逆转录定量PCR检测实验性肝纤维化组织中金属蛋白酶抑制因子-1的表达
作者：高毅 黄宇琦 王宇 方石岗 杨继震
单位：高毅 王宇 方石岗 杨继震 中国人民解放军第一军医大学珠江医院肝胆外科 广东省广州市 510282；黄宇琦 中国人民解放军第一军医大学南方医院肝胆血管外科 广东省广州市 510515
关键词：肝硬化；组织金属蛋白酶抑制因子-1；基因表达
中国图书馆分类号 R 575中国图书馆分类号 R 575.2
Subject headings liver cirrhosis; metalloproteinase-1; gene expression
肝纤维化是Ⅰ，Ⅲ型胶原为主的细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)成分过度沉积导致的病理性疾病. 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一族依赖Zn离子降解ECM成分的水解蛋白. 目前为止该家族肝内发现8个成员，它们的抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1)可以抑制其活化和活性，因此，TIMP-1与肝纤维化的发生发展紧密相关. 我们应用大鼠CCl4肝纤维化模型，通过逆转录定量PCR方法对TIMP-1 mRNA的表达水平作了检测，现介绍如下.
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1 材料和方法
1.1 材料 清洁型Wistar ♂大鼠140只，体质量180 g～300 g，第一军医大学实验动物中心提供. CCl4为汕头化工厂产品，含量>99.5%. 总RNA提取试剂盒(Trizol reagent)、M-MLV逆转录酶、RNasin为Gibco产品；Oligo(dT) 15 primers，PCR marker及琼脂糖为Promega公司产品；DEPC，Tag酶为Sangon公司产品. PCR仪为珠海黑马公司产品；台式低温冷冻离心机为Heraeus德国公司产品；凝胶成象系统系第一军医大学中心实验室提供的Gel Documentarion Analysis System, GDAS.
1.2 方法 参照Montfort et al[1]方法建立CCl4中毒性肝纤维化模型，400 mL/ L CCl4纯花生油溶液2 mL/ kg予Wistar大鼠 ip，2次/ wk；正常对照组用生理盐水予腹腔注射. 140只大鼠分模型组和对照组，各为70只. 在0，1，4，6，8，10，12 wk时每组分别活杀一个亚组，切取肝脏，除留作常规HE，VG病理检查外，其余迅速投入液氮，之后转入-70℃保存. 肝组织总RNA提取按照Trizol reagent说明书进行，紫外分光光度计检测纯度和定量. cDNA的合成采用25 μL逆转录反应体系. 其中含待测总RNA 1 μg，M-MLV 200 U，oligo(dT)(15 primer)50 mg/ L，4×dNTP(10 mmol/ L)2 μL，5×RT buffer 5 μL，无RNase酶水补至25 μL. 37℃反应60min，95℃灭活M-MLV酶5min. 逆转录PCR根据Genebank资料自行设计引物(表1). 参照Noonan et al[2]方法进行共扩PCR，设GAPDH为内参照. PCR体系为50 μL，包含cDNA 10 μL，5×buffer 10 μL，4×dNTP(10 mmol/ L)1 μL，TIMP-1，GAPDH上下游引物(12.5 μmol/ L)各2 μL，Tag酶1.5 U，用水补至50 μL. PCR反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性50s，54℃退火70s，72℃延伸90s，选定30个循环，最后72℃再延伸7min. TIMP-1的PCR产物经测序证实为大鼠TIMP-1的基因序列. PCR产物在20 g/ L琼脂糖凝胶上进行电泳后经GDAS系统扫描定量分析，用TIMP-1/ GAPDH比值表示TIMP-1相对表达水平(图1).
, 百拇医药
图1 TIMP-1 PCR产物电泳图.
(M，A，B，C，D，E，F，G代表DNA Marker; 0, 1, 4, 6, 8, 10, 12 wk)
表1 引物序列
引物名称
上游引物序列
下游引物序列
扩增产
物长度
TIMP-1
5＇-GCCATGGAGAGCCTCTGTGG-3＇
5＇-GCAGGCAGGCAAAGTGATCG-3＇
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270bp
GAPDH
5＇-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3＇
5＇-TGTCATTGAGAGCAATGCCAGC-3＇
148bp
统计学处理 采用单因素方差分析方法.
2 结果
在肝纤维化过程中TIMP-1 mRNA表达逐步增强，肝硬变阶段最强(表2).
表2 CCl4中毒性大鼠肝纤维化TIMP-1基因表达相对值 (
±s)
, 百拇医药
分组
0 wk
1 wk
4 wk
6 wk
8 wk
10 wk
12 wk
(n=10)
(n=9)
(n=9)
(n=8)
(n=7)
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(n=8)
(n=6)
对照组
0.40±0.06
0.42±0.10
0.39±0.21
0.41±0.07
0.38±0.12
0.40±0.08
0.43±0.15
模型组b
0.41±0.09
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1.13±0.07
2.60±0.71
4.01±0.96
5.11±1.03
6.34±1.70
7.15±1.52
bP<0.01， 正常对照组vs前期.
3 讨论
肝内基质金属蛋白酶在肝组织重建、修复以及纤维化中发挥着重要的作用. 它们直接参与细胞外基质(ECM)合成与降解的动态平衡，MMPs的调节基于3个水平即基因表达、酶原活化以及组织金属蛋白酶抑制因子(TIMP)作用. 其中TIMP作用水平的调控近年来受到极大关注. TIMP不但与MMP酶原以1∶1形式相结合抑制它的活化，而且能灭活活性酶，从而使MMPs失去降解功能[3]. 本研究表明TIMP-1在正常肝组织有表达，肝纤维化发生发展时TIMP-1表达逐渐增强，大量TIMP-1的出现使MMPs活性减少，造成肝损伤后增生的ECM成分尤其是Ⅰ，Ⅲ型胶原降解减少，沉积增多，促进了肝纤维化、肝硬变的形成. 显然通过下调TIMP-1基因表达或抑制TIMP-1活性可能是治疗肝纤维化的新途径.
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注：广东省自然科学基金资助项目，No.960362
通讯作者 高毅
4 参考文献
1 Montfort I, Perez-Tamayo R. Collagenase in exprimental carbon tetrachloride cirrhosis of the liver. Am J Pathol, 1997;92:411-420
2 Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA. Quantitative analysis of MDRI (multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1990;87:7160-7164
3 Iredal JP, Murphy G, Hembry RM. Human hepatic lipoctyes synthesize tissue inhibitor of metalloproteinase-1. Implication for regulation of matix degradation in liver. J Clin Invest, 1992;90:282-287ISSN 1007-9319 CN 14-1218/ R 世界华人消化杂志，1999;7(11):994
收稿日期 1999-07-21, 百拇医药
单位：高毅 王宇 方石岗 杨继震 中国人民解放军第一军医大学珠江医院肝胆外科 广东省广州市 510282；黄宇琦 中国人民解放军第一军医大学南方医院肝胆血管外科 广东省广州市 510515
关键词：肝硬化；组织金属蛋白酶抑制因子-1；基因表达
中国图书馆分类号 R 575中国图书馆分类号 R 575.2
Subject headings liver cirrhosis; metalloproteinase-1; gene expression
肝纤维化是Ⅰ，Ⅲ型胶原为主的细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)成分过度沉积导致的病理性疾病. 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一族依赖Zn离子降解ECM成分的水解蛋白. 目前为止该家族肝内发现8个成员，它们的抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1)可以抑制其活化和活性，因此，TIMP-1与肝纤维化的发生发展紧密相关. 我们应用大鼠CCl4肝纤维化模型，通过逆转录定量PCR方法对TIMP-1 mRNA的表达水平作了检测，现介绍如下.
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1 材料和方法
1.1 材料 清洁型Wistar ♂大鼠140只，体质量180 g～300 g，第一军医大学实验动物中心提供. CCl4为汕头化工厂产品，含量>99.5%. 总RNA提取试剂盒(Trizol reagent)、M-MLV逆转录酶、RNasin为Gibco产品；Oligo(dT) 15 primers，PCR marker及琼脂糖为Promega公司产品；DEPC，Tag酶为Sangon公司产品. PCR仪为珠海黑马公司产品；台式低温冷冻离心机为Heraeus德国公司产品；凝胶成象系统系第一军医大学中心实验室提供的Gel Documentarion Analysis System, GDAS.
1.2 方法 参照Montfort et al[1]方法建立CCl4中毒性肝纤维化模型，400 mL/ L CCl4纯花生油溶液2 mL/ kg予Wistar大鼠 ip，2次/ wk；正常对照组用生理盐水予腹腔注射. 140只大鼠分模型组和对照组，各为70只. 在0，1，4，6，8，10，12 wk时每组分别活杀一个亚组，切取肝脏，除留作常规HE，VG病理检查外，其余迅速投入液氮，之后转入-70℃保存. 肝组织总RNA提取按照Trizol reagent说明书进行，紫外分光光度计检测纯度和定量. cDNA的合成采用25 μL逆转录反应体系. 其中含待测总RNA 1 μg，M-MLV 200 U，oligo(dT)(15 primer)50 mg/ L，4×dNTP(10 mmol/ L)2 μL，5×RT buffer 5 μL，无RNase酶水补至25 μL. 37℃反应60min，95℃灭活M-MLV酶5min. 逆转录PCR根据Genebank资料自行设计引物(表1). 参照Noonan et al[2]方法进行共扩PCR，设GAPDH为内参照. PCR体系为50 μL，包含cDNA 10 μL，5×buffer 10 μL，4×dNTP(10 mmol/ L)1 μL，TIMP-1，GAPDH上下游引物(12.5 μmol/ L)各2 μL，Tag酶1.5 U，用水补至50 μL. PCR反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性50s，54℃退火70s，72℃延伸90s，选定30个循环，最后72℃再延伸7min. TIMP-1的PCR产物经测序证实为大鼠TIMP-1的基因序列. PCR产物在20 g/ L琼脂糖凝胶上进行电泳后经GDAS系统扫描定量分析，用TIMP-1/ GAPDH比值表示TIMP-1相对表达水平(图1).
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图1 TIMP-1 PCR产物电泳图.
(M，A，B，C，D，E，F，G代表DNA Marker; 0, 1, 4, 6, 8, 10, 12 wk)
表1 引物序列
引物名称
上游引物序列
下游引物序列
扩增产
物长度
TIMP-1
5＇-GCCATGGAGAGCCTCTGTGG-3＇
5＇-GCAGGCAGGCAAAGTGATCG-3＇
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270bp
GAPDH
5＇-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3＇
5＇-TGTCATTGAGAGCAATGCCAGC-3＇
148bp
统计学处理 采用单因素方差分析方法.
2 结果
在肝纤维化过程中TIMP-1 mRNA表达逐步增强，肝硬变阶段最强(表2).
表2 CCl4中毒性大鼠肝纤维化TIMP-1基因表达相对值 (
±s), 百拇医药
分组
0 wk
1 wk
4 wk
6 wk
8 wk
10 wk
12 wk
(n=10)
(n=9)
(n=9)
(n=8)
(n=7)
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(n=8)
(n=6)
对照组
0.40±0.06
0.42±0.10
0.39±0.21
0.41±0.07
0.38±0.12
0.40±0.08
0.43±0.15
模型组b
0.41±0.09
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1.13±0.07
2.60±0.71
4.01±0.96
5.11±1.03
6.34±1.70
7.15±1.52
bP<0.01， 正常对照组vs前期.
3 讨论
肝内基质金属蛋白酶在肝组织重建、修复以及纤维化中发挥着重要的作用. 它们直接参与细胞外基质(ECM)合成与降解的动态平衡，MMPs的调节基于3个水平即基因表达、酶原活化以及组织金属蛋白酶抑制因子(TIMP)作用. 其中TIMP作用水平的调控近年来受到极大关注. TIMP不但与MMP酶原以1∶1形式相结合抑制它的活化，而且能灭活活性酶，从而使MMPs失去降解功能[3]. 本研究表明TIMP-1在正常肝组织有表达，肝纤维化发生发展时TIMP-1表达逐渐增强，大量TIMP-1的出现使MMPs活性减少，造成肝损伤后增生的ECM成分尤其是Ⅰ，Ⅲ型胶原降解减少，沉积增多，促进了肝纤维化、肝硬变的形成. 显然通过下调TIMP-1基因表达或抑制TIMP-1活性可能是治疗肝纤维化的新途径.
, http://www.100md.com
注：广东省自然科学基金资助项目，No.960362
通讯作者 高毅
4 参考文献
1 Montfort I, Perez-Tamayo R. Collagenase in exprimental carbon tetrachloride cirrhosis of the liver. Am J Pathol, 1997;92:411-420
2 Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA. Quantitative analysis of MDRI (multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1990;87:7160-7164
3 Iredal JP, Murphy G, Hembry RM. Human hepatic lipoctyes synthesize tissue inhibitor of metalloproteinase-1. Implication for regulation of matix degradation in liver. J Clin Invest, 1992;90:282-287ISSN 1007-9319 CN 14-1218/ R 世界华人消化杂志，1999;7(11):994
收稿日期 1999-07-21, 百拇医药