尼莫地平10mg。使用前用细胞培养液稀释成所需实验浓度。
2.盐酸川芎嗪注射液(简称LZ或川芎嗪)，由北京第四制药厂生产(批号960426)，每支2ml，含盐酸川芎嗪40mg。使用前用细胞培养液稀释成所需实验浓度。
3.一氧化氮试剂盒(硝酸还原酶法)，由南京建成生物工程研究所提供。
4.内皮素放射免疫测定药盒，由北京东亚免疫技术研究所提供。
二、方法
1.含药物培养液的配制：分别在RPMI-1640培养液中加入川芎嗪和尼莫地平，配制成含川芎嗪100μg/ml、20μg/ml和含尼莫地平10μg/ml、2μg/ml的含药培养液。
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2.实验分组：根据处理因素的不同，将实验共分成5组。其中1组为正常对照组；2～5组分别在培养液中加入川芎嗪100μg/ml、 20μg/ml和尼莫地平10μg/ml、2μg/ml。每12孔为一实验组。
3.人脐静脉内皮细胞(EC)培养：按Jaffe等的方法稍加改进，获取脐静脉内皮细胞，加入RPMI-1640培养液(其中含20%小牛血清，青霉素105U/L、链霉素105U/L、L-谷氨酰胺2mM)，将pH调至7.2左右，用乳头吸管轻轻吹打均匀后，吸取2ml接种于6孔塑料培养板(Falcon)的每孔中，置5%CO2培养箱中(37℃)培养，每2天换液一次。
4.药物对EC的影响：原代培养细胞将铺满培养孔底时，吸出培养液，经PBS冲洗后，用加样器吸取含有不同浓度药物的培养液2ml加入每孔中。继续培养24小时后，吸出培养液分别用放射免疫方法测定ET含量，用硝酸还原酶法测定NO代谢产物NO-x含量。每孔中加入0.05%胰酶―0.02%EDTA溶液0.5ml，将细胞消化后收集，再加入1.5mlPBS冲洗后以血球计数台计数细胞数。
, http://www.100md.com
5.统计学处理：首先，根据各样本(孔)细胞计数，将所测得的ET和NO-x浓度换算成1×105细胞/ml的含量，其中NO-x再去除各组培养前培养液中的本底含量。然后采用随机分组设计资料的方差分析方法进行统计学处理。
结 果
正常内皮细胞24小时ET分泌量为1226.8±118.5ng/L×105细胞/L，用药各组内皮素分泌量均有不同程度的减少，除LZ/2组外，均有显著差异(P<0.01)(见附表)。尼莫地平作用较川芎嗪为强(P<0.05或P<0.01)。两者均以大剂量组作用为强(P<0.01)。
正常内皮细胞24小时NO-x产生量为33.0±5.9μmol/L。用药各组NO-x含量无显著差异(P>0.05)(见附表)。
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附表 川芎嗪和尼莫地平对内皮细胞分泌ET和NO-x的影响
n
ET含量(ng/L)
NO-x含量(μmol/L)
对照组
12
1226.8±118.5
33.0±5.9
LZ/1
12
1052.2±66.7*
, 百拇医药
34.2±7.2
LZ/2
12
1219.4±94.0
32.6±8.2
NM/1
12
881.5±90.0*
31.0±10.2
NM/2
12
1096.7±95.6*
, 百拇医药
34.2±10.4
与对照组比较*P<0.01
讨 论
ET和NO是近年来发现的器官局部调节因子。血管内皮细胞通过释放ET收缩血管和促进内皮细胞增殖，同时释放NO松驰血管平滑肌和抑制内皮细胞的增殖。正常情况下，ET和NO处于动态平衡状态，维持着血管舒缩功能[1]。两种血管作用物质平衡破坏时便导致血管收缩，产生高血压、动脉硬化等一系列心血管疾病。
本实验结果发现，川芎嗪和尼莫地平能不同程度地抑制正常体外培养内皮细胞产生内皮素，从而改变ET和NO的比例。这对临床心脑血管病的防治具有重要意义。
川芎嗪和尼莫地平在临床血管性疾病的治疗中已取得明显疗效，尤其对缺血性脑血管病，它们能扩张脑血管，增加局部脑血流量，从而改善脑血液循环和能量代谢功能，降低乳酸酸中毒，减少缺血性脑损伤的发生[2～5]。但这些作用的机制尚不清楚。本实验在体外培养的内皮细胞研究中发现，川芎嗪和尼莫地平均能抑制内皮细胞产生ET，从而可使ET和NO的平衡状态得到改善，进而减轻病变血管的收缩或痉挛，增加缺血区的血液供应，改善缺血组织的代谢状态，减轻组织损伤。因而，本实验结果进一步揭示了川芎嗪和尼莫地平的上述临床作用机制，为两药的临床应用提供了可靠的实验和理论依据。临床大剂量应用尼莫地平可引起血压下降、皮肤潮红等血管扩张现象[3]，而川芎嗪的降压作用则较弱[4，5]。这与我们在实验中发现的尼莫地平抑制ET产生的作用较川芎嗪强这一结果相符。因而，本实验结果从细胞水平进一步证明，川芎嗪和尼莫地平在心脑血管的防治中具有良好的应用前景。
, 百拇医药
参考文献
[1] Ehrenreich H，et al.Cleve Clin J Med 1995；62(2)：105.
[2] Fieschi C，et al.J Carolivase Pharmacol 1998；12(Sup-
ple6)：s83.
[3] 王桂红综述.国外医学脑血管疾病分册 1997；5(2)：96.
[4] 邵国富，等.实用诊断与治疗杂志 1992；6(1)：1.
[5] 邵国富，等.中华神经精神科杂志 1992；25(16)：347.
(1999年3月15日收稿 同年5月17日修回), 百拇医药
单位：苏州医学院附属第二医院神经内科邮政编码：215004
关键词：川芎嗪 尼莫地平 内皮细胞 内皮素 一氧化氮
江苏医药991116 摘要 为探讨川芎嗪和尼莫地平在心脑血管疾病防治中的作用机制，我们采用内皮细胞体外培养的方法，观察尼莫地平和川芎嗪对内皮细胞分泌内皮素(ET)和一氧化氮(NO)的影响。实验结果发现，两药均能不同程度地抑制正常体外培养的内皮细胞产生内皮素，改变ET和NO的比例，从而起到防治心脑血管疾病的作用。
血管内皮细胞在心脑血管疾病中的作用越来越受到重视，内皮细胞的功能改变与疾病的发生和发展密切相关。本实验采用内皮细胞体外培养的方法，观察临床广泛应用于心脑血管疾病治疗的药物尼莫地平和川芎嗪对内皮细胞分泌内皮素(ET)和一氧化氮(NO)的影响，探讨两药在心脑血管疾病治疗中的作用机制。
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材料和方法
一、材料
1.尼莫地平(简称NM)，为德国拜耳(Bayer)公司制造的尼莫通注射液(批号：00519885M-D)，每瓶50ml，含尼莫地平10mg。使用前用细胞培养液稀释成所需实验浓度。
2.盐酸川芎嗪注射液(简称LZ或川芎嗪)，由北京第四制药厂生产(批号960426)，每支2ml，含盐酸川芎嗪40mg。使用前用细胞培养液稀释成所需实验浓度。
3.一氧化氮试剂盒(硝酸还原酶法)，由南京建成生物工程研究所提供。
4.内皮素放射免疫测定药盒，由北京东亚免疫技术研究所提供。
二、方法
1.含药物培养液的配制：分别在RPMI-1640培养液中加入川芎嗪和尼莫地平，配制成含川芎嗪100μg/ml、20μg/ml和含尼莫地平10μg/ml、2μg/ml的含药培养液。
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2.实验分组：根据处理因素的不同，将实验共分成5组。其中1组为正常对照组；2～5组分别在培养液中加入川芎嗪100μg/ml、 20μg/ml和尼莫地平10μg/ml、2μg/ml。每12孔为一实验组。
3.人脐静脉内皮细胞(EC)培养：按Jaffe等的方法稍加改进，获取脐静脉内皮细胞，加入RPMI-1640培养液(其中含20%小牛血清，青霉素105U/L、链霉素105U/L、L-谷氨酰胺2mM)，将pH调至7.2左右，用乳头吸管轻轻吹打均匀后，吸取2ml接种于6孔塑料培养板(Falcon)的每孔中，置5%CO2培养箱中(37℃)培养，每2天换液一次。
4.药物对EC的影响：原代培养细胞将铺满培养孔底时，吸出培养液，经PBS冲洗后，用加样器吸取含有不同浓度药物的培养液2ml加入每孔中。继续培养24小时后，吸出培养液分别用放射免疫方法测定ET含量，用硝酸还原酶法测定NO代谢产物NO-x含量。每孔中加入0.05%胰酶―0.02%EDTA溶液0.5ml，将细胞消化后收集，再加入1.5mlPBS冲洗后以血球计数台计数细胞数。
, http://www.100md.com
5.统计学处理：首先，根据各样本(孔)细胞计数，将所测得的ET和NO-x浓度换算成1×105细胞/ml的含量，其中NO-x再去除各组培养前培养液中的本底含量。然后采用随机分组设计资料的方差分析方法进行统计学处理。
结 果
正常内皮细胞24小时ET分泌量为1226.8±118.5ng/L×105细胞/L，用药各组内皮素分泌量均有不同程度的减少，除LZ/2组外，均有显著差异(P<0.01)(见附表)。尼莫地平作用较川芎嗪为强(P<0.05或P<0.01)。两者均以大剂量组作用为强(P<0.01)。
正常内皮细胞24小时NO-x产生量为33.0±5.9μmol/L。用药各组NO-x含量无显著差异(P>0.05)(见附表)。
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附表 川芎嗪和尼莫地平对内皮细胞分泌ET和NO-x的影响
n
ET含量(ng/L)
NO-x含量(μmol/L)
对照组
12
1226.8±118.5
33.0±5.9
LZ/1
12
1052.2±66.7*
, 百拇医药
34.2±7.2
LZ/2
12
1219.4±94.0
32.6±8.2
NM/1
12
881.5±90.0*
31.0±10.2
NM/2
12
1096.7±95.6*
, 百拇医药
34.2±10.4
与对照组比较*P<0.01
讨 论
ET和NO是近年来发现的器官局部调节因子。血管内皮细胞通过释放ET收缩血管和促进内皮细胞增殖，同时释放NO松驰血管平滑肌和抑制内皮细胞的增殖。正常情况下，ET和NO处于动态平衡状态，维持着血管舒缩功能[1]。两种血管作用物质平衡破坏时便导致血管收缩，产生高血压、动脉硬化等一系列心血管疾病。
本实验结果发现，川芎嗪和尼莫地平能不同程度地抑制正常体外培养内皮细胞产生内皮素，从而改变ET和NO的比例。这对临床心脑血管病的防治具有重要意义。
川芎嗪和尼莫地平在临床血管性疾病的治疗中已取得明显疗效，尤其对缺血性脑血管病，它们能扩张脑血管，增加局部脑血流量，从而改善脑血液循环和能量代谢功能，降低乳酸酸中毒，减少缺血性脑损伤的发生[2～5]。但这些作用的机制尚不清楚。本实验在体外培养的内皮细胞研究中发现，川芎嗪和尼莫地平均能抑制内皮细胞产生ET，从而可使ET和NO的平衡状态得到改善，进而减轻病变血管的收缩或痉挛，增加缺血区的血液供应，改善缺血组织的代谢状态，减轻组织损伤。因而，本实验结果进一步揭示了川芎嗪和尼莫地平的上述临床作用机制，为两药的临床应用提供了可靠的实验和理论依据。临床大剂量应用尼莫地平可引起血压下降、皮肤潮红等血管扩张现象[3]，而川芎嗪的降压作用则较弱[4，5]。这与我们在实验中发现的尼莫地平抑制ET产生的作用较川芎嗪强这一结果相符。因而，本实验结果从细胞水平进一步证明，川芎嗪和尼莫地平在心脑血管的防治中具有良好的应用前景。
, 百拇医药
参考文献
[1] Ehrenreich H，et al.Cleve Clin J Med 1995；62(2)：105.
[2] Fieschi C，et al.J Carolivase Pharmacol 1998；12(Sup-
ple6)：s83.
[3] 王桂红综述.国外医学脑血管疾病分册 1997；5(2)：96.
[4] 邵国富，等.实用诊断与治疗杂志 1992；6(1)：1.
[5] 邵国富，等.中华神经精神科杂志 1992；25(16)：347.
(1999年3月15日收稿 同年5月17日修回), 百拇医药