人参皂甙单体Rb1对多药耐药细胞系K562/HHT的耐药逆转作用
作者：史曦凯 张翼军 赵春景
单位：史曦凯 张翼军：第三军医大学附属西南医院：血液科 赵春景：药剂科，重庆 400038
关键词：多药耐药；耐药逆转；钙离子通道拮抗剂；人参皂甙Rb1
第三军医大学学报991113
提要 目的：探讨中药钙离子通道拮抗剂人参皂甙单体Rb1，对白血病多药耐药细胞系(K-562/HHT)的耐药逆转作用。方法：药物敏感试验采用四唑氮盐(MTT)比色试验法。结果：Rb1在0～80 μmol/L浓度范围内对K562/HHT未见明显毒性作用；20 μmol/L、40 μmol/LRb1 耐药逆转倍数分别为4.4、7.9倍。结论：Rb1可以逆转K562/HHT的多药耐药性，并呈剂量依赖性。
中图法分类号 R915;R977 文献标识码 A
, http://www.100md.com
The reverse effects of Ginseng Saponin Rb1 on multidrug resistance of human leukemic cell line K562/HHT iv vitro
SHI Xi-kai, ZHANG Yi-jun, ZHAO Chun-jing
(Blood Bank, Southwest Hospital, Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract Objective: To study the reverse effects of Ginseng Saponin Rb1 on the multi-drug resistance of human leukemic cell line K562/HHT in vitro.Methods: Cytotoxic effects were determined with MTT colorimetry.Results: Saponin Rb1 in the concentration range of 0～80 μmol/L showed notoxic effects on the cells of human leukemic cell line K562/HHT and when the concentration was increased to 20 μmol/L and 40 μmol/L, the reverse effects on the multidrug resistance of the leukemic cells were increased by 4.4 and 7.9 fold respectively.Conclusion: Ginseng Saponin Rb1 is able to reverse the multidrug resistance of the cells of human leukemic cell line K562/HHT in a dosage-dependent manner in vitro.
, 百拇医药
Key words durg resistance; calcium channel blocker; Ginseng Saponin Rb1
肿瘤产生多药耐药(Multidrug resistance,MDR)时常有P-gp的过度表达，这种P-gp 糖蛋白是一种能量泵，可主动将细胞内药物泵出，使细胞内药物减少，产生对多种化疗药物的耐药性，涉及的药物包括蒽环类、长春碱类，表鬼臼素类等多类化疗药物，上述药物均是白血病化疗的常用药物，研究MDR的逆转无疑对提高白血病的疗效有着重要意义。大量研究表明，钙离子拮抗剂通过竞争性抑制P-gp 外排药物而逆转MDR。传统的钙拮抗剂，均需较大剂量才能达到逆转MDR的效果。但大剂量产生的毒性限制了它的临床应用。多种中草药具有钙拮抗剂活性，毒副作用也较低，有临床研究推广价值，人参皂甙单体Rb1是其中之一。人参皂甙单体Rb1系三七总甙，人参二醇甙的主要成份，分子式为C54H92O23H2O。近年的实验研究表明Rb1对钙离子通道有阻滞活性[1]。本研究旨在探讨其对白血病多药耐药细胞系(K-562/HHT)的耐药逆转作用，并与典型药物VER比较，观察逆转作用强度。
, 百拇医药
1 材料
1.1 细胞系
K562/S,k562/HHT由中国医学科学院血液学研究所血液病医院细胞培养室馈赠。
1.2 药物与试剂
高三尖杉酯碱(HHT北京协和药厂)。异博定(VER连云港制药厂)。人参皂甙单体Rb1(卫生部药品生物制品检验所)。上述药物均用生理盐水配成工作母液，临用时用RPMI 1640 培养液配成相应浓度应用液。
RPMI 1640培养液(美国Sigma公司)。MTT(美国Sigma公司)。
2 实验方法
2.1 K562/S与K562/HHT细胞培养[2]
, 百拇医药
K562/S悬浮于含10%小牛血清的RPMI-1640 培养基中长期培养； K562/HHT则在含0.2 μg/mlHHT诱导耐药的RPMI-1640培养基中长期培养，试验前2d，更换成无HHT的培养液培养并进行试验。
2.2 四唑氮盐(MTT)比色试验[3]
试验分成四组：①药物受试组：药物+细胞+培养基。②细胞对照组(阴性对照组)：细胞+培养基。③空白组：培养基。④VER作为阳性对照组。以上各组一式三份进行试验。药物受试组分别为：A组5～6种浓度的HHT。B组5～6种浓度的HHT 加不同浓度的Rb1或8μmol的VER(各50 μl)。
以生长良好的5×104/ml培养细胞100 μl接种于96孔培养板，加入相应浓度的HHT、Rb1或VER、每孔终体积200 μl。将培养板移入CO2 孵箱中，在37°C、5%CO2及饱和湿度条件下，培养4 d。第4天后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl、37.0°C、4 h终止培养，离心(1000 rpm,5 min)，弃去孔内培养液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，540 nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。
, 百拇医药
2.3 统计学分析 IC50应用加权线性回归方法计算，结果以
±s表示，不同药物间的比较应用完全随机设计的方差分析。P<0.05为相差显著，P<0.01为相差非常显著。以上统计学计算机程序由中国医学科学院血液学研究所提供，程序名分别是POMS-36，POMS-17。
3 结果
3.1 Rb1,VER,HHT,对K562/S，K562/HHT的毒性作用
Rb1在(0～80)μmol/L浓度范围内, VER浓度在 8 μmol/L时，均对K562/S，K562/HHT 未见明显毒性作用，细胞存活率97%～100%。
, 百拇医药
HHT对K562/S、K562/HHT的IC50值分别为：(4.70±0.14)μg/L、(447.72±12.34)μg/L，K562/HHT耐HHT倍数约95倍。
3.2 Rb1与VER加HHT对K562/S的杀伤效应
40 μmol/L Rb1联合HHT作用于K562/S，IC50：(4.08±0.06)μg/L；8 μmol/LVER联合HHT作用于K562/S，IC50：(4.09±0.04)μg/L；二者与单用HHT相比无显著性差异(P>0.05)，见图1。
图1 Rb1+HHT对K562/S的杀伤效应 (n=3)
Fig 1 Killing effect of Rb1+HHT on K562/S (n=3)
, 百拇医药
3.3 RB1与VER对K562/HHT耐药性的逆转效应 20 μmol/L、40 μmol/L两种浓度Rb1加HHT，作用于K562/HHT，细胞存活曲线见图2，IC50分别为(101.11±5.47)μg/L、(56.36±2.47)μg/L，与不加Rb1时HHT对K562/HHT杀伤效应相比，存在非常显著性差异(P<0.001)。两种浓度的Rb1之间也存在非常显著性差异(P<0.01)，Rb1浓度越高，联合的HHT对细胞的杀伤就越强。
图2 Rb1对K562/HHT的耐药逆转作用 (n=3)
Fig 2 Reversing effect of Rb1 on K562/HHT (n=3)
8 μmol/L VER加HHT作用于K562/HHT，由MTT法得细胞存活曲线，IC50(23.11±0.95)μg/L，显著提高了HHT的杀伤作用(P< 0.001)。比较两种浓度的Rb1与VER，联合HHT对K562/HHT的杀伤效应也存在非常显著的差异(P<0.001)。逆转倍数分别为4.4、7.9、19.4倍。
, 百拇医药
4 讨论
K562/HHT是利用源于自然界的抗肿瘤药物HHT，经体外长期培养诱导K562细胞所产生的多药耐药细胞株，表达P-GP阳性，其对HHT、DOX、VCR、DNR存在交叉耐药性，我们的实验表明其对HHT的耐药性是K562/S的95倍，耐药性稳定。Rb1作用于K562/HHT可以使HHT的IC50下降，40 μmol/L的Rb1使K562/HHT IC50由(447.72±12.34)μg/L降至(56.36±2.47)μg/L，显著增强了HHT对K562/HHT的杀伤。Rb1作用于K562/S后，HHT的IC50无显著变化，即不影响HHT对K562/S杀伤效应，这说明Rb1对K562多药耐药细胞的耐药性有逆转作用。两种不同浓度的Rb1逆转浓度有一定差异，20 μmol/L、40 μmol/L的Rb1加HHT IC50分别为(101.11±5.47)μg/L、(56.36±2.47)μg/L,逆转倍数分别为4.4倍，7.9倍。说明Rb1剂量越大，逆转能力越强。有实验显示(1～10)μmol/L VER对K562/S、K562/HHT无明显毒性，当浓度大于10 μmol/L时，毒性则明显增加[4]。我们选定8 μmol/L VER作逆转能力对照。8 μmol/L VER的逆转倍数为19.4倍，与40 μmol/L Rb1逆转浓度相比，二条细胞存活曲线及IC50存在着显著性差异，提示在目前的Rb1浓度水平，体外逆转转能力弱于VER。筛选低毒性、高逆转效应、低钙阻滞活性的钙拮抗剂(CCB)作为MDR逆转剂是目前研究的重要方向。许多中草药具有这一特性，如潘启超等研究发现汉防已甲素，蝙蝠葛碱，多种双卞基异喹啉生物碱逆转能力强于VER，毒性及钙拮抗活性均较低，被认为具有很好的临床应用前景[5]。本试验显示，人参皂甙单体Rb1在达到80 μmol/L时亦未见其对K562/S、K562/HHT有毒性作用，即血液学毒性较低；通过兔急性毒性试验显示，人参皂甙单体Rb1 IC50达1054 mg/kg[6]，用药安全范围较大；在我们设定的Rb1浓度下，Rb1体外逆转能力弱于接近细胞毒性浓度的VER，但由于它的较低的毒性和钙拮抗活性，以及随剂量增大，MDR逆转活性增强的特点，可以在今后的动物或临床试验中，通过加大Rb1的用药剂量，提高疗效，或与VER联合应用减少VER的用药剂量，达到最佳的逆转效果。
, 百拇医药
基金项目：重庆市科委基金资助项目
作者简介：史曦凯，男，34岁，主治医师，讲师，硕士
参考文献
[1] 钟国赣，李云义，江 岩，等.Rb1对B型钙离子通道的阻滞作用及其机理的单通道分析[J].白求恩医科大学学报，1992，2(18)：129-132.
[2] 韩俊领，严文伟，钱其军，等.K562和L1210耐高三尖杉醋碱细胞系的建立及其耐药机制的初步研究[J].中华医学杂志，1994，7(74)：424-426.
[3] Denese C, Larissa Belov, Mary W，et al.The MTT cell viability assay for cytotoxicity testing in multidrug-resistant human leukemic cells[J].Leukemic Res, 1992,12(62):1165-1170.
, 百拇医药
[4] 韩俊领，严文伟，钱其军，等.异博定与它莫希芬联合逆转高三尖杉酯碱耐药的体外研究[J].中华血液学杂志，1997，3(18)：143-147.
[5] Pan Q C, Tan H.Reversal of multidrug resistance by various principles from Chinese herbal medicine[J].Chin Sci Bull，1996; 3 (41):410-419.
[6] 雷伟亚.人参皂甙的动物毒性研究[J].中草药，1986，1(3)：15-18.
收稿日期：1999-01-15；修回日期：1999-05-18, 百拇医药
单位：史曦凯 张翼军：第三军医大学附属西南医院：血液科 赵春景：药剂科，重庆 400038
关键词：多药耐药；耐药逆转；钙离子通道拮抗剂；人参皂甙Rb1
第三军医大学学报991113
提要 目的：探讨中药钙离子通道拮抗剂人参皂甙单体Rb1，对白血病多药耐药细胞系(K-562/HHT)的耐药逆转作用。方法：药物敏感试验采用四唑氮盐(MTT)比色试验法。结果：Rb1在0～80 μmol/L浓度范围内对K562/HHT未见明显毒性作用；20 μmol/L、40 μmol/LRb1 耐药逆转倍数分别为4.4、7.9倍。结论：Rb1可以逆转K562/HHT的多药耐药性，并呈剂量依赖性。
中图法分类号 R915;R977 文献标识码 A
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The reverse effects of Ginseng Saponin Rb1 on multidrug resistance of human leukemic cell line K562/HHT iv vitro
SHI Xi-kai, ZHANG Yi-jun, ZHAO Chun-jing
(Blood Bank, Southwest Hospital, Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract Objective: To study the reverse effects of Ginseng Saponin Rb1 on the multi-drug resistance of human leukemic cell line K562/HHT in vitro.Methods: Cytotoxic effects were determined with MTT colorimetry.Results: Saponin Rb1 in the concentration range of 0～80 μmol/L showed notoxic effects on the cells of human leukemic cell line K562/HHT and when the concentration was increased to 20 μmol/L and 40 μmol/L, the reverse effects on the multidrug resistance of the leukemic cells were increased by 4.4 and 7.9 fold respectively.Conclusion: Ginseng Saponin Rb1 is able to reverse the multidrug resistance of the cells of human leukemic cell line K562/HHT in a dosage-dependent manner in vitro.
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Key words durg resistance; calcium channel blocker; Ginseng Saponin Rb1
肿瘤产生多药耐药(Multidrug resistance,MDR)时常有P-gp的过度表达，这种P-gp 糖蛋白是一种能量泵，可主动将细胞内药物泵出，使细胞内药物减少，产生对多种化疗药物的耐药性，涉及的药物包括蒽环类、长春碱类，表鬼臼素类等多类化疗药物，上述药物均是白血病化疗的常用药物，研究MDR的逆转无疑对提高白血病的疗效有着重要意义。大量研究表明，钙离子拮抗剂通过竞争性抑制P-gp 外排药物而逆转MDR。传统的钙拮抗剂，均需较大剂量才能达到逆转MDR的效果。但大剂量产生的毒性限制了它的临床应用。多种中草药具有钙拮抗剂活性，毒副作用也较低，有临床研究推广价值，人参皂甙单体Rb1是其中之一。人参皂甙单体Rb1系三七总甙，人参二醇甙的主要成份，分子式为C54H92O23H2O。近年的实验研究表明Rb1对钙离子通道有阻滞活性[1]。本研究旨在探讨其对白血病多药耐药细胞系(K-562/HHT)的耐药逆转作用，并与典型药物VER比较，观察逆转作用强度。
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1 材料
1.1 细胞系
K562/S,k562/HHT由中国医学科学院血液学研究所血液病医院细胞培养室馈赠。
1.2 药物与试剂
高三尖杉酯碱(HHT北京协和药厂)。异博定(VER连云港制药厂)。人参皂甙单体Rb1(卫生部药品生物制品检验所)。上述药物均用生理盐水配成工作母液，临用时用RPMI 1640 培养液配成相应浓度应用液。
RPMI 1640培养液(美国Sigma公司)。MTT(美国Sigma公司)。
2 实验方法
2.1 K562/S与K562/HHT细胞培养[2]
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K562/S悬浮于含10%小牛血清的RPMI-1640 培养基中长期培养； K562/HHT则在含0.2 μg/mlHHT诱导耐药的RPMI-1640培养基中长期培养，试验前2d，更换成无HHT的培养液培养并进行试验。
2.2 四唑氮盐(MTT)比色试验[3]
试验分成四组：①药物受试组：药物+细胞+培养基。②细胞对照组(阴性对照组)：细胞+培养基。③空白组：培养基。④VER作为阳性对照组。以上各组一式三份进行试验。药物受试组分别为：A组5～6种浓度的HHT。B组5～6种浓度的HHT 加不同浓度的Rb1或8μmol的VER(各50 μl)。
以生长良好的5×104/ml培养细胞100 μl接种于96孔培养板，加入相应浓度的HHT、Rb1或VER、每孔终体积200 μl。将培养板移入CO2 孵箱中，在37°C、5%CO2及饱和湿度条件下，培养4 d。第4天后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl、37.0°C、4 h终止培养，离心(1000 rpm,5 min)，弃去孔内培养液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，540 nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。
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2.3 统计学分析 IC50应用加权线性回归方法计算，结果以
±s表示，不同药物间的比较应用完全随机设计的方差分析。P<0.05为相差显著，P<0.01为相差非常显著。以上统计学计算机程序由中国医学科学院血液学研究所提供，程序名分别是POMS-36，POMS-17。3 结果
3.1 Rb1,VER,HHT,对K562/S，K562/HHT的毒性作用
Rb1在(0～80)μmol/L浓度范围内, VER浓度在 8 μmol/L时，均对K562/S，K562/HHT 未见明显毒性作用，细胞存活率97%～100%。
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HHT对K562/S、K562/HHT的IC50值分别为：(4.70±0.14)μg/L、(447.72±12.34)μg/L，K562/HHT耐HHT倍数约95倍。
3.2 Rb1与VER加HHT对K562/S的杀伤效应
40 μmol/L Rb1联合HHT作用于K562/S，IC50：(4.08±0.06)μg/L；8 μmol/LVER联合HHT作用于K562/S，IC50：(4.09±0.04)μg/L；二者与单用HHT相比无显著性差异(P>0.05)，见图1。
图1 Rb1+HHT对K562/S的杀伤效应 (n=3)
Fig 1 Killing effect of Rb1+HHT on K562/S (n=3)
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3.3 RB1与VER对K562/HHT耐药性的逆转效应 20 μmol/L、40 μmol/L两种浓度Rb1加HHT，作用于K562/HHT，细胞存活曲线见图2，IC50分别为(101.11±5.47)μg/L、(56.36±2.47)μg/L，与不加Rb1时HHT对K562/HHT杀伤效应相比，存在非常显著性差异(P<0.001)。两种浓度的Rb1之间也存在非常显著性差异(P<0.01)，Rb1浓度越高，联合的HHT对细胞的杀伤就越强。
图2 Rb1对K562/HHT的耐药逆转作用 (n=3)
Fig 2 Reversing effect of Rb1 on K562/HHT (n=3)
8 μmol/L VER加HHT作用于K562/HHT，由MTT法得细胞存活曲线，IC50(23.11±0.95)μg/L，显著提高了HHT的杀伤作用(P< 0.001)。比较两种浓度的Rb1与VER，联合HHT对K562/HHT的杀伤效应也存在非常显著的差异(P<0.001)。逆转倍数分别为4.4、7.9、19.4倍。
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4 讨论
K562/HHT是利用源于自然界的抗肿瘤药物HHT，经体外长期培养诱导K562细胞所产生的多药耐药细胞株，表达P-GP阳性，其对HHT、DOX、VCR、DNR存在交叉耐药性，我们的实验表明其对HHT的耐药性是K562/S的95倍，耐药性稳定。Rb1作用于K562/HHT可以使HHT的IC50下降，40 μmol/L的Rb1使K562/HHT IC50由(447.72±12.34)μg/L降至(56.36±2.47)μg/L，显著增强了HHT对K562/HHT的杀伤。Rb1作用于K562/S后，HHT的IC50无显著变化，即不影响HHT对K562/S杀伤效应，这说明Rb1对K562多药耐药细胞的耐药性有逆转作用。两种不同浓度的Rb1逆转浓度有一定差异，20 μmol/L、40 μmol/L的Rb1加HHT IC50分别为(101.11±5.47)μg/L、(56.36±2.47)μg/L,逆转倍数分别为4.4倍，7.9倍。说明Rb1剂量越大，逆转能力越强。有实验显示(1～10)μmol/L VER对K562/S、K562/HHT无明显毒性，当浓度大于10 μmol/L时，毒性则明显增加[4]。我们选定8 μmol/L VER作逆转能力对照。8 μmol/L VER的逆转倍数为19.4倍，与40 μmol/L Rb1逆转浓度相比，二条细胞存活曲线及IC50存在着显著性差异，提示在目前的Rb1浓度水平，体外逆转转能力弱于VER。筛选低毒性、高逆转效应、低钙阻滞活性的钙拮抗剂(CCB)作为MDR逆转剂是目前研究的重要方向。许多中草药具有这一特性，如潘启超等研究发现汉防已甲素，蝙蝠葛碱，多种双卞基异喹啉生物碱逆转能力强于VER，毒性及钙拮抗活性均较低，被认为具有很好的临床应用前景[5]。本试验显示，人参皂甙单体Rb1在达到80 μmol/L时亦未见其对K562/S、K562/HHT有毒性作用，即血液学毒性较低；通过兔急性毒性试验显示，人参皂甙单体Rb1 IC50达1054 mg/kg[6]，用药安全范围较大；在我们设定的Rb1浓度下，Rb1体外逆转能力弱于接近细胞毒性浓度的VER，但由于它的较低的毒性和钙拮抗活性，以及随剂量增大，MDR逆转活性增强的特点，可以在今后的动物或临床试验中，通过加大Rb1的用药剂量，提高疗效，或与VER联合应用减少VER的用药剂量，达到最佳的逆转效果。
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基金项目：重庆市科委基金资助项目
作者简介：史曦凯，男，34岁，主治医师，讲师，硕士
参考文献
[1] 钟国赣，李云义，江 岩，等.Rb1对B型钙离子通道的阻滞作用及其机理的单通道分析[J].白求恩医科大学学报，1992，2(18)：129-132.
[2] 韩俊领，严文伟，钱其军，等.K562和L1210耐高三尖杉醋碱细胞系的建立及其耐药机制的初步研究[J].中华医学杂志，1994，7(74)：424-426.
[3] Denese C, Larissa Belov, Mary W，et al.The MTT cell viability assay for cytotoxicity testing in multidrug-resistant human leukemic cells[J].Leukemic Res, 1992,12(62):1165-1170.
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[4] 韩俊领，严文伟，钱其军，等.异博定与它莫希芬联合逆转高三尖杉酯碱耐药的体外研究[J].中华血液学杂志，1997，3(18)：143-147.
[5] Pan Q C, Tan H.Reversal of multidrug resistance by various principles from Chinese herbal medicine[J].Chin Sci Bull，1996; 3 (41):410-419.
[6] 雷伟亚.人参皂甙的动物毒性研究[J].中草药，1986，1(3)：15-18.
收稿日期：1999-01-15；修回日期：1999-05-18, 百拇医药