南京地区TTV部分基因的克隆及序列测定
作者：杨志国 许家璋 周育森 何长伦 隋云华 高 蕾
单位：南京军区第八一医院肝病研究所 邮政编码：210002；周育森：解放军军事医学科学院五所
关键词：输血传播病毒 聚合酶链反应 核苷酸序列
江苏医药991202 摘要 目的：了解中国南京地区有无输血传播病毒(TTV)感染。方法：用套式聚合酶链反应(PCR)检测病因未明肝炎患者血清中TTV DNA，并对PCR扩增产物进行序列测定。结果：14例非甲-非戊型肝炎患者血清中共检出8例TTV DNA阳性者，对其中一株进行序列测定，该序列与日本TTV部分基因(CLON22)和TTV中国株1相对应位置的核苷酸同源性很高，分别达97.65%和98.99%。结论：中国南京地区肝炎患者存在TTV感染。
Cloning and Sequencing of Partial Genes of TTV in Nanjing
, http://www.100md.com
Yang Zhiguo et al
Department of Infectious Disease，The 81th Hospital of PLA，Nanjing
Abstract Objective：To investigate the presence of TTV infection in Nanjing district.Methods：Serum samples from patients with hepatitis were detected for TTV DNA by PCR technique and the PCR products were sequenced.Results：TTV DNA was found in 8 of 14 cases suffering from non-A～E hepatitis.The partial genes were cloned and sequenced from the serum of one patient.The partial sequence of TTV from Nanjing showed 97.65% and 98.99% nucleotide identity with corresponding region of TTV isolated in Japan and in other parts of China.Conclusion：There are hepatitis patients infected by TTV in Nanjing.
, 百拇医药
Key words TT virus Polymerase chain reaction DNA sequencing
1997年12月日本学者Nishizawa等[1，2]在输血后肝炎患者血清中发现了一种新的DNA病毒，暂名为输血传播病毒(Transfusion Transmitted Virus，TTV)，认为其与输血传播有关。我国学者[3]也于翌年3月证明中国人群中存在TTV感染。最近本单位也在军事医学科学院五所的协助下建立了TTV DNA的PCR检测方法，并对其中1例慢性肝炎患者血清中克隆出的TTV部分基因作了序列测定，现报告如下。
资料与方法
一、标本来源 14例患者均系南京第八一医院住院患者，其中男11例，女3例；临床诊断为急性肝炎2例，慢性肝炎8例，慢性重型肝炎2例，肝硬变(代偿期)2例，其中5例病理确诊为慢性肝炎。诊断标准参照文献[4]。
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二、试剂来源 抗HAV-IgM ELISA试剂购自南京军区军事医学研究所；HBVM、抗HCV-IgG ELISA试剂以及实验所需酶和dNTPs购自华美生物工程公司；HGV RNA(RT-PCR)试剂由军事医学科学院五所提供；克隆用T载体、XL1-Blue菌和M13噬菌体购自美国Invitrogen公司；序列分析采用CLUSTAWL及BLAST程序软件进行分析。
三、TTV DNA检测方法 先用STG法提取血清TTV DNA(STG试剂盒购于美国Biotronic公司)：取50μl血清加62.5μlSTG缓冲液，混匀后100℃变性5min，13000rpm离心10min后挑除变性蛋白，加90μl异丙醇沉淀，13000rpm离心10min，吸净残留液滴后65℃干燥10min，再用10μl无菌水溶解。参考日本株TTV基因ORF1区序列设计两对引物，序列为P1：5′-CACC AG GA GC AT AC AT AGA-3′，P2：5′-TCTT CT TG CT GG TG AA AG C-3′，P3：5′-AGC AG AG GA GA AG GC AA CATG T-3′，P4：5′-CT/CT TA CT AC TA CT AC CT CC TG GC AT-3′。其中P1/P2为外引物，P3/P4为内引物。第一轮反应条件：参见文献[3]；第二轮PCR反应条件：取第一轮PCR产物2μl作为模板，10X Tag酶buffer 3μl，dNTPs0.8μmol/L，P3/P40.1μmol/L，30μl反应体积，94℃180sec预变性后，94℃40ses、55℃40ses、72℃40ses循环30次。取第二轮PCR产物10μl用2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察结果，与阳性对照在同一水平出现条带者判为阳性。每次PCR扩增均设阳性及阴性对照，扩增产物长度约298bp。
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四、TTV DNA PCR扩增产物的克隆测序 从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，纯化后与T载体连接，转化XL1-Blue宿主菌，挑取白色菌落用PCR鉴定，从阳性菌落中提取质粒DNA，经EcoRI和HindⅢ双酶切后克隆至M13mp18和M13mp19中，制备单链模板，用ABI373型自动测序仪进行测序。
五、对DNA序列采用CLUSTAWL及BLAST程序软件进行分析。
结果
14例血清HGV RNA阴性的非甲-非戊型肝炎患者血清中共检出8例TTV DNA阳性，将其中一株命名为TTV中国南京株，将其扩增产物纯化回收，克隆后进行序列分析，结果该序列与日本TTV部分基因(CLON22)及TTV中国株1(TTVCH1)相对应位置的核苷酸同源性分别为97.65%和98.99%，与已知的肝炎病毒(A型至G型)没有明显的相关性，而只同日本株及中国株1(TTVCH1)有很高的同源性，属4亚型中的Ⅰ型。
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讨论
目前在排除甲型至戊型病毒性肝炎及已知的其它致病因素以外，仍有部分肝炎患者病因未明。1995年美国学者报道发现庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)，目前对于HGV的致病性仍在深入研究中，HGV多为重叠其它肝炎病毒同时存在为主，单独HGV感染者较少，最近的研究大多表明HGV感染可导致轻型肝炎，HGV似乎仍不是非甲-非戊型肝炎的主要病原。1997年日本学者发现了TTV，研究表明TTV是一种单链DNA病毒，与转氨酶异常关系密切，可能与输血传播有关。继国内学者报道中国人群中存在TTV感染后，本单位也克隆出南京地区TTV的部分基因，序列测定及分析表明该序列与日本TTV部分基因及TTV中国株1相对应位置的核苷酸序列有很高的同源性，分别达到97.65%和98.99%，这说明中国南京地区也存在TTV感染。
本文结果还表明，TTV较广泛地存在于病因未明肝炎患者血清中，14例患者血清中有8例TTV DNA阳性，其中临床诊断为慢性肝炎4例，肝硬变(代偿期)2例，慢性重型肝炎2例；3例慢性肝炎经病理确诊，各有1例临床诊断为慢性重型肝炎和肝硬变者病理诊断为慢性肝炎(G3，S2―3)和慢性肝炎(G2，S1)，TTV感染可导致轻重不一的肝组织学损伤并引起不同程度的临床表现。日本学者报道TTV感染与输血有关，本文8例TTV感染者中除1例有明确输血史外，其余7例均无明确的输注血制品及手术史，提示TTV感染可能还存在其它感染途径。
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参考文献
[1] Nishizawa T，et al.Biochem Biophys Res Commum
1997；24(1)：92.
[2] Okamoto H，et al.Hepatology Res 1998；10：1.
[3] 周育森，等.军事医学科学院院刊 1998；22(2)：81.
[4] 病毒性肝炎防治方案(试行).中华传染病杂志 1995；13：241.
(1998年12月11日收稿 1999年3月16日修回), http://www.100md.com
单位：南京军区第八一医院肝病研究所 邮政编码：210002；周育森：解放军军事医学科学院五所
关键词：输血传播病毒 聚合酶链反应 核苷酸序列
江苏医药991202 摘要 目的：了解中国南京地区有无输血传播病毒(TTV)感染。方法：用套式聚合酶链反应(PCR)检测病因未明肝炎患者血清中TTV DNA，并对PCR扩增产物进行序列测定。结果：14例非甲-非戊型肝炎患者血清中共检出8例TTV DNA阳性者，对其中一株进行序列测定，该序列与日本TTV部分基因(CLON22)和TTV中国株1相对应位置的核苷酸同源性很高，分别达97.65%和98.99%。结论：中国南京地区肝炎患者存在TTV感染。
Cloning and Sequencing of Partial Genes of TTV in Nanjing
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Yang Zhiguo et al
Department of Infectious Disease，The 81th Hospital of PLA，Nanjing
Abstract Objective：To investigate the presence of TTV infection in Nanjing district.Methods：Serum samples from patients with hepatitis were detected for TTV DNA by PCR technique and the PCR products were sequenced.Results：TTV DNA was found in 8 of 14 cases suffering from non-A～E hepatitis.The partial genes were cloned and sequenced from the serum of one patient.The partial sequence of TTV from Nanjing showed 97.65% and 98.99% nucleotide identity with corresponding region of TTV isolated in Japan and in other parts of China.Conclusion：There are hepatitis patients infected by TTV in Nanjing.
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Key words TT virus Polymerase chain reaction DNA sequencing
1997年12月日本学者Nishizawa等[1，2]在输血后肝炎患者血清中发现了一种新的DNA病毒，暂名为输血传播病毒(Transfusion Transmitted Virus，TTV)，认为其与输血传播有关。我国学者[3]也于翌年3月证明中国人群中存在TTV感染。最近本单位也在军事医学科学院五所的协助下建立了TTV DNA的PCR检测方法，并对其中1例慢性肝炎患者血清中克隆出的TTV部分基因作了序列测定，现报告如下。
资料与方法
一、标本来源 14例患者均系南京第八一医院住院患者，其中男11例，女3例；临床诊断为急性肝炎2例，慢性肝炎8例，慢性重型肝炎2例，肝硬变(代偿期)2例，其中5例病理确诊为慢性肝炎。诊断标准参照文献[4]。
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二、试剂来源 抗HAV-IgM ELISA试剂购自南京军区军事医学研究所；HBVM、抗HCV-IgG ELISA试剂以及实验所需酶和dNTPs购自华美生物工程公司；HGV RNA(RT-PCR)试剂由军事医学科学院五所提供；克隆用T载体、XL1-Blue菌和M13噬菌体购自美国Invitrogen公司；序列分析采用CLUSTAWL及BLAST程序软件进行分析。
三、TTV DNA检测方法 先用STG法提取血清TTV DNA(STG试剂盒购于美国Biotronic公司)：取50μl血清加62.5μlSTG缓冲液，混匀后100℃变性5min，13000rpm离心10min后挑除变性蛋白，加90μl异丙醇沉淀，13000rpm离心10min，吸净残留液滴后65℃干燥10min，再用10μl无菌水溶解。参考日本株TTV基因ORF1区序列设计两对引物，序列为P1：5′-CACC AG GA GC AT AC AT AGA-3′，P2：5′-TCTT CT TG CT GG TG AA AG C-3′，P3：5′-AGC AG AG GA GA AG GC AA CATG T-3′，P4：5′-CT/CT TA CT AC TA CT AC CT CC TG GC AT-3′。其中P1/P2为外引物，P3/P4为内引物。第一轮反应条件：参见文献[3]；第二轮PCR反应条件：取第一轮PCR产物2μl作为模板，10X Tag酶buffer 3μl，dNTPs0.8μmol/L，P3/P40.1μmol/L，30μl反应体积，94℃180sec预变性后，94℃40ses、55℃40ses、72℃40ses循环30次。取第二轮PCR产物10μl用2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察结果，与阳性对照在同一水平出现条带者判为阳性。每次PCR扩增均设阳性及阴性对照，扩增产物长度约298bp。
, 百拇医药
四、TTV DNA PCR扩增产物的克隆测序 从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，纯化后与T载体连接，转化XL1-Blue宿主菌，挑取白色菌落用PCR鉴定，从阳性菌落中提取质粒DNA，经EcoRI和HindⅢ双酶切后克隆至M13mp18和M13mp19中，制备单链模板，用ABI373型自动测序仪进行测序。
五、对DNA序列采用CLUSTAWL及BLAST程序软件进行分析。
结果
14例血清HGV RNA阴性的非甲-非戊型肝炎患者血清中共检出8例TTV DNA阳性，将其中一株命名为TTV中国南京株，将其扩增产物纯化回收，克隆后进行序列分析，结果该序列与日本TTV部分基因(CLON22)及TTV中国株1(TTVCH1)相对应位置的核苷酸同源性分别为97.65%和98.99%，与已知的肝炎病毒(A型至G型)没有明显的相关性，而只同日本株及中国株1(TTVCH1)有很高的同源性，属4亚型中的Ⅰ型。
, http://www.100md.com
讨论
目前在排除甲型至戊型病毒性肝炎及已知的其它致病因素以外，仍有部分肝炎患者病因未明。1995年美国学者报道发现庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)，目前对于HGV的致病性仍在深入研究中，HGV多为重叠其它肝炎病毒同时存在为主，单独HGV感染者较少，最近的研究大多表明HGV感染可导致轻型肝炎，HGV似乎仍不是非甲-非戊型肝炎的主要病原。1997年日本学者发现了TTV，研究表明TTV是一种单链DNA病毒，与转氨酶异常关系密切，可能与输血传播有关。继国内学者报道中国人群中存在TTV感染后，本单位也克隆出南京地区TTV的部分基因，序列测定及分析表明该序列与日本TTV部分基因及TTV中国株1相对应位置的核苷酸序列有很高的同源性，分别达到97.65%和98.99%，这说明中国南京地区也存在TTV感染。
本文结果还表明，TTV较广泛地存在于病因未明肝炎患者血清中，14例患者血清中有8例TTV DNA阳性，其中临床诊断为慢性肝炎4例，肝硬变(代偿期)2例，慢性重型肝炎2例；3例慢性肝炎经病理确诊，各有1例临床诊断为慢性重型肝炎和肝硬变者病理诊断为慢性肝炎(G3，S2―3)和慢性肝炎(G2，S1)，TTV感染可导致轻重不一的肝组织学损伤并引起不同程度的临床表现。日本学者报道TTV感染与输血有关，本文8例TTV感染者中除1例有明确输血史外，其余7例均无明确的输注血制品及手术史，提示TTV感染可能还存在其它感染途径。
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参考文献
[1] Nishizawa T，et al.Biochem Biophys Res Commum
1997；24(1)：92.
[2] Okamoto H，et al.Hepatology Res 1998；10：1.
[3] 周育森，等.军事医学科学院院刊 1998；22(2)：81.
[4] 病毒性肝炎防治方案(试行).中华传染病杂志 1995；13：241.
(1998年12月11日收稿 1999年3月16日修回), http://www.100md.com